PLoS ONE: Humant choriongonadotropin β inducerer migration og invasion via Aktivering ERK1 /2 og MMP-2 i Human Prostata Cancer DU145 celler

Abstrakte

Vi har tidligere vist, at humant choriongonadotropin β (hCGp) induceret migration og invasion i humane prostata kræftceller. Men de involverede molekylære mekanismer er uklare. Her har vi etableret en stabil prostatacancer-cellelinie overudtrykker hCGp og testet hCGp-udløst signalveje forårsager cellemigration og invasion. ELISA viste, at hCGp mængde udskilt i mediet forøget med kultur tid efter hCGp-transficerede celler blev inkuberet i 3, 6, 9, 12 og 24 timer. Mere, hCGp standarder fremmes MAPK (ERK1 /2) phosphorylering og øget MMP-2-ekspression og aktivitet i både dosis- og tidsafhængige opførsel i hCGp ikke-transficerede celler. Desuden hCGp fremmes ERK1 /2 phosphorylering og øget MMP-2-ekspression og aktivitet betydeligt i hCGp transficerede DU145-celler. Betragtninger ERK1 /2 blokker PD98059 (25 uM) signifikant nedreguleret phosphoryleret ERK1 /2 og MMP-2. Især hCGp forfremmet celle migration og invasion, men det PD98059 mindsket hCGp-induceret celle motilitet under disse betingelser. Disse resultater indikerede, at hCGp induceret cellemotilitet via fremme ERK1 /2 phosphorylering og MMP-2 opregulering i human prostatacancer DU145 celler

Henvisning:. Li Z, Li C, Du L, Zhou Y, Wu W (2013 ) Humant choriongonadotropin β inducerer migration og invasion via Aktivering ERK1 /2 og MMP-2 i human Prostata Cancer DU145 Cells. PLoS ONE 8 (2): e54592. doi: 10,1371 /journal.pone.0054592

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Juni 11, 2012; Accepteret: December 14, 2012; Publiceret: 12 feb 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af videnskab og udviklingsplan for Beijing uddannelsesudvalg (tilskud nummer: KM200910025008) og National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer: 81.272.843). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de mest almindeligt diagnosticerede kræftformer og den sjette hyppigste dødsårsag hos hannerne i verden [1]. I øjeblikket er de vigtigste metoder til behandling af prostatacancer er radikal prostatektomi, ekstern strålebehandling, brachyterapi, systemisk androgen deprivation terapi og kemoterapi, etc. [2] – [6]. Men den terapeutiske virkning er utilfredsstillende. Udvikling af ny behandling såsom molekylær terapi er nødvendig til behandling af prostatacancer. Men karakterisering af de molekylære mekanismer, der forårsager prostatakræft er grundlag for at etablere en ny terapi. Hvis vi bestemme de terapeutiske molekylære mål, der bidrog til prostatakræft først, så kan vi behandle patienter via målrette disse tumormarkører at hæmme prostatakræft, yderligere at forbedre prognosen og sænk dødelighed.

human chorion gonadotropiner (hCGs) er heterodimere glycoproteiner udskilles af trofoblastiske celler i normal graviditet. HCGs har et par isoformer indeholder intakt hCG, hCGα, hCGp, hyperglycosylerede (hCGh), hakkede (hCGn) og kerne fragment af hCGp (hCGβcf) [7]. HCGp er et molekyle med selvstændig funktion. Det er blevet vist, at fri hCGp er en potentiel tumormarkør produceres af en lang række tumorer [8] – [10]. Vi har tidligere rapporteret, at hCGp faldt E-cadherin ekspression fører til migration og invasion i prostatacancerceller [11]. Men de involverede hele mekanismer er ikke klare.

