PLoS ONE: Enzym-Free påvisning af mutationer i Cancer DNA Brug Syntetisk oligonukleotidprober og fluorescens Microscopy

Abstrakt

Baggrund

Rapid pålidelige diagnostik af DNA mutationer er meget ønskeligt i forskning og kliniske analyser . Aktuel udvikling på dette område går samtidigt i to retninger: 1) high-throughput metoder, og 2) bærbare assays. Ikke-enzymatiske approaches er attraktive for begge typer af metoder, da de ville tillade hurtig og relativt billig påvisning af nukleinsyrer. Moderne fluorescens mikroskopi er at have en enorm indflydelse på detektion af biomolekyler på tidligere uopnåelige opløsning. Men for at ingen enkle metoder til påvisning af DNA i en ikke-enzymatisk måde ved hjælp af fluorescensmikroskopi og nukleinsyreanaloger er hidtil blevet foreslået.

metoder og resultater

Her rapporterer vi en hidtil ukendt enzym-fri tilgang til effektivt at opdage kræft mutationer. Dette assay omfatter genspecifik target berigelse efterfulgt af annealing til oligonukleotider indeholdende låste nukleinsyrer (LNA’er) og til sidst detektion ved fluorescensmikroskopi. LNA indeholdende prober vise høj bindingsaffinitet og specificitet til DNA indeholdende mutationer, som giver mulighed for detektion af mutation overflod med en interkalerende EvaGreen farvestof. Vi anvendte en anden probe, hvilket øger det samlede antal basepar for at frembringe en højere fluorescenssignal ved at inkorporere flere farvestofmolekyler. Faktisk viser vi her, at bruge EvaGreen farvestof og LNA sonder, genomisk DNA, der indeholder

BRAF

V600E mutation kunne detekteres ved fluorescens mikroskopi ved lave femtomolær koncentrationer. Især dette var mindst 1000 gange over det potentielle detektionsgrænse.

Konklusion

Samlet set romanen analysen beskriver vi kunne blive en ny tilgang til hurtige, pålidelige og enzym-fri diagnostik af cancer eller andre associerede DNA-mål. Vigtigere, er støkiometrien af ​​vildtype og mutant mål konserveret i vores assay, som muliggør en nøjagtig vurdering af mutant overflod når kravet detektionsgrænsen er opfyldt. Ved hjælp af fluorescens mikroskopi, denne tilgang giver mulighed for at opdage DNA ved single-molekyle opløsning og direkte i den biologiske valgte prøve

Henvisning:. Miotke L, Maity A, Ji H, Brewer J, Astakhova K (2015 ) Enzyme-Free påvisning af mutationer i Cancer DNA under anvendelse af syntetiske oligonukleotidprober og fluorescensmikroskopi. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10,1371 /journal.pone.0136720

Redaktør: Thomas Abraham, Pennsylvania State Hershey College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 19 Maj 2015; Accepteret: August 7, 2015; Udgivet: 27 August, 2015

Copyright: © 2015 Miotke et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Funding:. Augustinus Fonden (. Grant nr 95 305 73.949, https://www.augustinusfonden.dk/) er anerkendt til finansiering AM og KA (reagenser for LNA sonde syntese og fluorescensmikroskopi, assay udvikling og dataanalyse). Forfatterne også erkende, at HJ og LM blev støttet af en Research Scholar Grant, RSG-13-297-01-TBG fra American Cancer Society (https://www.cancer.org/). HJ modtaget yderligere støtte fra Doris Duke Clinical Foundation Klinisk Scientist Development Award (https://www.ddcf.org/programs/medical-research/goals-and-strategies/build-the-clinical-research-career-ladder/clinical-scientist-development-award/) og en Howard Hughes Medical Institute Early Career Grant (https://www.hhmi.org/). Forfatterne anerkender også støtte fra National Institutes of Health P01 HG000205 (HJ, https://www.nih.gov/~~number=plural). Tilskuddene fra American Cancer Society og National Institutes of Health støttet design af sonderne, genomisk præ-berigelse, kræft cellelinje arbejde og dataanalyse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Single-nukleotid polymorfier (SNPs) og varianter (SNVs) er den vigtigste kilde til genetisk variation i humane genom og andre arter [1]. Derfor pålidelig detektering af SNP’er og SNVs er en vigtig klinisk og translationel forskning værktøj. Nogle af de mange anvendelser omfatter lægemiddel-resistens analyse i virusgenomer og cancer associeret somatisk DNA forandringer [2]. En human cancer gen i særdeleshed

