PLoS ONE: Tissue MikroRNA’er som Prædiktorer af Outcome i patienter med metastatisk kolorektal cancer behandlet med første linje Capecitabine og Oxaliplatin med eller uden Bevacizumab

Abstrakt

Formål

Vi testede den hypotese, at ekspressionen af microRNA (miRNA) i kræftvæv kan forudsige effektiviteten af ​​bevacizumab tilføjet til capecitabin og oxaliplatin (CAPEOX) hos patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC).

Eksperimentel Design

patienter med mCRC behandlet med første line CAPEOX og bevacizumab (CAPEOXBEV): screening (n = 212) og validering (n = 121) kohorter, eller CAPEOX alene: kontrol kohorte (n = 127), blev identificeret retrospektivt og arkivering primær tumor prøver blev indsamlet. Ekspression af 754 miRNA blev analyseret i screeningen kohorten anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) arrays og ekspressionsniveauer var relateret til tid til sygdomsprogression (TTP) og samlet overlevelse (OS). Væsentlige miRNA fra screeningsundersøgelsen blev analyseret i alle tre kohorter anvender brugerdefinerede PCR arrays.

In situ

hybridisering (ISH) blev udført for udvalgte miRNA.

Resultater

I screeningsundersøgelsen, 26 miRNA var signifikant korreleret med resultatet i multivariate analyser. Toogtyve miRNA blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Højere miR-664-3p udtryk og lavere miR-455-5p udtryk var prædiktiv for forbedret resultat i CAPEOXBEV kohorter og viste en signifikant interaktion med bevacizumab effektivitet. Virkningerne var stærkest til OS. Begge miRNA viste høj ekspression i stromaceller. Højere udtryk for miR-196b-5p og miR-592 forudsagt forbedret resultat uanset bevacizumab behandling, med lignende skøn effekt i alle tre kohorter.

Konklusioner

Vi har identificeret potentielt prædiktive miRNA til bevacizumab effektivitet og yderligere miRNA som kunne være knyttet til kemoterapi effektivitet eller prognose hos patienter med mCRC. Vores resultater har brug for yderligere validering i store kohorter, fortrinsvis fra gennemførte randomiserede forsøg

Henvisning:. Boisen MK, Dehlendorff C, Linnemann D, Nielsen BS, Larsen JS, Østerlind K, et al. (2014) Tissue MikroRNA’er som Prædiktorer af Outcome i patienter med metastatisk kolorektal cancer behandlet med første linje Capecitabine og Oxaliplatin med eller uden bevacizumab. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10,1371 /journal.pone.0109430

Redaktør: Ratna B. Ray, Saint Louis University, USA

Modtaget: Juli 7, 2014 Accepteret: August 22, 2014; Udgivet: 15 oktober 2014

Copyright: © 2014 Boisen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at for godkendte årsager, nogle adgangsbegrænsninger anvendelse på de data, der ligger til grund for resultaterne. Data er tilgængelige fra Institutional Data Access /etiske komité ved Onkologisk Afdeling, Herlev Universitetshospital for forskere, der opfylder kriterierne for adgang til fortrolige data. Data anmodninger skal sendes til professor Julia S. Johansen på [email protected]