Ekstracellulær signal-reguleret kinase1 /2 (ERK1 /2) aktivering er blevet impliceret i carcinogenese og cancer progression. Øget ERK1 /2-aktivitet fremmer cancercelleproliferation og metastase i forskellige cancercellelinier [12] – [15]. ERK1 /2 blocker, PD98059 resulterede i en reduktion af cellevækst og invasivitet i prostatacancer. I MA-10 Leydig celler, hCG udløste forbigående ERK1 /2-aktivering via opstrøms protein kinase A (PKA) [12]. Desuden hCG inducerer også ERK1 /2 fosforylering i en PKA-uafhængig måde endometrium og er involveret i carcinogenese [13], [14]. Desuden er der tegn på, at matrixmetalloproteinaser (MMP) udtryk blev reguleret af ERK1 /2 i invasive karcinomer. Undersøgelser viste, at aktiveret ERK1 /2 reguleres aktiviteten af ​​MMP’er fører til ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning og cellemotilitet [13] – [15]. Mange MMP’er anses som væsentlige proteaser i ECM-nedbrydning og remodellering [16]. Rapporten viste, at hCG stimuleret sekretion af MMP-2 og MMP-9 i en dosis-afhængig måde i cytotrophoblastic celler [17]. Endvidere hCG opreguleret MMP-2-aktivitet og fremmes celle motilitet i SGHPL-5 cellelinjer [18]. Ved human prostatacancer, forbedret MMP-2 og MMP-9-aktivitet bidrog til tumorinvasion og metastase [19] – [21]. Undersøgelser viste, at D-vitamin og D-vitamin-analog ZK191784 nedreguleret MMP’er at inhibere invasion i prostatacancer [22] – [24]. Utvivlsomt, MMP’er er de vigtige anti-invasion mål. Derfor foreslår vi, at hCGp kan øge ERK1 /2 phosphorylering og yderligere opregulere MMP’er at fremme celle motilitet.

Derfor her vi vil undersøge hCGp-udløst signalveje og forbindelsen mellem hCGp udtryk og celle motilitet. Gennem denne undersøgelse, håber vi, at vi vil finde nye spor i molekylær terapi til behandling af prostatacancer.

(A) Kvantitativ analyse af hCGp mRNA og β-actin mRNA transskription i DV og DH celler ved Real-time PCR . DV: DU145 celle transficeret med tom vektor; DH: DU145 celler transficeret med hCGp cDNA-konstruktionen. Bemærk at hCGp mRNA blev højt udtrykt i forhold til kontrol. (B) Analyse af hCGp proteinekspression ved Western blot. β-actin blev anvendt for lige lastning og normalisering. Resultaterne indikerede, at hCGp blev højt udtrykt i DH-celler. * Angiver

P 0,05

versus kontrol DV celler. Data blev vist som middelværdi ± SEM fra tre separate forsøg.

Materialer og metoder

Materialer

hCGp standarder blev indkøbt fra Abcam (Hong Kong). Konstruktionen pVSneo-hCGp indeholdende hCGp cDNA blev anskaffet fra Stratagene (La Jolla, CA). Restriktionsenzymer Sall, Xhol, EcoRI, BamHI, HindIII og T4 DNA-ligase, kompetente celler er de produkter af Invitrogen (Carlsbad, CA). G418 og krystalviolet blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Human prostatacancer DU145 og PC3 (som en backup) celler blev produkterne af American Typisk Culture Collection (Rockville, MD). Celler blev dyrket i DMEM-medium (Hyclone) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C, 95% luft og 5% CO

2. Transwell plader med indre indsætter eller kunstige basalmembraner blev købt fra BD Biosciences (Bedford, MA). Anti-hCGp var fra BioDesign International (Saco, ME); anti-ERK1 /2, anti-phospho-ERK1 /2 og anti-MMP-2 blev købt hos Cell Signaling Technology, Inc (Shanghai, Kina).

Transfektion

Via transfektion, vi etableret en stabil cellelinie overudtrykker hCGp i DU145-celler. Kontrolvektoren pVSneo-vektoren blev fremstillet ved at skære hCGp cDNA med restriktionsenzymer først og derefter autoligering som tidligere [11] beskrevne. Celler blev podet i seks-brønds plader med DMEM vækstmedium. Når cellerne kommer til 90% konfluens, blev konstruktionerne indeholdende pVSneo-hCGp eller pVSneo-Vector transficeret i DU145-celler efter FuGene HD transfektionsreagens (Roche, USA) og producentens instruktioner. Efter at cellerne var inkuberet ved 37 ° C i 48 timer blev cellerne fordøjet af trypsin-EDTA og dyrket i selektionsmedium indeholdende G418 (1,2 mg /ml). Endvidere blev celler inkuberet i yderligere to uger. Cellerne uden integration af hCGp gen var døde og flyder på mellemlang og de enkelte kolonier, der stabilt udtrykker hCGp blev indsamlet. De screenede celler blev dyrket i selektionsmedium (600 ug /ml G418) i yderligere to uger, indtil ingen døde celler blev fundet. De udvalgte celler blev holdt i medium indeholdende 600 ug /ml G418 for yderligere test. Vi lykkedes at etablere de stabile cellelinier i tidligere arbejde [11]; her brugte vi en ny transfektionsreagens at forbedre transfektionseffektiviteten.