BRAF

eller v-Raf musesarcoma viral onkogen homolog B, koder for proteinet B-Raf [3]. Mere formelt kendt som serin /threonin-proteinkinase B-Raf, dette protein påvirker intracellulær signalering og er involveret i dirigere cellevækst [3]. Mutationer i

BRAF

har været impliceret i visse humane cancere, især melanom [4]. I øvrigt har flere lægemidler blevet udviklet, som behandler kræft drevet af

BRAF

, hvoraf to, vemurafenib og dabrafenib, nu FDA godkendt til behandling af sen-fase melanom [5,6]. Nuværende metoder til påvisning af mutationer i

BRAF

emner biopsiprøver til PCR og /eller sekventering. En mindre invasiv fremgangsmåde detekterer

BRAF

mutationer direkte i cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) opnået ved patientens plasma [7]. Men da ctDNA er til stede i meget lave koncentrationer (100-300 molekyler pr 100 pi analyt), yderst følsom og specifik påvisning teknikker har skal anvendes [8].

Generelt udvikling inden for SNP /SNV diagnostik går samtidigt i to retninger: 1) high-throughput metoder, og 2) bærbare, nem at håndtere assays [8,9]. High-throughput sekventering og polymerase-kædereaktion (PCR) er nuværende metoder til valg til forskning i kræft og infektionssygdomme i udviklede lande [9]. Mere tilgængelige teknik til hurtige point-of-care diagnostik i fravær af sekventering og PCR er tiltalende. Desuden er alle højt gennemløb teknikker udviklet til dato anvender enzymer for at opnå den ønskede følsomhed og specificitet for påvisning [9]. Enzymer øger risikoen for fejl under analysen og påvirker støkiometri af det målrettede mutation i forhold til vildtype-analog [10]. Således ville alle metoder af nukleinsyrer påvisning og kvantificering nyde godt af alternative enzymfri strategier [9,10].

En ideel, nem at håndtere diagnostiske for SNP /SNV er en simpel robust assay med minimal trin, høj følsomhed og repeterbarhed ved lave omkostninger [9]. Med disse mål for øje, en fast støtte eller i opløsning system ved hjælp af optiske og elektrokemiske metoder er ideel [11]. Fluorescens er en bekvem optisk detektion metode, som er bredt anvendt i både moderne diagnostiske analyser state-of-the-art og bærbare [9]. Især er den seneste udvikling i fluorescerende mikroskopi have en enorm indflydelse på detektion af biomolekyler

in vitro

og

in vivo

[12,13]. Mikroskop teknikker har gjort tidligere uopnåelige enkelt molekyle detektion rådighed. Dette giver mulighed for at undgå enzymer, når der detekteres biomolekyler

in vitro

og en chance for at overvåge mål

in vivo

[9-13].

For at opdage SNP /SNVs på meget lave koncentrationer, meget specifikke og følsomme sonder skal anvendes. En fremgangsmåde er at placere låste nukleinsyrer (LNA’er) med direkte knyttet fluoroforer til korte oligonukleotider [14]. Disse typer af LNA /DNA indfangningsprober i øjeblikket anvendes enzymatisk genotypebestemmelse af SNP’er i et mikroarrayformat og PCR-baserede teknikker [15]. For nylig introducerede vi fluorescensmærket LNA derivater som et lovende redskab i avanceret genotypning, for eksempel narkotika-resistens test af yderst polymorfe HIV-1-protease [16]. Imidlertid syntese af fluorescerende mærkede prober er dyrere og arbejdskrævende end nødvendigt for point-of-care-applikationer. En mere enkel probe design kunne anvende højeffektive hybridiseringsegenskaber af LNA /DNA-oligonukleotider i forbindelse med en robust, fluorescerende interkalerende farvestof, såsom EvaGreen. I det sidste tiår interkalerende farvestoffer er blevet anvendt med succes i enzymatiske teknikker på nukleinsyredetektion [2-5]. I dette papir valgte vi EvaGreen farvestof på grund af den påviste kontrast mellem lyse signal den afgiver når det er bundet til dobbeltstrenget DNA og standset fluorescenssignal med enkeltstrengede prøver [17].