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en ubegrænset bevilling fra Roche Danmark (www.roche.dk), den Herlev Hospital Research Foundation (www.herlevhospital.dk), og et proof-of-concept bevilling fra tekniske Universitet Danmark (www.dtu.dk). Alle tilskud blev givet til MKB alene, eller til begge MKB og JSJ. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: BVJ: Roche, konsulent /rådgivende rolle; SEN: Roche, konsulent /rådgivende rolle; PP: Roche, konsulent /rådgivende rolle; JSJ: Roche, honorarer og forskningsmidler; MKB: Roche, forskningsmidler. JSJ og MKB er co-opfindere på en patentansøgning-ansøgning relateret til de nævnte miRNA. Patentansøgning info: Navn “microRNA’er til forudsigelse af behandlingseffekt og prognose af kræftpatienter”; Ansøgning nummer “PCT /DK2013 /050.015”. BSN er ansat af en kommerciel virksomhed (Bioneer). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. De fleste dødsfald sker som følge af udviklingen af ​​metastatisk CRC (mCRC). Standard for pleje af patienter med mCRC som ikke kan undergå radikale resektion af metastaser er system kemoterapi med eller uden en målrettet [2] agent. Bevacizumab er et monoklonalt antistof, der binder liganden ‘vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF-A) og derved hæmmer evnen af ​​cancere til at producere nye blodkar fra eksisterende fartøjer, en proces, der kaldes angiogenese. Bevacizumab har vist virkning i patienter med mCRC ved anvendelse i kombination med standard kemoterapi men fordelen er beskeden, når det anvendes unselectively og bevacizumab tilføjer signifikant toksicitet og omkostninger til behandlingen [3] – [7]. Derfor har identifikationen af ​​forudsigende biomarkører for bevacizumab blevet et vigtigt mål for biomarkør forskning hos patienter med mCRC. På grund af sin udbredt anvendelse som en standard første eller anden linje behandling [8], vil evnen til at individualisere bevacizumab behandling har en stor indflydelse på klinisk praksis. Talrige studier har undersøgt potentielle biomarkører i form af RNA, DNA eller protein [9], [10]. Ingen har gjort det ind på klinikken. I øjeblikket er der ikke kommercielt tilgængelige test kan identificere patienter, der vil drage fordel af bevacizumab.

MikroRNA’er (miRNA) er små, -22 nukleotider lange, ikke-kodende RNA er involveret i post-transkriptionel regulering af genekspression. De er blevet intenst undersøgt som biomarkører i patienter med kræft, fordi deres ekspressionsniveauer er dysreguleret i cancerceller kan de påvirke kræft adfærd, og de er relativt resistente over for nedbrydning i almindeligt anvendte prøveudtagning medier [11] – [16]. Flere undersøgelser har identificeret dysregulering af miRNA i CRC tumorvæv og i blodprøver fra patienter med CRC; og nogle af de identificerede miRNA blev også forbundet med prognostiske faktorer som dybden af ​​invasion, scene og lymfeknudemetastaser [17]. Endvidere vigtige molekylære funktioner i CRC såsom mikro-satellit ustabilitet (MSI) og

BRAF

mutationsstatus er blevet vist at være associeret med forskellige miRNA ekspressionsmønstre [18]. Derfor er der god grund til at undersøge potentielle anvendelighed af miRNA ekspression som en prædiktiv eller prognostisk biomarkør hos patienter med CRC. Til dato har ingen offentliggjort undersøgelse udforsket den prædiktive værdi af miRNA udtryk for bevacizumab effektivitet på en omfattende måde.

Vi havde til formål at identificere miRNA, der var prædiktive for udfaldet hos patienter med mCRC behandlet med første linje capecitabin og oxaliplatin med og uden bevacizumab (CAPEOXBEV /CAPEOX) og at identificere, hvilke af disse miRNA kan være prædiktiv for effekten af ​​bevacizumab-tillæg til kemoterapi.

Metoder

Studie design

A screening undersøgelse under anvendelse et array fremgangsmåde blev udført på primære CRC vævsprøver fra patienter behandlet med CAPEOXBEV (screening kohorte) for at identificere kandidat miRNA med ekspressionsniveauer relateret til resultatet. Derefter blev ekspressionsniveauerne af de identificerede kandidat miRNA målt ved anvendelse af en mere præcis metode med dobbelte bestemmelser i tre kohorter: en undergruppe af screeningen kohorten; en validering kohorte, hvilket var en uafhængig gruppe af patienter behandlet med CAPEOXBEV; og en kontrol kohorte bestående af patienter behandlet med CAPEOX alene.

Patienter, dataudtræk og slutpunkter

BETmiRC (Bevacizumab Tissue mikroRNA i kolorektal cancer) studie med tilbagevirkende kraft inkluderede patienter med mCRC behandlet med første linje CAPEOXBEV i 10 danske hospitaler 2006-2011, og patienter i behandling med første linje CAPEOX på Herlev Hospital eller i et randomiseret studie 2003-2006 [19], før bevacizumab blev godkendt, som tidligere beskrevet [20] .Den ende point tid til sygdomsprogression (TTP) og samlet overlevelse (OS) blev målt fra behandlingens start til sygdomsprogression eller død uanset årsag, henholdsvis (detaljeret definition i File S1). Vital status blev opdateret 5. juli 2013.

