Abstrakt
binyrebark carcinom (ACC) er en meget sjælden endokrine tumor, med variabel prognose, afhængigt af tumor fase og tidspunktet for diagnosen. Men det er generelt fatal, med en samlet overlevelse af 5 år fra detektion. Strålebehandling anvendelighed til ACC behandling er blevet bredt drøftet og synes at være afhængig af molekylære forandringer, hvilket igen fører til øget radio-resistens. Mange undersøgelser har vist, at p53 tab er en vigtig risikofaktor for malignt adrenokortikalt tumor indtræden og det er blevet rapporteret, at somatiske mutationer i
TP53
gen forekommer hos 27 til 70% af voksne sporadisk ACC. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen af somatiske mutationer af
TP53
genet som reaktion på ioniserende stråling (IR). Vi undersøgte status af p53 i to adrenocorticale cellelinier, H295R og SW-13, der huser ikke-fungerende former af dette protein, på grund af mangel på exon 8 og 9 og en punktmutation i exon 6, hhv. Desuden er disse cellelinjer viser høje niveauer af p-Akt og
IGF2
, især H295R. Vi bemærkede, at restaurering af p53 aktivitet førte til hæmning af vækst efter transient transfektion af celler med vildtype p53. Evaluering af deres respons på IR i form af celledeling og levedygtighed blev bestemt ved hjælp af celletælling og TUNEL analyse.
wtp53 overekspression også øget celledød ved apoptose efter stråling i begge cellelinier. Desuden RT-PCR og Western blotting analyse af nogle p53 target gener, såsom
BCL2
,
IGF2
og Akt viste, at p53-aktivering efter IR førte til et fald i
IGF2
ekspression. Dette blev associeret med en reduktion i den aktive form af Akt. Tilsammen disse resultater fremhæve betydningen af p53 som reaktion på stråling af ACC cellelinjer, hvilket tyder på dens betydning som en prædiktiv faktor for strålebehandling i maligne adrenocortikale tumorer sager
Henvisning:. Sampaoli C, Cerquetti L, Gawhary RE , Bucci B, Amendola D, Marchese R, et al. (2012) p53 Stabilisering Fremkalde celievækstinhiberingen og Påvirker
IGF2
Pathway i Reaktion på Strålebehandling i binyrebark kræftceller. PLoS ONE 7 (9): e45129. doi: 10,1371 /journal.pone.0045129
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, Italien
Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: 14. august 2012; Udgivet: September 19, 2012 |
Copyright: © Sampaoli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det italienske ministerium for universiteter og forskning (20085P5S49_005) ved Sapienza-universitetet i Rom (C26A1097KR), af Fondazione Guido Berlucchi per la Ricerca sul Cancro, forskningsprojektet: “Tumori del sistema endocrino” Borgonato di Corte Franca – Brescia, Italien . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
binyrebark carcinom (ACC) er en meget sjælden endokrine tumor, med en incidens anslås til ca. 1 til 2 tilfælde
pr
1 million mennesker hvert år i den almindelige voksne befolkning [1], [ ,,,0],2], mens der i barnet befolkning i det sydlige Brasilien hyppigheden af denne malignitet er forholdsvis høj, lige fra 3,4 til 4,2
pr
millioner børn [3], [4]. Statistisk aldersfordeling følger en bimodal trend, med en første top forekommer i den tidlige barndom og en anden i den fjerde og femte årtiers liv [2], [5].
ACC vise variabel prognose, afhængigt af tumor fase og tidspunktet for diagnosen, selv om de generelt er dødelig, med en samlet overlevelse på 5 år fra registrering [6]. Hyppighed af metastase forbundet med ACC varierer afhængigt af undersøgelsen, der spænder fra 30% til 85% af patienter med fjernmetastaser på tidspunktet for præsentationen [7].
I øjeblikket er den terapi, der synes at give de bedste resultater i ACC tilfælde er kirurgisk resektion af adrenal masse. Men postoperative sygdomsfri overlevelse ved 5 år er kun omkring 30%, og gentagelse satser er op til 85%. Medicinsk behandling med o, er p’DDD (ortho, para ‘, dichlor-, diphenyl, dichlorethan, eller mitotan) og andre cytotoksiske lægemidler begrænset af vigtige bivirkninger. Derfor er der behov andre muligheder adjuverende behandling efter fuldstændig tumor fjernelse [8], [9].