Heri beskriver vi en ny analyse for hurtig enzymfri detektering af

BRAF

V600E mutation (T → a ved gen position 1799) i human DNA (figur 1). Vi oprindeligt berige mål-DNA’et under anvendelse af en genspecifik 120mer berigelse probe, efterfulgt af fluorescerende påvisning med EvaGreen farvestof og et andet mutation specifik, kortere LNA /DNA capture probe. Ved at anvende seriefortyndinger af mutant /vild-type cellelinje-DNA-blandinger, viser vi, at denne hidtil ukendte assay er meget potent for det fluorescerende føling af en klinisk relevant SNP ved lave koncentrationer og høje prøve kompleksitet. Desuden dokumenterer vi, at ved at anvende fluorescensmikroskopi kan vi specifikt at påvise lave femtomolær og attomolar koncentrationer af DNA indeholdende Målmutationen

De vigtigste trin i LNA /DNA-assay:. 1) binding til genspecifik opfangningsprobe, 2) vask og spaltning fra støtte, 3) tilsætning signal-styrke LNA /DNA-probe og interkalerende farvestof, 4) fluorescens detektion. B = biotin, S = streptavidin, CPG = kontrolleret pore glas, L = LNA.

Materialer og metoder

Generelt

Reagenser opnået fra kommercielle leverandører blev anvendt som anvist. LNA phosphoramiditreagenser og EvaGreen farvestof (20X i vand) blev opnået fra Exiqon og Biotium hhv. Umodificerede og biotinylerede DNA-strenge blev købt fra IDT og anvendes efter HPLC rensning.

Detaljer om oligonucleotidsyntese, karakterisering og termiske denaturering studier er givet i S1 Appendiks.

Genomisk DNA

Genomisk DNA fra cellelinier LS411N og HT29 blev opnået direkte fra leverandør (ATCC, katalog nr. CRL-2159 og HTB-38, henholdsvis) og ekstraheret ved hjælp af Qiagen DNeasy vævskultur udsugning pr producentens retningslinjer (Qiagen). HMC-1 (human mandlig kontrol) blev opnået fra Promega [18]. Produktet blev spaltet i 12 timer ved 37 ° C under anvendelse af EcoRI (New England Biolabs), og udfældet fra ethanol. Længde af fragmenter blev målt ved hjælp af Agilent Bioanalyzer DNA 7500 kit giver en værdi på ca.. 7000 bp.

Pre-berigelse af

BRAF

genfragmentet.

Pre-berigelse af genomisk DNA blev udført ved hjælp af xGen Lockdown kit (IDT), 120mer

BRAF

-specifik probe mærket med biotin (IDT), og streptavidin-coatede magnetiske perler (Dynabeads-M270, LifeTechnologies). Den 120mer sonde er designet til at overlappe den

BRAF

V600E region (position V600E mutation er underlined):

5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAA

AATCACCTATTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGG-(biotin-C6)-3’

Pre-digested genomisk DNA og biotinyleret 120mer probe blev inkuberet i 5 timer ved 60 ° C efterfulgt af binding til magnetiske kugler, flere vasketrin og udsendelsen varme som foreslået af leverandøren (IDT, opvarmning til 92 ° C i 10 minutter) Som resultat. , enkeltstrenget DNA blev opnået.

Solid-support-hybridiseringsassay.

DNA-koncentrationen blev beregnet ved hjælp af molekylvægten og Life Technologies DNA kopi nummer regnemaskine tilgængelig på deres hjemmeside. således 50 fM af ss DNA-fragmenter (længde 5000 nt) svarede til 3×10

6 molekyler pr 100 pi, eller 1×10

6 molekyler af det samme DNA fragment i 100 pi af prøven svarede til fusionen 16.6 fM. Solid bærer indeholdende svarende capture probe og mål-DNA (1 ækv.) blev anbragt i 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende 100 pi 1X PBS-buffer. Den resulterende blanding blev opvarmet i 10 minutter ved 85 ° C og afkøles efterfølgende til stuetemperatur i løbet af 20 min. støtten blev centrifugeret ved 11.000 rpm i 10 min, og efter fjernelse af supernatanten blev vasket 2 gange med 100 pi 1X PBS ved 37 ° C. Bagefter EvaGreen farvestof (0.06-0.6X) og det tilsvarende signal-forøgende sonde (4 ækv.) Blev hybridiseret til understøtningen (100 pi 1X PBS, 85 ° C, 10 minutter efterfulgt af afkøling til stuetemperatur i løbet af 20 min). Fluorescenssignal blev indledningsvist analyseret ved anvendelse af standard laboratorie UV-vis lampe. Til analyse i opløsning og mikroskopi blev oligonukleotiderne spaltet fra støtte anvendelse af 32% vandig ammoniak og methylamin 1: 1 (v /v) i 4 timer ved stuetemperatur, inddampet og re-annealet i nærvær af EvaGreen farvestof som beskrevet ovenfor (0.06- 0,6x).