Vævsprøver

formalin-faste paraffinindlejrede (FFPE) væv blokke med prøver fra primære tumorer blev hentet ved hjælp af nationale Pathology Registry. Kontrolprøver fra patienter reseceret for inflammatorisk tarmsygdom blev også inkluderet. En erfaren gastrointestinal patolog (DL) valgt som væv blokke til at hente og scorede blokkene for tumorceller procent. Tre 10-um snit blev skåret fra hver blok uden mikro- eller makro-dissektion og snittene blev anbragt i sterile Eppendorf-rør. Alle vævsprøver blev indsamlet før enhver systemisk behandling eller stråleterapi.

miRNA ekspressionsanalyse

RNA blev oprenset ved anvendelse af miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ved anvendelse af producentens instruktioner. Rensningen ordre blev randomiseret til validering og kontrolforanstaltninger kohorte prøver. Den ikke-humane miRNA ATH-MIR-159a blev tilsat til hver prøve før cDNA syntese som en spike-i kontrol.

TaqMan Humant MicroRNA matrix A og B Cards Set v3.0 (Applied Biosystems) blev anvendt at kvantificere ekspressionen af ​​754 humane miRNA med enkeltbestemmelser i screeningsundersøgelsen. I den efterfølgende undersøgelse af den reducerede screening-, validation-, og kontrol kohorter blev miRNA udtryk målt ved hjælp af TaqMan Brugerdefineret LDA kort (Applied Biosystems) profilering 22 udvalgte miRNA i to eksemplarer med 8 prøver på hvert kort. De 22 miRNA blev udvalgt fra screeningsundersøgelsen og mikro-strømningstekniske kort blev præ-konfigureret fra producenten i henhold til vores specifikationer. Prøverne blev analyseret i en randomiseret rækkefølge på Brugerdefineret LDA kortene.

Instruktionerne og reagenser fra producenten blev anvendt i alle trin (https://www.products.appliedbiosystems.com). Alle RNA purification- og miRNA ekspression blev udført af AROS Applied Biotechnology (Århus, Danmark). Virksomheden blev blindet til alle kliniske oplysninger.

miRNA

situ

hybridisering

i In situ

hybridisering (ISH) blev udført ved hjælp af dobbelt-FAM ( carboxyfluorescein) mærket låst nukleinsyre (LNA [21]) sonder (Exiqon, Vedbæk, Danmark) for miR-185-5p, miR-455-5p, MIR-592, miR-664-3p, miR-21-5p, og mIR-126-3p som tidligere beskrevet [22]. Alle ISH blev udført af Bioneer (Hørsholm, Danmark).

Statistisk analyse

Ingen beregning stikprøvestørrelse blev gjort før studere indvielse. Vi sigter efter den største stikprøvestørrelse muligt og lige størrelser af de tre kohorter

miRNA udtryk analyser -.. Screening undersøgelse

Raw tærskel cyklus (C

t) for hver miRNA blev kontrolleret for outliers og data blev korrigeret ved hjælp af spike-i værdier. I en univariat udvælgelsesmetode blev ekspressionen af ​​hver miRNA relateret til TTP og OS ved hjælp af en Cox proportionel risiko (CPH) model [23], [24]. Kandidat miRNA indgik i en multivariat CPH model justeret for alder, køn, histologi, antal metastatiske steder, primær tumor placering og tidligere adjuverende behandling, som blev forenklet ved hjælp af en baglæns elimination procedure baseret på Akaike s Information Criterion [25]. Analysen blev derefter gentaget for datasæt normaliseret ved hjælp quantile- og betyder normalisering. Endelig blev 22 miRNA udvalgt til yderligere undersøgelse primært baseret på deres præstationer i de multivariate analyser. Antallet af miRNA at medtage i den anden undersøgelse blev valgt pragmatisk som det tilladt for duplikerede målinger på den brugerdefinerede platform

miRNA udtryk analyser -.. Screening-, validation-, og kontrol kohorter

Mean C

t af de dobbelte målinger blev beregnet og omdannet til 40-C

t. Hvis en af ​​de to målinger var ubestemt, blev C

t af den anden måling anvendes. I hver af de tre kohorter blev udtryk af de 22 miRNA relateret til TTP og OS hjælp CPH modeller med justering for alder, køn, primær tumor placering, før adjuverende behandling, og antallet af metastatiske steder. Resultaterne blev rapporteret som hazard ratio (HR) pr inter-kvartil rækkevidde stigning i ekspressionsniveauet med 95% konfidensintervaller (CI) .Den mulig interaktion mellem miRNA udtryk niveau og bevacizumab behandlingseffekt blev testet i de tre kohorter kombineret ved hjælp af en sandsynlighed kvotientkriteriet .