Strålebehandling er ofte blevet betragtet ineffektive til ACC behandling. Faktisk har op til 58% af patienterne ingen signifikant reaktion. Selvom data indsamlet fra patienter behandlet med adjuverende tumor seng bestråling viste, at strålebehandling kan være effektive til at reducere den høje lokalt recidiv af ACC, den store variation i de observerede virkninger tyder på, at der er behov for flere undersøgelser for fuldt ud at forstå den effektive terapeutiske rolle af strålebehandling [8], [10]. På nuværende tidspunkt er det, at strålebehandling bør individualiseres, idet der tages hensyn til parametre som tumorstørrelse, resektion status, Ki-67-indekset og tumor spredning [11].
Desuden er variationen af svarene observeret fremhævede betydningen af identifikation af genetiske og molekylære ændringer er involveret i modstanden af nogle tumorer til strålebehandling [2], [12]. På nuværende viden om genetiske ændringer, der fører til ACC disposition er temmelig dårlig. Dog har mange undersøgelser vist, at p53 tab er en vigtig risikofaktor for malignt binyrebark tumor debut. Patienter ramt af Li-Fraumeni syndrom, der arver germlinie mutationer af
TP53
, er mere tilbøjelige til at udvikle ondartede adrenocorticale tumorer. Desuden er en specifik mutation i codon 337 (R337H) synes at være ansvarlig for de fleste tilfælde af ACC i barnets befolkning i det sydlige Brasilien. Endvidere har det været også rapporteret, at somatiske mutationer i
TP53
gen forekommer i 25 til 70% af voksne sporadisk ACC [2], [9].
I denne undersøgelse undersøgte vi rolle af p53 som respons på ioniserende stråling (IR) i ACC
in vitro
modeller. Konkret har vi analyseret status
TP53
gen i to humane ACC cellelinier, H295R og SW-13, og vi fandt, at dette gen er muteret i begge cellelinier, som er delvis resistente over for IR i en dosis af 6 Gy, som tidligere demonstreret [13]. Den overekspression af
IGF2
mRNA er et andet typisk træk ved ACC fundet i H295R cellelinje. Her viste vi, at genoprettelsen af p53-aktivitet, ved transfektion af vildtype p53 (
wtp53), førte til inhibering af vækst og induceret celledød ved apoptose efter IR administration i begge cellelinier. Vi har også bemærket en pålidelig fald i
IGF2
genekspression og en reduktion i Akt aktivering efter IR behandling i celler over-udtrykker vildtype p53.
Tilsammen disse resultater understreger vigtigheden af p53 i cellulære respons på IR i ACC cellelinier. De viser også en molekylær mekanisme, der involverer IGF2 og dermed styrke effektiviteten af strålebehandling som adjuverende behandling i ACC.
Resultater
TP53
mRNA analyse
I en tidligere papir ved vores gruppe [13], en stor sletning i
TP53
gen, der påvirker exon 8 og 9, blev opdaget i H295R cellelinje. Vi udførte sekvensanalyse af
TP53
kodende sekvens i disse celler for at vurdere effekten af denne deletion på mRNA produktion. Vi fandt, at en kortere mRNA transkriberes, hvor exon 7 er direkte bundet til exon 10 (figur 1, felt A, øverst). I overensstemmelse med det, RT-PCR-analyse af
TP53
, blev udført under anvendelse af primere, der flankerer exonerne 8 og 9 region. Dette afslørede en kortere mRNA produkt, der mangler 211 basepar (figur 1, panel B).