Real-time PCR

Celler blev dyrket som den rutinemæssige procedurer i dyrkningsmediet. Derefter blev total RNA isoleret ved anvendelse TriZol Reagent (Invitrogen, USA). HCGp cDNA blev fremstillet ved anvendelse af revers transkriptase (Takara, Kina) med 1,5 ug totalt RNA efter fabrikantens anvisninger. Real-time PCR blev udført på en Stratagene Mx3000P instrument. For real-time termisk cykling blev tredobbelte alikvoter af cDNA anvendes i en reaktionsblanding indeholdende 250 nM af hver primer i et reaktionsvolumen på 25 pi af PrimeScriptTM RT reagens (Takara, Kina). PCR cycling program blev kørt med en indledende prædenaturering ved 94 ° C i 60 s, derefter med en 40 cyklus af amplifikationstrinnene, ved 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s, 72 ° C i 20 s. Primerne var som følger:

hCGp (frem): 5′-TCTGTGCCGGCTACTGCCCC-3 ‘;

hCGp (omvendt): 5′-TTGGGACCCCCGCAGTCAGT-3′;

β-actin (frem): 5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG -3 « . Β

β-actin (tilbage): 5′-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3 ‘

Der blev indsamlet og analyseret efter producentens manual instruktion

ELISA

..

hCGp er et udskilt protein, som kan interagere med nogle receptorer, såsom luteiniserende hormon-receptor, etc. til at spille en rolle i udløsningen signalvejene. Derfor er vi nødt til at sørge for, at udtrykt hCGp blev udskilt i celle medium. Efter de stabile DU145 celler blev dyrket til 70% kon fl uency i vækstmediet blev cellerne vasket tre gange med serumfrit DMEM-medium. Derefter blev cellerne dyrket i serum-frit DMEM medium ved 3, 6, 9, 12 og 24 timer. Mediet blev opsamlet ved angivne tidspunkter, og ELISA blev udført for at teste udskilt hCGp via en β-hCG ELISA-kit (DRG Diagnostics, New Jersey, USA) ved at følge fabrikantens instruktion. I den tidligere undersøgelse, lykkedes det os at påvise hCGp sekretion i hCGp transfekterede celler via en hCGp afsløring Kit, F-hCGp ccubind ELISA, fra Monobind (Costa Mesa, CA) [11]. For at reproducere og bekræfte disse resultater, vi anvendte en β-hCG ELISA-kit til bestemmelse hCGp sekretion.

immunblotting

Efter at DU145-celler blev dyrket i den krævede tid, blev celler opsamlet og lyseret med lyseringsbuffer (25 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoxycholat og proteasehæmmere, Thermo Scientific, USA). Cellelysatet blev centrifugeret ved 18.000 g i 20 minutter. Totale proteinkoncentrationer blev testet ved BCA Protein Assay Kit (Invitrogen). Firs mikrogram protein blev sat på 10% SDS-PAGE geler, der løber i påkrævet tid, afhængigt af molekylvægten, derefter overført til nitrocellulosemembraner via halvtørre overførsel. Membranerne blev blokeret i 1,5% BSA i TBS-T puffer i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrystning, derefter blev inkuberet med primære antistoffer separat, ved 4 ° C, natten over. Efter vask med TBST 3 × 10 minutter hver, blev membranerne probet med fl uorescence-mærket sekundært antistof (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske blev membranerne scannet i 700 eller 800 kanaler ved hjælp Odysseen Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, NB, USA). β-actin blev anvendt for lige lastning og normalisering. Antistoffer blev fortyndet på passende vis.

gelatinezymografi

Efter ERK1 /2 blokker PD98059 (25 uM) blev påført til behandling DU145-celler i 2 timer, ændrede vi 10% føtalt bovint serum DMEM-medium i serum-frit medium, og dyrket i 24 timer. Medium med udskilt hCGp blev opsamlet fra et lige antal celler og blandet med lige store mængder af ikke-reducerede prøve buffer. De lige volumener af medium blev elektroforesebehandlet på 10% SDS-polyacrylamidgeler indeholdende 1 mg /ml gelatine som et protease-substrat. Gelen blev vasket i 2,5% Triton X-100-opløsning ved stuetemperatur under forsigtig omrøring og blev gennemvædet i bufferen (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,2 M NaCI, 5 mM CaCI