fluorometri

DNA beløb (koncentrationer og antal molekyler) blev bestemt ved anvendelse af standard UV-spektrofotometri og Life Technologies DNA kopiantal regnemaskine tilgængelige som beskrevet ovenfor. For annealing, blev prober opvarmet i 10 minutter ved 85 ° C og afkøles efterfølgende til stuetemperatur i løbet af 20 min. Fluorometri undersøgelser af de resulterende prøver blev udført ved 19 ° C i 1X PBS ved hjælp PerkinElmer LS 55 luminescens spektrometer forsynet med en Peltier Temperatur Programmør, excitation ved 500 nm og optage emission ved 530 nm.

Fluorescens mikroskopi

De multifotonexcitation fluorescens mikroskopi målinger blev gennemført på en specialbygget multifotonexcitation mikroskop [19]. Kort fortalt målet anvendte var en nedsænkning 60X vand målsætning NA 1.29. Laseren var en Ti: Sa laser (HPeMaiTai DeepSee, Spectra Physics, Mountain View, CA) og excitation bølgelængde anvendte var 840 nm. Fluorescenssignalerne blev indsamlet ved hjælp båndpasfiltre Bandpass 525/35 nm (AHF Analysentechnik AG, Tyskland). Detektorerne var Hamamatsu H7422P-40 PMT’er.

Resultater og Diskussion

I første omgang vi designet capture prober af forskellig længde (9, 11 og 18mer), der indeholder tre LNAs i centrale positioner inden for de sekvenser ( tabel 1). Ifølge vores design, en af ​​LNA-enheder var komplementære til den potentielle

BRAF

V600E mutation (T → A) i målet [16]. Vi undersøgte individuelt på hvert opfangningsprobe CP1-CP3 til hybridisering til målområdet i forhold til hele 3 milliarder bp humane genom under anvendelse i hus software til rådighed på Stanford University (S1 Table) [20]. Således 9mer og 11mer prober havde flere bindingssteder i genomet, hvilket giver nul, en eller flere fejlparringer, hvorimod 18mer prober (CP3) var fuldstændigt specifikt til målet. Som en negativ kontrol, vi brugte en ækvivalent 9mer DNA-sekvens anvendes i vores tidligere analyser, der ikke var gratis til

BRAF

mål (capture sonde CP4) [14].

Næste , CP1-CP4 blev fremstillet ved anvendelse automatiseret fast-fase-oligonucleotidsyntese på kontrolleret poreglas (CPG, tabel 1). CP1-CP3 blev syntetiseret som både vildtype (w) og mutant (m) varianter til

BRAF

1790-1800 region (dvs. indeholdende nukleotider A og T i stilling overfor bunden 1799 henholdsvis). Capture sonder blev enten løsrevet fra CPG eller holdes på fast støtte efter syntesen (Støtte information). Dette tillod os at udføre analysen både i opløsning og på fast underlag som beskrevet nedenfor.

Vi analyserede bindingsaffiniteter CP1-CP3 til fuldt ud komplementær og uoverensstemmende 63 nt BRAF fragmenter i opløsning (

T

M værdier, tabel 1). Som forventet internt placerede LNAs øgede smeltetemperaturer for alle proberne ved 3,0-4,5 ° C pr én LNA inkorporering. Samtidig målspecificitet blev forøget, fordi Tm faldt med 10,0-11,0 ° C i nærvær af en uoverensstemmelse. Ingen duplexer blev dannet ved temperaturer over 22 ° C for 9mer indfangningsprober CP1W, m. Dette antyder, at CP1W, m sonder har det største potentiale til at skelne en uoverensstemmende vs. fuldt matchede mål. dette vil imidlertid være ledsaget af en mangel på specificitet i det humane genom som foreslået af vores sonde unikhed analyse (Hjælpeoplysninger). Til gengæld viste 18mer indfangningsprober høj