Da resultatet for patienter behandlet med bevacizumab afveg meget afhængig primær tumor sted [20], udførte vi også samspillet analyser for proksimale og distale primære kræftformer separat.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og ingen formelle korrektioner for flere sammenligninger. Den statistiske softwarepakker R [26] (www.r-project.org) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) blev anvendt til alle analyser.

Target forudsigelse

i silico

forudsagt gen mål for udvalgte miRNA blev identificeret ved hjælp af den åbne adgang DIANA-microT-CDS værktøj (https://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].

Etik

undersøgelsen blev godkendt af den regionale videnskabsetiske komité i Region Hovedstaden Danmark (https://www.regionh.dk/vek, godkendelsesnummer: H-1-2010-081). Da denne retrospektiv undersøgelse ikke ville have nogen indflydelse på behandlingen og da de fleste af deltagerne var død, skriftlig tilladelse blev ikke opnået, og dette blev godkendt af den etiske komité.

Rapportering af resultaterne blev fremstillet i overensstemmelse med den bemærkning retningslinjer [28], [29].

Yderligere oplysninger er beskrevet i File S1.

Resultater

miRNA ekspression blev målt i 460 FFPE prøver. Antallet af prøver i hver kohorte var:. Screening kohorte = 212, reduceret screening kohorte = 155, validering kohorte = 121, og kontrol kohorte = 127 (figur S1 i File S1)

Patienterne indgår i den reducerede screening- og validering miRNA kohorter afveg fra de patienter, der ikke er medtaget. De var mere tilbøjelige til at have: resekteres primær tumor, en enkelt metastatisk websted, performance status 0, og tidligere adjuverende behandling. De oplevede også en længere TTP og OS (tabel 1). Patienterne i kontrolgruppen kohorte svarede til patienterne ikke er inkluderet undtagen for dem bliver mere tilbøjelige til at have haft den primære tumor resekterede.

Screening undersøgelse

Ni prøver blev identificeret som outliers baseret på et lavt antal miRNA detekteret og disse blev udelukket, hvilket efterlader 203 prøver til outcome beregninger. Tyve-seks miRNA var forbundet med TTP eller OS i multivariat analyse hjælp på rå, fraktil-normaliseret, eller betyder-normaliseret udtryk data (tabel S1 i File S1). Tyve-to af disse blev udvalgt til yderligere undersøgelse: miR-1, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-22-3p, miR-29b-3p, miR-145-3p, miR-155-5p , miR-185-5p, miR-193b-5p, miR-196b-5p, miR-204-5p, miR-214-5p, miR-338-3p, miR-382-5p, miR-449a, miR-455 . -5p, miR-497-5p, miR-501-5p, miR-545-3p, miR-552-3p, miR-592 og miR-664-3p

Fokuseret miRNA panel – miRNA forbundet med TTP

Elleve miRNA var signifikant associeret med TTP i enten screening- eller validering kohorte, men ikke i begge kohorter og ingen signifikante interaktioner blev fundet mellem miRNA udtryk og bevacizumab effekt (tabel 2).

Kaplan-Meier-kurver for TTP ifølge kvartiler af miR-664-3p- og miR-455-5p udtryk er vist i figur S2 og S3 i File S1

Fokuseret miRNA panel -. miRNA forbundet med OS

Tolv miRNA var signifikant associeret med OS i en eller flere af screening-, validation- og kontrol kohorter (tabel 3). Højere miR-664-3p udtryk var forbundet med længere OS i screening og validering kohorter anvender rå udtryk: HR 0,64 (CI 0,48-0,86) og 0,60 (CI 0,44-0,82); og normaliseret udtryk: HR 0,66 (CI 0,49-0,91) og 0,55 (CI 0,39-0,79). Ingen sammenhæng mellem MIR-664-3p ekspression og OS blev fundet i kontrolgruppen kohorte. En signifikant interaktion mellem miR-664-3p udtryk og bevacizumab virkning blev observeret ved hjælp af både Rå- og normaliseret udtryk (

P

= 0,02 og

P

= 0,02). Kaplan-Meier grunde til OS efter kvartiler af miR-664-3p udtryk er vist i figur 1.