2 · 2 H

2O, og 0,02% Brij-35, pH 7,6) ved 37 ° C i 42 timer. Efter inkubation blev gelen farvet i 30 minutter med farveopløsning (0,5% Coomassie Brilliant Blue, 25% isopropanol og 10% eddikesyre). Så den farvede gel blev affarvet med et passende Coomassie R-250 Affarvningsopløsningen (50% methanol, 10% eddikesyre). I området med matrixmetalloproteinaser, vil klare bånd mod en mørk blå baggrund dukke op. At vise lige påsætning blev en parallel SDS-gel kørt for at teste MMP-2 og β-actin via Western blot.

cellemotilitet assays

Prostatacancer cellemigrering blev gjort i en 24-brønds plade med indre kammer; kammerbunden har 8 um porer. I alt 1 × 10

5-celler blev podet i det øvre kammer med 500 pi serum-frit medium, og 1 ml DMEM medium med 10% føtalt bovint serum blev tilsat i det nederste kammer. Efter at cellerne blev dyrket i 6 timer blev cellerne på den øvre kammer fjernes med en vatpind. De migrerede celler (eller pseudopodia) i bunden af ​​kammeret blev fikseret med 100% methanol i 10 minutter ved -20 ° C og derefter farvet med 0,5% krystalviolet opløsning ved stuetemperatur i 10 min. Efter flytning væk krystalviolet opløsning blev cellerne skyllet med destilleret vand, indtil ingen overskydende farvestof blev vist. De migrerede celler eller pseudopodia blev fotograferet og talt fra 5 tilfældigt udvalgte områder; billederne blev fotograferet med kamera med en Leica DM IRB mikroskop ved × 200 forstørrelse. Invasion assay blev udført ved tumorinvasion System (8 um porestørrelse, BD BioCoat). Bunden af ​​celledyrkningsinsert blev belagt med kunstig basalmembran overtrukket med matrigel. Basalmembranen er tynde ekstracellulære matrix underliggende epitelceller. Matrigel er et kommercielt produkt ekstraheret fra en muse sarkom rig på ekstracellulære matrixproteiner. Hovedbestanddelen er laminin, efterfulgt af kollagen IV og heparinsulfat-proteoglycaner. De andre procedurer er de samme som i migration analysen.

Statistisk analyse

Data blev variansanalyse med posttests til sammenligning blandt særlige grupper. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM og analyseret for statistisk signifikans ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA). Bonferroni-metode for flere sammenligninger mod en enkelt gruppe blev brugt.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Det mindste antal gentagne forsøg var 3.

Resultater

hCGp Expression

Først vi konstrueret en kontrol vektor som tidligere beskrevet; derefter DU145-celler blev transficeret med konstruktioner med eller uden hCGp cDNA. Efter etablering af stabile cellelinier, blev celler opretholdt i medium indeholdende 600 ug /ml G418 til yderligere undersøgelser. For at teste hCGp ekspression i transficerede DU145 celler, blev både real-time PCR og Western blot anvendes til at bestemme mRNA og proteinekspression efter at cellerne blev inkuberet i 24 timer, henholdsvis (Figure1A, Figure1B). Disse resultater viste, at hCGp blev højt udtrykt i både mRNA og protein niveauer versus tomme vektor transficerede DU145 (DV) celler. Enten hCGp mRNA eller protein beløb var lidt i kontrol celler under disse eksperimentelle betingelser

HCG Sekretion

ELISA viste, at hCGp blev udskilt i mediet voldsomt i 24 timer.; beløbet var op til 150 ng /ml (Figur 2). Mængden af ​​hCGp sekretion blev forøget med inkubationstid. Bemærk, at vi etableret en stabil cellelinie overudtrykker hCGp. HCGp kan spille en vigtig rolle i signalering mellem ekstracellulære og intracellulære kommunikation.