T

M værdier for både fuldt parrede og fejlparrede duplekser og 11mer CP2w og CP2m havde noget mellemliggende værdier (33,5 ° C-34,5 ° C i nærvær af et mismatch). Endelig negativ kontrol CP4 viste ingen binding til målsekvenser.

have studeret hybridiseringsegenskaber af LNA /DNA indfangningsprober, vi anvendt dem til påvisning af

BRAF

V600E mutation i humant genomisk DNA (fig 2 og 3, tabel 2). Vi bestemt, ved hjælp af digital PCR (data ikke vist), at de menneskelige cellelinier HT29 og LS411N havde en 25,0% og 66,7% overflod af målet mutationen henholdsvis [18]. HMC-1-DNA blev anvendt som en vildtype kontrol 100%, da ikke havde noget mutation. Først, vi pre-beriget DNA’et under anvendelse af en 120mer

BRAF

specifik probe er mærket med streptavidin, der ikke overlapper området af indfangningsproben og således blev universel for både WT og mut mål (figur 1 og materialer og Metoder;). Dette trin forøget koncentration af målgenomet fragment og samtidig forbedret specificitet i vort assay på samme måde, som når der påføres inden næste generation sekventering [7-8]. Efter flere vasketrin og løsrivelse fra de biotinylerede magnetiske perler, enkeltstrenget

BRAF

fragmenter (7000 nt) blev genvundet i løsningen.

Target bindende specificitet resultater fra forskellen i smeltetemperatur (

T

m) mellem fuldt matchede og forkerte indfangningsprobe: target komplekser. CPG = kontrolleret pore glas

(A) Visualisering af

BRAF

V600E mutation på fast-support indeholder indfangningsprobe CP2m:. CP2m: HT29 (02:05, rør 1), CP2m : LS411N (2,5 pM rør 6). Signal er opnået under laboratorie UV-vis lampe (excitation ved 365 nm) ved 19 ° C ved hjælp 22:00 signal styrke sonde og 0,6x EvaGreen farvestof. (B) Kvantificering af genomisk

BRAF

mål ved fluorometri i opløsning. Target titreringskurver blev opnået for fuldt komplementære og forkerte komplekser (blå og røde linjer, henholdsvis) af LNA /DNA indfangningsprober CP2w og CP2m med tilsvarende mål og signal-styrke sonde P1: 5′-GCT A + GA CCA + AAA TCA FTT A + TT TTT ACT GTG AG + G TCT TCA TGA AGA + AAT AT-3 ‘. LNA nukleotider er markeret med plus før det tilsvarende bogstav.

Bagefter pre-beriget

BRAF

mål blev udglødet til indfangningsprober CP1-CP4 direkte på fast støtte [ ,,,0],11]. Vi derefter brugt EvaGreen at påvise og bestemme den dobbeltstrengede DNA. EvaGreen signal stiger proportionalt med antallet af basepar i den dannede duplex [17]. Det er sagt, indfangningsproben: target-komplekset var temmelig kort (9-18 basepar). For at undgå et svagt signal påført vi en yderligere LNA /DNA-signal-styrke probe komplementær til sekvensen lige ved siden af ​​indfangningsproben (P1, 50 nt). Denne sonde viste ingen selvstændige folde egenskaber og bandt både vildtype og mutant mål universelt (fig 2 og S1 Appendiks). Længere signal-styrke probe ville resultere i endnu større signal stigning på target binding. Imidlertid LNA /DNA-prober med en længde 50 nt er udfordrende at syntetisere og rense. Desuden er deres target-bindende egenskaber er at være yderligere evalueres for at undgå falske positive signal på grund af f.eks selv-foldning (papir som forberedelse)

Desuden vil der med solid-support system, vi var i stand til at drage fordel af den

T

m forskel mellem fuldt matchet og uoverensstemmende mål.: probepar (tabel 1). En simpel vask skridt på

T

m af uoverensstemmende kompleks tilladt os at fjerne binding af uoverensstemmende sekvens. Endelig blev prøven igen annealet i nærvær af signal-styrke probe P1 og EvaGreen farvestof (fig 1 og 2)