Kaplan-Meier-kurver er vist for patienter behandlet med CAPEOXBEV bruger rå (A) eller betyde-normaliseret (B ) udtryk og patienter behandlet med CAPEOX alene ved hjælp af rå (C) og betyde-normaliseret (D) udtryk. Hazard ratio (HR) er ujusterede og konfidensintervaller (CI) er beregnet ved hjælp bootstrapping. Udtrykket intervaller vises i øverste højre hjørne er 40-C

t, så højere værdier svarer til højere udtryk. Sort linje = laveste kvartil; rød linje = anden kvartil; grønne linje = tredje kvartil; blå linje = højeste kvartil

Højere miR-455-5p udtryk var forbundet med kortere OS i den kombinerede bevacizumab-behandlede kohorte ved brug af normaliseret udtryk:. HR 1,24 (CI 1,06-1,45) , men ikke i kontrolgruppen kohorte. Der var en signifikant interaktion med bevacizumab effekt (

P

= 0,02). Kaplan-Meier grunde til OS efter kvartiler af miR-455-5p udtryk er vist i figur 2.

Kaplan-Meier-kurver er vist for patienter behandlet med CAPEOXBEV bruger rå (A) eller betyde-normaliseret (B ) udtryk og patienter behandlet med CAPEOX alene ved hjælp af rå (C) og betyde-normaliseret (D) udtryk. Hazard ratio (HR) er ujusterede og konfidensintervaller (CI) er beregnet ved hjælp bootstrapping. Udtrykket intervaller vises i øverste højre hjørne er 40-C

t, så højere værdier svarer til højere udtryk. Sort linje = laveste kvartil; rød linje = anden kvartil; grønne linje = tredje kvartil; blå linje = højeste kvartil

Højere miR-592-ekspression var forbundet med længere OS i screening- og validering kohorter anvender rå udtryk:. HR 0,69 (CI 0,69-0,92) og 0,76 (CI 0.60- 0,95); og i valideringen kohorten hjælp normaliseret udtryk: HR 0,76 (CI 0,63 til 0,93), med en lignende tendens i screeningen kohorten hjælp normaliseret udtryk: HR 0,77 (CI 0,59-1,00). Højere miR-592-ekspression var også forbundet med længere OS i kontrolgruppen ved brug af normaliseret udtryk:. HR 0,71 (CI 0,53-0,96)

Højere miR-196b-5p udtryk var forbundet med længere OS hjælp Rå- og normaliseret udtryk både i den kombinerede bevacizumab-behandlede kohorte: HR 0,77 (CI 0,66-0,90) og 0,79 (CI 0,64-0,97); og i kontrolgruppen:. HR 0,78 (CI 0,62-0,98) og 0,73 (CI 0,58-0,93)

Fokuseret miRNA panel – primær tumor placering og anden linje udfald

I analyser stratificeret for primær tumor placering blev en signifikant interaktion med bevacizumab virkning ses for mIR-664-3p ekspression i colon sigmoideum og rectum gruppe til både TTP hjælp råt udtryk og til OS hjælp Rå- og normaliseret ekspression. Ekspressionsniveauer af alle miRNA efter primær tumor placering er vist i figur S4 i File S1.

Hos patienter fortsatte bevacizumab i anden linje, var højt miR-664-3p udtryk forbundet med længere TTP (HR 0,30,

P

= 0,04) og høj miR-455-5p udtryk var forbundet med en tendens til kortere TTP (HR 2,72,

P

= 0,09), mens der ikke sådanne sammenslutninger blev set hos patienter, der gjorde ikke fortsætte bevacizumab (figur S5 i File S1).

miRNA

situ

hybridisering

en intens miR-664-3p ISH signal, primært med en cytoplasmatisk lokalisering i, blev set i subpopulationer af tumor-infiltrerende lymfocytter, fibroblaster, og endotelceller placeret på den invasive grænse (figur 3). En svag MIR-664-3p ISH signal blev set i tumor epitelceller, men en lignende farvning blev observeret med scramble probe, hvilket tyder på en uspecifik binding af proben til disse celler. MIR-455-5p ISH signal blev fundet i nogle lymfocyt-lignende stromale celler i halvdelen af ​​prøverne, mens tumor epitelceller var negative (fig S6 i File S1). Nr ISH signal blev opnået med proberne mod MIR-185, MIR-449a eller MIR-592. Positive prober til miR-21-5p og miR-126-3p kontrol viste moderat til intens farvning i fibroblaster og endotelceller henholdsvis i alle tilfælde.