Data viste, at der var hCGp udskilles i cellemediet. Desuden er omfanget af hCGp secerneret i mediet forøget med tid efter hCGp transficerede celler blev inkuberet i 3, 6, 9, 12 og 24 timer.

hCGp Aktiveret ERK1 /2

hCGp standarder blev anvendt til behandling af ikke-transficerede DU145 celler ved doser på 25, 50, 100 og 200 ng /ml i 24 timer, viste Western blot, at ERK1 /2-ekspression blev øget efter en dosisafhængig tendens, og ERK1 /2 phosphorylering kom at toppe med en behandling 200 ng /ml hCGp (figur 3A). Følgelig behandlede vi cellerne ved 0 (CON, kontrol), 5, 15, 30 og 60 minutter for at bestemme ERK1 /2 phosphorylering. Resultaterne viste, at ERK1 /2 phosphorylering fulgte en tidsafhængig måde og kom til top ved 30 min på behandling med 200 ng /ml hCGp (figur 3B). Desuden blev ERK1 /2 phosphorylering findes signifikant højere i hCGp transficerede DU145 (DH) celler end kontrolceller. Imidlertid PD98059 (25 uM), en specifik blokker, forhindrede ERK1 /2 phosphorylering signifikant versus ubehandlede celler (figur 3C). Bemærk, at hCGp forårsagede ERK1 /2-aktivering efter dosis- og tidsafhængige manerer.

(A) Vi har vist, at koncentrationen af ​​200 ng /ml hCGp standarder induceret celle invasion [11]. Således her behandlede vi ikke-transficerede DU145-celler med forskellige doser af 0, 25, 50, 100, og 200 ng /ml hCGp i 1 time. Western blot viste, at hCGp standarder phosphoryleret ERK1 /2 i en dosisafhængig tendens. Ved en koncentration på 200 ng /ml, ERK1 /2-aktivering nået toppen. (B) Ikke-transficerede DU145 celler i serum-frit medium blev behandlet med 200 ng /ml hCGp i 0, 5, 15, 30 og 60 min. Western blot viste, at hCGp aktiveret ERK1 /2 i en tidsafhængig måde. På det tidspunkt af 30 min, ERK1 /2 fosforylering nået toppen og derefter gik ned. (C) Cellerne blev forbehandlet med PD98059 (25 uM) 30 minutter og derefter inkuberet i 24 timer i serumfrit medium, viste Western blot, at hCGp aktiveret ERK1 /2, men PD98059 faldt ERK1 /2-aktivering. * Angiver

P 0,05

versus DV. Data blev vist som middelværdi ± SEM fra tre separate forsøg.

hCGp induceret MMP-2 ekspression via Aktivering af ERK1 /2

MMP-2 blev demonstreret at være involveret i kræftcellen migration og invasion. Her undersøgte vi hCGp-induceret MMP-2-ekspression i hCGp ikke-transficerede DU145 celler. HCGp standarder blev tilsat til serum-frit medium i doser på 0 (CON, kontrol), 25, 50, 100 og 200 ng /ml. Western blot viste, at hCGp øget MMP-2-ekspression på dosisafhængig måde blev MMP-2-ekspression øges at toppe, når de behandles med 200 ng /ml hCGp (figur 4A). Endvidere har vi behandlet af cellerne med PD98059 (25 uM), viste resultaterne, at MMP-2-ekspression i DH-celler bemærkelsesværdigt blev nedreguleret (figur 4B), hvilket indikerer, at MMP-2 opregulering skyldtes ERK1 /2 phosphorylering.

(a) Vi behandlede ikke-transficerede DU145 celler med 0, 25, 50, 100, og 200 ng /ml hCGp i 1 time, Western blot viste, at hCGp standarder opreguleret MMP-2 på en dosis-afhængig måde, ved koncentrationen 200 ng /ml, MMP-2-ekspression nået toppen. (B) Vi behandlede DH og DV-celler med eller uden PD98059 (25 uM) 30 min og derefter inkuberet i 24 timer med serum-frit medium, viste Western blot, at hCGp opreguleret MMP-2-ekspression og PD98059 afskaffet dem stigning. Størrelserne for pro-MMP-2 og aktiv-MMP-2 er 72 Kd og 64 Kd henholdsvis. * Angiver

P 0,05

versus kontrol. Data blev vist som middelværdi ± SEM fra tre separate forsøg.

hCGp Forøget MMP-2 aktivitet via Aktivering af ERK1 /2

gelatinezymografi assay viste, at MMP-2-aktivitet blev reduceret ved PD98059 (25 uM) (figur 5), hvilket indikerer, at hCGp aktiveret MMP-2 via ERK1 /2 phosphorylering.