Den faste bærer indeholdende cancer DNA:. Probe-komplekset blev visualiseret under anvendelse af et standard laboratorie UV-lampe (figur 3 og S2 tabel). Når mutant-specifikke opfangningsprobe blev påført, kan tilstedeværelsen af ​​den mutante mål klart påvises med det blotte øje. For yderligere kvantificering blev prøven løsrevet fra CPG, re-annealet og underkastet analyse ved fluorometri (figur 3). Vi estimerede koncentrationerne af vildtype og mutant mål i cancer DNA ved anvendelse af en titreringskurve. Dette blev genereret med en fluorometriassay i opløsning under anvendelse af en kendt oprindelige mængde af genomisk DNA i analyt (i mol og antallet af molekyler), og de samme koncentrationer af reagenser som i den eksperimentelle assay (se Materialer og fremgangsmåder). Detektionsgrænse (LOD) er beregnet som den laveste målkoncentration der kunne påvises med et signal til støj-forhold over 3 [14]. Således har vi etableret LOD værdi på 50 fM genomisk DNA ved hjælp af konventionel fluorometri (Tabel 2, se Materialer og metoder for at få oplysninger om beregning).

Når man sammenligner resultater mellem indfangningsprober CP1-CP3 viste 11mer CP2 den højeste diskrimination af forkerte mål samtidig bevare god bindingsspecificitet (figur 3). I modsætning hertil viste de længere CP3 prober lignende signal til fuldt parrede og fejlparrede komplekser, da duplex stadig blev dannet ved temperaturen af ​​assayet (tabel 1 og S1 Fig). Brug CP2m, vi opnåede også stor nøjagtighed for den overflod kvantificering af cellelinje LS411N (67,2% -67,7% bestemt ved vores analyse vs. 66,7% bestemt ved digital PCR). Imidlertid blev lavere mutant overflod i HT29 DNA påvist med vores assay på et højere fejlniveau sammenlignet med LS411N (afvigelse af ~ 8% vs. ≤ 1%, henholdsvis). Mest sandsynligt, var dette skyldes emission signal af den mutante mål i HT29 er under vores pålidelig LOD.

Specificiteten af ​​påvisningen blev bekræftet ved fraværet af fluorescenssignalet ved brug CP2m og vildtype kontrol-DNA, HMC-1 (tabel 2). Især før berigelse skridt dramatisk forøget koncentrationen af ​​

BRAF

fragment i prøven. Dette blev bekræftet ved op til 10-gange forhøjet ikke-specifikt signal ved detektering af ikke-beriget HMC-1-DNA med CP2m probe (data ikke vist). Derfor konkluderede vi, at både den præ-berigelsestrin og udformningen af ​​mutationen sonden været nødvendige for assayet. Vi skønnede nøjagtighed rettet mod en specifik

BRAF

region til at være inden for ± 1%. I betragtning af den store sekvens kompleksitet humant genomisk DNA, konkluderede vi, at nøjagtigheden af ​​vores

BRAF

gene targeting hjælp LNA /DNA-prober var meget god [10,21].

Som sidste aspekt, underkastede vi en serie af meget fortyndede HT29 muterede DNA-molekyler til detektion ved fluorescensmikroskopi (fig 4). Før analyse vi pre-beriget mål-DNA’et, annealet det til CP2m på en fast bærer (CPG) og bagefter spaltes det fra CPG som beskrevet ovenfor. Med denne metode komplekset af

BRAF

mål, CP2m, P1 og EvaGreen farvestof kunne let detekteres ved ~ 1,5 fM koncentration af mutant DNA svarende til ~ 1 × 10

5 molekyler per 100 pi analyt (for detaljer om beregningen, se Materialer og fremgangsmåder). DNA: EvaGreen kompleks blev set at danne små aggregater på dækglasset overflade på ca.. 1 um i diameter. I fravær af P1, fluorescenssignalet var fire gange lysdæmper og blev ikke observeret nogen fluorescens for EvaGreen farvestof kontrol (figur 4 og S2 Fig). Desuden blev intet signal, ved anvendelse af 100% vildtype kontrol-DNA HMC-1 i den samme indstilling. Så vidt vi ved, er disse LOD værdier er kun blevet rapporteret tidligere til PCR-baserede assays, men ikke nogen forstærkning-fri metoder. Desuden kunne den observerede signal detekteres ved 1000-gange lavere koncentrationer af DNA end selv 1,5 fM svarende til kun 100 molekyler pr 100 pi analyt. Vi spekulere, at ved at anvende denne teknik, og forøge længden af ​​signalet-styrke probe som nævnt ovenfor, kunne LOD værdi for cancer DNA være langt under 1 am.