(A) Repræsentation af
TP53
mutationer identificeret i H295R og SW-13 cellelinjer, der viser en stor deletion berører 211 basepar i H295R celler (øverst) og en homozygot punktmutation i exon 6 (
r.577c u
) i SW-13-cellelinie (nederst). SW-13 celler udviser også en polymorf stedet ligger i exon 4 (
r.215c g
). (B) Inverted billede i forhold til RT-PCR-analyse af exon 7 til 10 af
TP53
gen. Elektroforese på en 2% agarosegel afslørede et større bånd på ~575 bp, svarende til SW-13-transkript, og et mindre bånd på ~364 bp, svarende til H295R transkript (DNA-stige, 1 Kb plus). (C) Forudsagt aminosyresekvens af p53 i H295R og SW-13-cellelinjer. Deletion af exon 8 og 9 i H295R bestemmer en rammeskift starter ved codon 261, hvilket skaber en efterfølgende stopkodon i position 274 (øverst). I SW-13-celler, en homozygot punktmutation ved kodon 193 bestemmer en aminosyresubstitution (histidin til tyrosin) i DBD af proteinet (nederst). (D) Western blotting analyse af p53 i H295R og SW-13 celler, der viser tilstedeværelsen af en kortere protein i H295R cellelinje, som molekylvægt er ~44 kDa.
sletning af exons 8 og 9 bestemmer en aminosyresekvens ændring startende fra kodon 261, som også indfører en præmatur stopkodon i aminosyreposition 274 (figur 1, felt C, øverst). Ifølge vores tidligere data, blev denne mRNA vist skal oversættes til en kortere protein, hvis molekylvægt er ca. 44 kDa (figur 1, panel D).
Sekventering analyse af
TP53
kodning sekvens i SW-13 celler bekræftede tilstedeværelsen af en homozygot punkt mutation i exon 6 (
r.577c u
)., der blev beskrevet for første gang af Reincke
et al
[ ,,,0],14] (figur 1, felt A, nederst). Dette resulterer i ændring aminosyren i codon 193 (histidin til tyrosin) (figur 1, felt C, nederst). Desuden har vi identificeret en polymorfi i codon 72 (CCC til CGC) (figur 1, felt A, nederst) i denne cellelinie, hvilket resulterer i en aminosyresubstitution i denne position (arginin i stedet for prolin) (figur 1, felt C, bund). Resulterende p53-protein i disse celler har en standard molekylvægt (figur 1, felt D) og udtrykkes kraftigt sammenlignet med LNCaP-cellelinien, som huser vildtype form af p53, som blev påvist ved Western blotting-analyse (fig S1).
Effekt af vildtype
TP53
på celledeling og respons på ioniserende stråling
for at vurdere betydningen af
TP53
mutationer på celledeling, vi forbigående transficeret H295R og SW-13-celler med tom vektor (mock) eller en vektor, der udtrykker vildtype-form af
TP53
(WT) og evalueret virkningen på cellevækst 24, 48 og 72 timer efter transfektion. Vi evaluerede også effekten af
TP53
restaurering som reaktion på bestråling med dosis på 6 Gy.
Den samme analyse blev udført på radio-resistente ovarie adenocarcinom SK-OV-3 celler, som gør ikke udtrykke enten p53 protein eller mRNA [15].
i H295R celler (Figur 2, panel A, til venstre), blev der ingen signifikant væksthæmning observeret i celler, der udtrykker vildtype p53 sammenlignet med celler transficeret med tom vektor ( -11% efter 48 timer og -9% ved 72 timer). Dette indikerer, at p53 alene ikke er i stand til at inducere en stabil vækststandsning i disse celler. IR ændrede ikke signifikant celleproliferation i celler transficeret med tom vektor (-4% efter 72 timer), mens effekten af bestråling på cellevækst var tydelig i celler, der udtrykker
wtp53. Denne effekt var tydelig ved 48 timer efter transfektion (-18% i forhold til håne bestrålede celler; p 0,05) og styrket på 72 timer efter transfektion (48 timer efter bestråling), når væksthæmning nåede -25% (p 0,01).