Paneler A og B viser eksempler på miR-664-3p ISH i infiltrerende lymfocytter (A) og fibroblaster (B). På hinanden følgende sektioner blev farvet med LNA sonder mod miR-664-3p, miR-126-3p og en scramble sekvens. MIR-664-3p ISH signal ses i infiltrerende lymfocytter (A, pile, B, rød pil) og i fibroblaster (B, sorte pile), mens der ikke opnås ISH signal med scramble sonde. En stærk ISH signal ses i endotelceller med den positive kontrol probe MIR-126-3p. “A” i panel B viser en arterie.

Target forudsigelse

Tabel S2 i File S1 viser de 20 højest rangerende forudsagt gen mål for miR-196b-5p, miR- 455-5p, miR-592, og miR-664-3p, og referencer publicerede artikler om funktion og udtryk niveau af disse miRNA i kræft.

diskussion

Dette er den første omfattende undersøgelse af miRNA som prædiktive biomarkører for bevacizumab effektivitet i CRC. Af de 22 miRNA udvalgt fra screeningsundersøgelsen, miR-664-3p og miR-455-5p viste den største potentiale som prædiktive biomarkører for bevacizumab effektivitet.

Sammenhængen mellem miR-664-3p og OS afveg markant mellem patienter behandlet med bevacizumab og patienter behandlet med kemoterapi alene: Stigende miR-664-3p udtryk i den primære CRC væv var forbundet med længere OS i begge kohorter af patienter behandlet med bevacizumab kombineret med CAPEOX men ikke i kohorten behandlet med kemoterapi alene. Stigende miR-664-3p udtryk var også forbundet med længere TTP hos patienter behandlet med bevacizumab, men interaktionen test var eneste væsentlige i undergruppen af ​​patienter med sigmoideum colon- og rektal primære tumorer. Vi har tidligere antaget, at denne undergruppe af patienter kunne være mere tilbøjelige til at drage fordel af behandling med bevacizumab end patienter med flere proksimale primære tumorer [20]. MIR-664-3p udtryk var også højere hos disse patienter end hos patienter med flere proksimale primære tumorer (Figur S4 i File S1). I den lille kohorte af patienter med tilgængelige anden linje resultatet data, blev høj miR-664-3p udtryk også forbundet med en længere TTP hos patienter fortsatte bevacizumab, understøtter en forbindelse mellem miR-664-3p udtryk og bevacizumab effektivitet.

Vi observerede høj ekspression af mIR-664-3p i stromaceller, herunder endotelceller, hvilket er i overensstemmelse med en rolle for mIR-664-3p i angiogenese. Meget få data er blevet offentliggjort om dette miRNA (tabel S2 i File S1). Interessant, blandt top forudsagte mål for miR-664-3p er neuroligin 1 (NLGN1), MDGA2, og gephyrin, som alle er involveret i samme synaptogenic proces i nervesystemet [30], [31]. For nylig, neuroligin og dens bindingspartner neurexin har vist sig at være almindeligt udtryk i karsystemet og involveret i angiogenese [30]. Overekspression af neuroligin 1 i endotelceller dyrket i en tumorigen miljø øget angiogenese, og knockdown af neurexin reduceret fibroblastvækstfaktor 2-induceret angiogenese [32]. I en zebrafisk embryo model af angiogenese, inhibering af VEGF-A eller neuroligin forårsagede lignende størrelser af vaskulære defekter, men inhibering af begge resulterede i en mere end additiv antiangiogen virkning [33]. Hypotetisk kan virkningen af ​​miR-664-3p udtryk på resultatet således forklares ved dets nedregulering af neuroligin systemet og den resulterende synergi med VEGF-A hæmning af bevacizumab.