(A) Kompleks af DNA med CP2m, signal -forstærkede sonde P1 og EvaGreen farvestof, er lyse prikker med intensiteter over 80 set. (B) Target DNA re-annealet med CP2m og EvaGreen farvestof i fravær af P1, er mørkere punkter set med tællinger op til ca. 20. (C) EvaGreen farvestof i 1xx PBS (0.06X opløsning), er noget signal set. Billeder blev opnået ved anvendelse af to foton laser scanning mikroskop (ex 535 + 35 nm; laser @ 840); ved 19 ° C ved anvendelse af 1,5 fM kræft DNA og re-annealing med 22:00 signal-styrke sonde og 0.06X EvaGreen farvestof. Billederne blev taget med de samme instrumentindstillinger og justeres ved hjælp af den samme tærskel intensitet. Grafen nedenfor billederne viser en linje plot af linjen i billedet.

Sammenligning vores metode til tidligere rapporterede genotypebestemmelsesmetoder til

BRAF

mutation og andre sekvens variationer, den udviklede assay er fordelagtigt lav i omkostninger, tid (12 timer versus op til 1 uge) og robusthed [9,14]. Vigtigere, ingen enzymer, foruden restriktionsenzymer for fragmentering genomiske DNA er der behov til påvisning af mål-mutationen [22-24]. Dette forhindrer fejl, som ofte forekommer med PCR eller tilpasning af sekventeringsdata [3,11]. Støkiometrien af ​​vildtype og mutant mål er også konserveret i vores assay, som muliggør en nøjagtig vurdering af mutant overflod, eftersom grænsen for kravet måldetektion opfyldes. I tidligere rapporterede analyser dette kan opnås ved hjælp af guld nanopartikler, DNAzymer eller elektrisk detektion [25-27]. I dette arbejde forbedrer vi over følsomheden af ​​mål-detektion ved anvendelse af signal-styrke prober og laser mikroskopi, hvilket giver mulighed for at detektere sekvensvariationer i mål-DNA ved lave koncentrationer direkte i humant serum [28].

resumé beskriver vi en hidtil ukendt assay som muliggør hurtig analyse af kræft mutationer. For at opnå nødvendige specificitet og følsomhed måldetektering, analysen kombinerer flere principper: 1) målrette pre-berigelse ved hjælp af en lang, gen-specifik probe (120mer); 2) høj bindingsaffinitet og specificitet af korte LNA prober, og 3) DNA-detektion ved høj opløsning fluorescensmikroskopi. Som vi bevise i dette arbejde, at kombinationen af ​​disse teknikker muliggør hurtig analyse af mutationer i cancer-DNA uden behov for amplifikation eller andre enzymatiske reaktioner. Succesfuld demonstreret som et proof-of-principle på V600E mutation i

BRAF

onkogen, kan anvendes denne metode til at påvise andre mutationer af klinisk betydning (f.eks codon 12 og 13 i

KRAS

gen [29]) og tjener som en enkel, pålidelig metode til forskning, prognostiske eller terapi overvågning af kliniske prøver.

Støtte Information

S1 Appendiks. Oligonucleotidsyntese, karakterisering og termiske denaturering studier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s001

(DOCX)

S1 Fig. . Visualisering af kræft DNA på fast-support indeholder indfangningsprobe CP3m

(venstre mod højre) rør 1-3: CP3m: HT29 (10,0, 5,0 og 2:05), rør 3-6: CP3m: LS411N (10,0, 5,0 og 2,5 pm). Signal er opnået under laboratorie UV-vis lampe (excitation ved 365 nm), ved 19 ° C ved hjælp 22:00 signal styrke sonde og 0,6x EvaGreen farvestof

doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s002

(TIF)

S2 fig. Fluorescens billeder af

BRAF

DNA-fragmenter fra cellelinie HT29. Hotel (A) Kompleks af DNA med CP2m, signal-styrke sonde P1 og EvaGreen farvestof, lyse prikker med intensiteter over 80 ses. (B) Target DNA re-annealet med CP2m og EvaGreen farvestof i fravær af P1, er mørkere punkter set med tællinger op til ca. 20. (C) EvaGreen farvestof i 1X PBS (0.06X opløsning), er noget signal set. (D) Vild type kontrol-DNA HMC-1, er der ikke signal ses

doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s003

(TIF)

S1 Table. Entydighed analyse af opsamling og signal-styrke sonder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s004

(PDF)

S2 tabel. Kolorimetrisk analyse af model mål og genomisk DNA på fast støtte

doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s005

(PDF)