Cellevækst blev evalueret i H295R, SW-13 og SK-OV-3-cellelinier transficeret med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT), enten bestrålede eller ej. (A) I H295R cellelinjer (venstre), ioniserende stråling (IR) behandling inducerer en signifikant inhibering af cellevækst i celler, der udtrykker vildtype-p53, startende fra 48 timer efter transfektion (-18% i forhold til spotte bestrålede celler; p 0,05 ) og nå -25% efter 72 timer (p 0,01). Bestråling ikke inducerer en stabil virkning i SW-13-celler (højre) transficeret med tom vektor, hvorimod celler, der udtrykker vildtype p53 er signifikant inhiberet ved 48 timer efter transfektion (-28%, p 0,05), indtil afslutningen af eksperimentet ( -31%; p 0,01). I SK-OV-3-celler (nederst), p53 restaurering inducerer en stærk virkning på cellevækst, hvilket er tydeligt siden 48 fra transfektion (-20% af vækstinhibering i WT + IR prøve sammenlignet med mock + IR; p 0,01) og udholder op til 72 timer (-28%; p 0,01). Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af mindst tre uafhængige forsøg, der udføres af dubletter. (B) Western blotting-analyse af cyclin E og cyclin D1-ekspression i H295R celler ved 72 timer efter transfektion viste en nedregulering af disse proteiner i celler, der udtrykker
wtp53 behandlet med IR i en dosis på 6 Gy. (C) Analyse af cyclin E og cyclin D1-ekspression i SW-13 cellelinie ved Western blotting viser et fald i proteinniveauer i prøver transficeret med p53-vektor efter bestråling. Bands ‘intensiteter blev kvantificeret med ImageJ software, ved hjælp vinculin til normalisering. (*, P 0,05).
I modsætning til vores tidligere rapport [13], i dette arbejde vi forbedret transfektion effektivitet ved hjælp pBABE-neo-p53 vektor, der indeholder MMLV Lang Terminal Repeat. Morgenstern og Land [16] understøtte evnen af denne vektor i høj grad at forbedre genekspression i mange cellelinjer.
Lignende resultater blev observeret i SW-13-cellelinie (figur 2, panel A, højre). Celler transficeret med tom vektor eller p53-vektor viste en meget lignende proliferation tendens. Desuden har bestråling ikke signifikant påvirker celleproliferation i celler transficeret med tom vektor. Tværtimod en stærk effekt af IR behandling i celler, der udtrykker
wtp53 var tydelig ved 24 timer efter bestråling (48 timer efter transfektion), med 28% af cellevækstinhibering (p 0,05) sammenlignet med bestrålede celler transficeret med tom vektor. Effekten var endnu større ved 72 timer efter transfektion, når vi observeret 31% af vækstinhibering i WT bestrålede celler sammenlignet med kontrollen (p 0,01).
SK-OV-3-celler (figur 2, panel a, nederst), genopretning af
wtp53 inducerede en svag hæmning af cellevækst, som dog ikke oversteg 17% efter 72 timer. Vi observerede også, at IR behandling ved en dosis på 6 Gy inducerede væksthæmning af -27% (p 0,05) efter 24 timer i celler transficeret med tom vektor, som nåede -35% (p 0,01) 24 timer efter bestråling i celler, der udtrykker p53 sammenlignet med dem transficeret med tom vektor. Denne effekt øges efter 48 h (-28%; p 0,01).
Betydningen af p53 i SK-OV-3 celler respons på bestråling blev yderligere bekræftet af den observation, at celler transficeret med tom vektor begyndte at inddrive 72 timer efter IR behandling, mens de, der udtrykker
wtp53 fortsat skal inhiberes (data ikke vist).
i H295R og SW-13 cellelinjer, kan virkningen af p53 stabilisering på cyclin E og cyclin D1 blev evalueret, da disse proteiner bidrager til celleproliferation ved at accelerere G1 fasen af cellecyklus [17], [18]. Efter 72 timer efter transfektion med tom vektor (mock) eller p53 vektor (WT), observerede vi et fald i cyclin E og cyclin D1 ekspressionsniveauer i prøver udtrykker
wtp53 bestrålet med en dosis på 6 Gy, i både H295R (figur 2, felt B) og SW-13 (figur 2, panel C) celler. Dette resultat dermed indikerer, at IR behandling er i stand til at bremse proliferationshastigheden af vores cellelinier i en p53-afhængig måde.