Vi indsamlede den betingede medium fra den ovennævnte behandling var for geltin zymografi assay som fremgangsmåderne. Resultaterne viste, at hCGp øget MMP-2-aktivitet og PD98059 reduceret disse virkninger. * Angiver

P 0,05

versus kontrol. Data blev vist som middelværdier ± SEM fra tre separate forsøg. Den nederste panel af gel billederne viste en lige belastning, at en parallel SDS-gel blev kørt til at teste β-actin via Western blot.

hCGp Øget Cell motilitet via ERK1 /2 Phosphorylering

i den tidligere undersøgelse, vi demonstreret, at hCGp induceret prostatacancer cellemigration og invasion. I den foreliggende undersøgelse yderligere bekræftet vi, hvordan hCGp induceret celle vandrende og invasive adfærd. At vide, om hCGp induceret celle motilitet skyldtes ERK1 /2 fosforylering blev migrations- og invasion analyser udføres enten med eller uden PD98059 (25 uM). De nøjagtige metoder var som beskrevet i fremgangsmåderne. Resultaterne viste, at hCGp væsentligt forøget både celle migration og invasion; men PD98059 faldt betydeligt disse virkninger (figur 6A, 6B). Bemærk at hCGp nøjagtigt accelereret cellemigration og invasion via ERK1 /2 phosphorylering.

(A) Vi podet 1 x 10

5 celler i en 24-brønds plade med celleindsatsene, cellerne blev tilsat /uden PD98059 (25 uM) i 6 timer for at detektere cellemigrering, viste resultaterne, at hCGp fremmer cellemigration betydeligt i forhold til kontrol. (B) I de samme betingelser inkuberede vi cellerne i invasionen kammer med kunstig basalmembran blev cellerne tilsat med /uden PD98059 (25 uM) i 12 timer for at detektere celleinvasion, viste resultaterne, at hCGp fremmer celleinvasion betydeligt. Alle procedurer blev udført som beskrevet i Methods. * Angiver

P 0,05

versus kontrol. Data blev vist som middelværdi ± SEM fra tre separate forsøg.

Diskussion

Prostatakræft tegner sig for 29% af alle kræfttilfælde hos mænd [25]. Prostatacancerceller har en slående tendens til metastase, og metastase er den største årsag til dødelighed for kræftpatienter [26]. Derfor er det nødvendigt at finde og karakterisere de molekylære mål at inhibere invasion og metastase via gen-targeting.

hCGp er en væsentlig markør for malign transformation. Næsten hver human cancer producerer hCGp til en vis grad [27]. Undersøgelser viste, at hCGp fremmer kræft celledeling og måske også fremme metastaser. For eksempel Laurence A Cole opdagede at hCGp kan konkurrere med en TGFp at binde en TGFp-receptor, som en TGFp-receptor antagonisme for at kontrollere apoptose og fremme invasion ved aktiverende metalloproteinaser [28]. Viste en anden rapport også, at hCGp og VEGF spiller en koordineret rolle gennem deres angiogene og invasive egenskaber i udviklingen af ​​Barretts adenokarcinomer [29]. Gennem de ovenstående resultater kan vi udlede, at hCGp kan spille en vigtig rolle i cancer-fremmende via flere signalveje. Således er det vigtigt at undersøge hCGp-udløst signaleringsveje i tumor migration og invasion.