Forøgelse miR-455-5p udtryk var forbundet med kortere OS i den kombinerede bevacizumab behandlet kohorte mens ingen sådan sammenhæng blev observeret i kohorten behandlet med kemoterapi alene. Vi identificerede høj ekspression af denne miRNA i lymfocyt-lignende celler placeret i stroma omkring kræftcellerne. MIR-455-5p er blevet rapporteret til at blive dysreguleret i kræft; dog er der ikke identificeret validerede targets (tabel S2 i File S1).

Stigende udtryk for både miR-196b-5p og miR-592 var forbundet med længere OS i alle tre kohorter, med lignende skøn effekt. Begge disse miRNA har vist sig at blive nedreguleret i CRCs med mangelfuld mismatch repair (dMMR) [34]. Højere MIR-592-ekspression er blevet vist at være associeret med forbedret OS hos patienter i salvage anti-EGFR behandling og højere MIR-196b-5p-ekspression er blevet forbundet med respons på neo-adjuvant 5-FU og strålebehandling i patienter med lokalt fremskreden rektal kræft [35], [36]. MIR-592-ekspression er blevet rapporteret at være højere i venstre-sidet sammenlignet med højresidig CRCs [37], som vi også fundet i vores undersøgelse. Vi kunne ikke plette vores vævssnit for MIR-592, men ekspression af både MIR-592 og MIR-196b-5p har tidligere vist sig at være 2,5 til 3,7 gange højere i CRC epitel end i CRC stroma [38]. Funktionen af ​​MIR-592 er ikke blevet beskrevet. MIR-196b-5p er dysreguleret i mange maligne lidelser, er blevet relateret til kræft prognose, og er rettet mod c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 og flere HOX gener (Tabel S2 i File S1).

Der er vigtige begrænsninger til at overveje om vores resultater. Vi studerede efterfølgende identificeret kohorter fra forskellige tidsperioder, hvilket øger risikoen for bias, da andre end de behandlinger, der anvendes kan eksistere mellem kohorter forskelle. Vi brugte gennemsnitlig udtryk for normalisering, men da de miRNA anvendt til beregning af middelværdien var relateret til resultatet, det er ikke optimal. Selvom foreningen med resultatet for nogle af miRNA blev identificeret i to eller tre uafhængige kohorter, den intelligente effekt relateret til bevacizumab forbliver un-valideret. Vi har ikke korrigere for multiple test, men miR-664-3p ville stadig være signifikant associeret med OS i valideringen kohorten, selv efter korrektion for de 22 miRNA testet. Også effekt skøn var ens i de kohorter, hvilket indikerer en ikke-tilfældig forening. Blandt de stærke sider vores undersøgelse er den store stikprøve, den indledende omfattende screening undersøgelse, brug af tre uafhængige kohorter, og randomisering af purification- og miRNA ekspressionsanalyse orden.

Som konklusion, er dette den første undersøgelse at undersøge potentialet for miRNA-ekspression i primære tumorer til at forudsige fordel af bevacizumab til patienter med mCRC. Vi har identificeret miR-664-3p og miR-455-5p som mulige prædiktive biomarkører for bevacizumab. MIR-592 og MIR-196b-5p var prædiktive for resultatet både med og uden bevacizumab og disse kan være prognostiske biomarkører eller biomarkører relateret til kemoterapi effektivitet. Disse resultater har brug for validering i uafhængige kohorter – fortrinsvis fra randomiserede forsøg og brug af stabile miRNA normalizers -før de kan gennemføres i klinisk beslutningstagning. Belysning af de cellulære oprindelse og biologiske funktioner af disse miRNA er berettiget.

Støtte Information

File S1.

Denne fil indeholder supplerende metoder, supplerende tabel S1 og S2, og supplerende Figur S1-S6

doi:. 10,1371 /journal.pone.0109430.s001

(PDF)

Tak

Vi vil gerne takke: Jørgen Hansen, MD fra Onkologisk afdeling på Aalborg Sygehus, Danmark for hjælp vedrørende erhvervelse af patientdata; Mel Heeran, ph.d. for fremragende faglig bistand med sektionering af FFPE vævsprøver; Jakob Z. Johansen, MD til indtastning kliniske data i BETmiRC databasen; Mogens Kruhøffer, PhD, fra AROS Applied Biotechnology A /S, Danmark efter hjælp til miRNA analyser, og den danske CancerBiobank (DCB) til biologisk materiale og for data vedrørende håndtering og opbevaring.