Disse data indikerer, at restaurering af
wtp53 ekspression i H295R og SW-13 cellelinier er ikke tilstrækkelig til at udøve en virkning på celleproliferation. Tilstedeværelsen af vildtype form af p53 synes at være afgørende for vækstinhibering af disse celler som respons på bestråling, som celler transficeret med tom vektor næsten ikke påvirkes ved denne behandling. Imidlertid
wtp53-udtrykkende celler inhiberes væsentligt.
SK-OV-3-celler, virkningen af IR er stærkere end i H295R og SW-13-celler, selv i prøver transficeret med tom vektor, tyder på, at denne cellelinie er mere følsomme over for bestråling end ACC cellelinier. Ikke desto mindre er den maksimale inhibering vækst nås, når vildtype form af p53 udtrykkes, hvilket indikerer, at dette protein er involveret i responset på IR i SK-OV-3-celler samt.
Stabilisering af p53 i respons for ioniserende stråling
Vildtype p53 overekspression blev vurderet ved RT-PCR og Western blotting. p53-niveauer signifikant forøget i H295R og SW-13 cellelinier ved 24 timer efter transfektion med pBABE-neo-p53 vektor og var maksimal ved 48 timer. Ved 72 timer fra transfektion, observerede vi et fald i p53-niveauer, som syntes at skyldes en reduktion i
TP53
mRNA, sandsynligvis på grund af tabet af transficerede vektorer (figur S2).
i celler transficeret med vildtype p53 underkastet IR behandling, virkningen på celleproliferation var stærkest efter 72 timer efter transfektion (48 h efter bestråling). Derfor blev ekspressionsniveauer af p53 evalueret ved RT-PCR og Western blotting i H295R, SW-13 og SK-OV-3-celler på samme tidspunkt.
Real Time RT-PCR-analyse bekræftede, at
TP53
gen er overudtrykt i alle prøver der var transficeret med pBABE-neo-p53-vektoren (figur 3, panel A, C, E), enten bestrålet eller ikke. Sammenlignet med mock,
TP53
mRNA var 5- og 3 gange mere udtrykt i H295R og SW-13 celler. Ifølge Yaginuma og Westphal [15], i SK-OV-3 celler, ingen
TP53
mRNA kunne påvises i mock prøver, i modsætning til celler transficeret med p53-vektor.
Expression niveauer af
TP53
og p53 protein evalueret af Real Time RT-PCR og Western blotting i H295R, SW-13 og SK-OV-3 celler 72 timer efter transfektion med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT) . Prøver blev behandlet med IR i en dosis på 6 Gy er angivet. (A) RT-PCR (øverst) og Real Time RT-PCR (nederst) analyse af
TP53
udtryk i H295R celler. Prøver transficeret med pBABE-neo-p53 vektor show 5 gange stigning i
TP53
mRNA sammenlignet med mock. (B) Western blotting-analyse af p53 i H295R celler (top) viste en større bånd af ~53 kDa (
wtp53) og en mindre bånd af ~44 kDa, svarende til den afkortede form af p53 (p53
Δ8 -9). Densitometri viser, at
wtp53 stabiliseres af IR behandling (nederst). (C) RT-PCR-analyse af
TP53
mRNA i SW-13-celler viser overekspression af genet i prøver transficeret med pBABE-neo-p53 vektor (øverst). Real Time RT-PCR-analyse viste en 3 gange stigning i
TP53
afskrift i prøver transficeret med p53 vektor. Ekspressionen af
TP53
ikke er moduleret med bestråling (nederst). (D) Niveauer af p53-protein i SW-13-celler betydeligt stige efter IR behandling i celler transficeret med pBABE-neo-p53 vektor, mens ingen ændring kan påvises i prøver transficeret med tom vektor. (E) I SK-OV-3-celler, ingen
TP53
transskript var påviseligt ved RT-PCR i prøver transficeret med tom vektor, mens i celler transficeret med pBABE-neo-p53 vektor et stærkt signal, svarende til
TP53
mRNA, er observerbare (øverst). Real Time RT-PCR-analyse viser ingen modulation af
TP53
udtryk efter bestråling (nederst). (F) Western blotting-analyse af p53 i SK-OV-3-celler afslørede et påviseligt bånd kun i prøver transficeret med pBABE-neo-p53 vektor (øverst). Densitometri viser, at p53-niveauer øges efter bestråling, hvilket indikerer en stabilisering af proteinet (nederst). Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.