I den tidligere undersøgelse har vi påvist, at hCGp ændret cancercelle morfologi, accelererer cellemotilitet, nedregulere migration-inhiberende protein E-cadherin, fremme menneskelig prostatakræft migration og invasion [11]. Men for at de yderligere mekanismer forårsage migration og invasion holde ukendt. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at nogle signalveje var relateret til migration og invasion. Her har vi vist, at hCGp opreguleret ERK1 /2 og MMP-2, der fører til celle migration og invasion. Brug af ERK1 /2 phosphorylering blocker PD98059, opdagede vi, at MMP-2 opregulering skyldtes ERK1 /2 phosphorylering. ERK1 /2 har vist sig at bidrage til tumor formering, migrering og metastase, og flere undersøgelser rapporteret, at hCG fremmet ERK1 /2-aktivering i nogle celletyper [30], [31]. Naturligvis er disse resultater er i overensstemmelse med vores resultater, at hCG inducerede ERK1 /2 phosphorylering på en dosis- og tidsafhængige opførsel i DU145-celler. Den ERK relateret pathway er en af ​​de mest kritiske signalveje i tumor forekomst, udvikling og klonal ekspansion. Især MMP-2 er den vigtigste molekyle i tumorinvasion. Vores resultater der hCGp aktiverede MMP-2 via ERK1 /2 phosphorylering i DU145-celler er meget vigtige. Disse resultater ikke kun afsløret forholdet mellem hCGp og kræft, men også tilkendegivet, at vi fandt en ny nøgle vej til at hæmme kræft. Naturligvis hCGp /ERK1 /2 /MMP-2 reaktionsvejen er afgørende i tumorinvasion, i det mindste i prostatacancer. Med andre ord fandt vi mere anvendelige modeller til at inhibere tumor invasion, og yderligere vi kan udvikle molekylære target lægemidler.

hCG er sammensat af to underenheder, hCGα og hCGp. Disse to enheder gør en kompleks, der binder til luteiniserende hormon-receptor og udløser signalveje. Men vi ved ikke, om hCGp også binder sig til luteiniserende hormon receptor separat. Denne undersøgelse gav os den nye clue og vil skubbe os at karakterisere hCGp specifik receptor.

Desuden blev MMP’er anses for at være metastase-fremmende molekyler med mange slags isoformer. De har potentialer til at nedbryde den ekstracellulære matrix og basalmembranen. MMP-2 har været impliceret at være et centralt medlem i MMP. Mere, ERK1 /2 kan translokere til kernen og aktivere nogle transkriptionel faktor AP-1 til at regulere gentranskription [32]. AP-1 lokaliserer i MMP-2-promotorområdet af MMP-2-genet, således, ERK1 /2 kan fremme MMP-2-transkription og slip [33], [34]. Derfor, for at undersøge den rolle, ERK1 /2 i reguleringen af ​​cellemigrering og invasion, vi med succes bestemmes MMP-2-ekspression og aktivitet. Vi fandt, at hCGp signifikant forøget MMP-2-ekspression og aktivitet. Disse effekter blev bemærkelsesværdigt undertrykt af PD98059 i hCGp transficerede DU145 celler. Disse resultater viste en krydstale mellem ERK1 /2 og MMP-2. Coincidently, vi fandt også, at hCGp fremmet ERK1 /2 phosphorylering og MMP-2-ekspression efter den samme dosis og tid mønstre. Disse resultater viste, at hCGp udløste ERK1 /2-aktivering resulterede i MMP-2 opregulering og øget MMP-2-aktivitet. Følgelig hCGp-forårsaget migration og invasion skyldtes ERK1 /2-aktivering. Vi har dog ingen tilstrækkelig dokumentation om hCGp-forårsaget MMP-2 opregulering spiller en stor rolle i migration og invasion. Transfektion med MMP-2-konstruktion og banke ud af MMP-2 studiet kan bidrage til at besvare disse spørgsmål. Yderligere karakterisering af hCGp signalering vil hjælpe os til at finde flere metastase markører til at opfylde de terapeutiske krav.

Faktisk nogle eksperter har startet forskning hCGp relaterede antistoffer inden for kræft [35], [36]. Her afslørede vi, at hCGp phosphoryleret ERK1 /2 og længere opreguleret MMP-2 for at øge kræft motilitet i prostatacancerceller. Vores resultater kan give ny indsigt i de molekylære mekanismer i hCGp regulering, og giver et stærkere grundlag for hCGp forskning på tumor suppressor agent.

Vi fandt et par nye molekylære mål at hæmme invasion og metastase af prostata kræft. Effektiv behandling af prostatacancer er af stor betydning. Blokering hCGp signalering er en potentiel terapeutisk strategi til behandling af prostatacancer og andre kræftformer. Yderligere arbejde har brug for at karakterisere hCGp receptor; udvikling af hCGp signalering blokkere vil være en potentiel felt til at sænke invasion og metastase.

Tak

Vi takker Dr. Ameae Walker, University of California, Riverside for hendes venlige retning i det oprindelige projekt design . Vi takker også Dr. Tao Jiang, Tiantan Hospital, Capital Medical University for hans hjælp i forsøgene.