GAPDH
vinculin blev brugt til normalisering. (*, P 0,05; #, p 0,01).
Selvom
TP53
mRNA niveauer blev højere i p53-transficerede celler, de ikke varierer mellem WT bestrålet og ikke -irradiated celler. Tværtimod p53 protein niveauer synes at være betydeligt højere i p53-transficerede celler udsat for IR behandling sammenlignet med de ikke-bestrålede dem. Faktisk i H295R celler niveauerne af vildtype p53 steg 3 gange med bestrålede WT-celler sammenlignet med p53-transficerede, ikke-bestrålede celler (figur 3, panel B). Imidlertid blev den endogene form af p53 (p53
Δ8-9) ikke moduleret af strålebehandling. SW-13-celler viste en 1,3 gange stigning i p53 i bestrålede WT prøver sammenlignet med WT (Figur 3, panel D), mens p53 var 1,5 gange højere hos bestrålede SK-OV-3-celler sammenlignet med ubehandlede celler (Figur 3, panel F).
Behandling af H295R og SW-13 celler med forskellige strålingsdoser (4, 6 og 8 Gy) bekræftede, at
TP53
mRNA-ekspressionsniveauer ikke var påvirket af IR (figur S3, panel A, C). Administrationen af en strålingsdosis på 4 Gy inducerede ikke en betydelig variation i p53 protein enten. Tværtimod blev p53 opreguleret efter administration af strålingsdoser på 6 og 8 Gy; imidlertid sås ingen signifikante ændringer mellem disse to doser (Fig S3, paneler B, D), hvilket viser, at IR behandling ved en dosis på 6 Gy er tilstrækkelig til at inducere en stabilisering af p53 i ACC cellelinier.
stigningen i p53 protein niveauet i bestrålede prøver ikke skyldes en stigning i
TP53
udtryk, da mRNA-niveauer ikke var påvirket af stråling. Dette kan forklares ved en aktivering af p53 ved IR, som oversætter i en stabilisering af dette protein kun i celler, der underkastes denne behandling. Stabiliseringen af p53 kan betragtes prædiktiv for dens aktivering, hvilket forklarer effekten på celleproliferation kun observeret i prøver, som modtog bestråling.
TUNEL analyse af celledød
Som p53 er en vel- kendt inducer af den apoptotiske proces i afhængighed af genotoksiske belastninger [19], [20], udførte vi en TUNEL-assay for at analysere tilstedeværelsen af apoptose i H295R, SW-13 og SK-OV-3-cellelinier transficeret med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT), enten bestrålet eller ikke.
Som forventet ingen tegn på apoptose var detekterbare i prøver ikke underkastet behandling med IR (data ikke vist). Apoptotisk celledød var også fraværende i bestrålede celler transficeret med tom vektor, hvorimod prøver, hvor vildtype form af p53 blev udtrykt syntes at være positive for TUNEL-farvning i alle cellelinjer (figur 4, panel A), hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af et funktionelt p53 er nødvendig til induktion af celledød som respons på stråleterapi.
H295R, SW-13 og SK-OV-3 cellelinier blev transfekteret med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT) og bestrålet i en dosis på 6 Gy. (A) TUNEL-assayet blev udført ved 48 og 72 efter transfektion. I alle cellelinjer, TUNEL-positive celler kan påvises kun i bestrålede prøver, der udtrykker vildtype form af
TP53
. Celler blev også farvet med Hoechst 33342 og derefter visualiseret med et fluorescens mikroskop ved en forstørrelse på 40 x. Viste figur repræsenterer tre forsøg udført in duplo. (B) Procentdel af apoptose i H295R, SW-13 og SK-OV-3 blev beregnet ved at sammenligne TUNEL-positive celler med totale celler, farvet med Hoechst 33342. Apoptosis stigninger i celler transficeret med p53 vektor sammenlignet med mock-bestrålede prøver, startende fra 48 timer siden transfektion og effekten styrker efter 72 timer. (*, P 0,05; #, p 0,01). (C)
BCL2
ekspression blev evalueret i H295R cellelinie ved RT-PCR. p53 restaurering inducerer en signifikant reduktion i
BCL2
ekspression ved 48 og 72 timer efter bestråling. (D) Inverted billeder i forhold til semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af
BCL2
genekspression udført på SW-13-celler, der viser en signifikant reduktion i
BCL2
signal i celler transficeret med p53- vektor efter ioniserende stråling behandling. (E) Virkningen af p53 restaurering på
BCL2
mRNA-niveauer som respons på bestråling blev evalueret i SK-OV-3 cellelinier. p53 hæmmer
BCL2
udtryk og effekten er stærkere på 72 timer efter transfektion. Billeder er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.
GAPDH
blev brugt til normalisering.
Apoptose kunne påvises ved 48 timer efter transfektion af
wtp53 og forøget ved 72 timer efter transfektion (48 timer efter bestråling) i alle celle linjer (Figur 4, paneler A, B, tabel S1). Apoptotisk celledød steget med 2,6 gange på 48 timer i bestrålede H295R celler transficeret med p53-vektor sammenlignet med celler transficeret med tom vektor (10,3%
vs
3,9%) (p 0,05) og med 4,4 gange ved 72 h (15,1%
vs
3,4%) (p 0,01) (Figur 4, panel B, tabel S1). Mindre-opdelte SW-13-celler viste også en 2 gange stigning i apoptose efter 48 timer (8,4%
vs
4,3%) (p 0,05) og en 3,7-fold stigning efter 72 timer efter transfektion (16,3 %
vs
4,4%) (p 0,01) i bestrålede WT prøve sammenlignet med bestrålede mock celler (Figur 4, panel B, tabel S1). Tilsvarende transfektion af tom vektor ikke i høj grad påvirke celledød i SK-OV-3 cellelinien enten, mens transfektion af
wtp53 signifikant forøget procentdelen af apoptotiske celler som reaktion på strålebehandling med 2 gange ved 48 timer (8,7%
vs
4,2%) og med 3,5 gange ved 72 timer (17,1%
vs
4,9%) (p 0,05) (Figur 4, panel B,. tabel S1)
Da mange rapporter vist, at p53 kan undertrykke
BCL2
ekspression som respons på et apoptotisk stimulus [21] – [23], analyserede vi
BCL2
mRNA-niveauer i celler behandlet med IR enten udtrykker vildtype form af
TP53
(WT) eller ej (mock), ved 48 timer og 72 timer efter transfektion. RT-PCR-analyse viste, at
BCL2
ekspressionsniveauerne faldt i bestrålede celler, når
wtp53 var til stede, mens de holdt stabil i prøver transficeret med tom vektor. I overensstemmelse med TUNEL analyseresultaterne,
BCL2
niveauer begyndte at falde startende fra 48 h og mindstekrav niveauer blev observeret ved 72 timer efter transfektion (Figur 4, panel C, D, E).
disse data bekræfter, at vildtype p53 er påkrævet til induktion af celledød ved apoptose og nedregulering af
BCL2
som reaktion på bestråling i H295R og SW-13-celler. Desuden fraværet af disse effekter i bestrålede celler, der udtrykker kun den endogene mutant p53 tyder på, at disse mutanter er ikke-fungerende proteiner er på ingen måde påvirket af IR behandling.
Effekt på
IGF2
udtryk
IGF-II er den vigtigste markør for ACC [24], [25] og dens udtryk er stramt reguleret af p53 [26], [27]. Da vi demonstreret, at
wtp53 er i stand til at reducere celleproliferation og inducerer apoptose i ACC cellelinier som respons på IR, vi også undersøgte virkningen af p53-aktivering på
IGF2
ekspression. RT-PCR-analyse af
IGF2
mRNA-ekspression i H295R celler (figur 5, panel A) viste, at bestråling ikke ændrede
IGF2
niveauer i prøver transficeret med tom vektor. Imidlertid
IGF2
ekspression blev reduceret ved 48 timer efter transfektion (24 timer efter bestråling) og dramatisk faldende ved 72 timer efter transfektion (-42%, p 0,01) i celler, der udtrykker vildtype p53
.
(a) Inverted billeder i forhold til semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af
IGF2
genekspression udført på H295R celler, som viser et massivt tab af
IGF2
signal i bestrålede celler på 72 h efter transfektion af p53-vektor (WT). (B) RT-PCR-analyse af
IGF2
mRNA niveauer udført på SW-13-celler. En betydelig reduktion i
IGF2
ekspression kan påvises i celler transficeret med p53-vektor (WT) efter ioniserende stråling behandling. Billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg.
GAPDH
udtryk blev brugt til normalisering og bands intensiteter blev kvantificeret ved hjælp ImageJ. Band densitometri er vist i de højre paneler. (*, P 0,05; #, s 0,01).
Lignende resultater blev observeret i SW-13-cellelinie (figur 5, panel B), selvom disse celler udtrykker meget lave niveauer af
IGF2
mRNA. Selv i dette tilfælde, ingen effekt på
IGF2
ekspression blev observeret efter IR administration i celler, der udtrykker endogen mutant p53, mens en stærk nedgang i
IGF2
mRNA-niveauer blev observeret i celler transficeret med
wtp53 vektor. Dette fald var maksimum på 72 timer efter transfektion (-35%; p 0,05).
Effekt på Akt aktivering
Endelig har vi undersøgt effekten af IR på Akt aktivering i H295R og SW -13 cellelinier enten transficeret med p53 vektor (WT) eller ej (mock). Dette protein, i virkeligheden er en primær nedstrøms effektor af IGF-II-signalvejen og en nøgle negativ regulator af den apoptotiske proces.
Western blotting-analyse af totalt Akt og dens phosphorylerede aktive form i H295R (figur 6 , panel A) og SW-13 (figur 6, panel B) celler afslørede, at Akt var til stede i alle prøver og blev ikke påvirket af
wtp53 ekspression (data ikke vist). Tværtimod densitometrisk analyse af p-Akt normaliseret til total Akt viste, at celler transficeret med p53-vektor viste et markant fald i Akt phosphorylering som reaktion på IR sammenlignet med kontroller, hvilket betyder, at p53-aktivering kan være i stand til at undertrykke aktiviteten af anti -apoptotic protein Akt.
(A) Western blotting-analyse af totale Akt og phosphorylerede Akt niveauer, udført på bestrålede H295R celler transficeret med tom vektor (mock) og p53-vektor (WT) ved 48 og 72 timer efter transfektion. Densitometrisk analyse af Akt normaliseret til vinculin og p-Akt
versus
Akt viser, at Akt ekspression ikke påvirkes af p53 status, mens den aktiverede form af proteinet reduceres væsentligt i
wtp53-udtrykkende celler. (B) Samlet cellelysater opnået fra SW-13-cellelinje blev udsat for vestlige blotting analyse ved anvendelse af antistoffer rettet mod Akt og Akt-pSer473. Phosphoryleringsniveauerne af Akt er væsentligt reduceret ved p53 stabilisering som reaktion på behandling med ioniserende stråling. De viste resultater er repræsentative for mindst tre eksperimenter. Bands ‘intensiteter blev kvantificeret ved hjælp ImageJ og bånd’ densitometri er vist i de rigtige paneler. (*, P 0,05; #, p 0,01).
I henhold til vores data vedrørende celleproliferation og apoptose, effekten på Akt fosforylering var tydelig ved 48 timer efter transfektion (-16% i H295R og -17% i SW-13 celler, henholdsvis) og var maksimum på 72 timer efter transfektion (-53% i H295R og -51% i SW-13 celler; p. 0,01)
diskussion
ACC er en aggressiv og heterogen malignitet og de fleste af terapeutiske muligheder er ofte forgæves, hvilket viser, at der er brug for alternative terapeutiske strategier for ACC [8], [9].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.