PLoS ONE: klonal ekspansion Analyse af transposoninsertioner af High-Throughput Sequencing Identificerer Candidate Cancer Gener i en PiggyBac mutagenese Screen

Abstrakt

Somatisk transposon mutagenese i mus er en effektiv strategi til at undersøge de genetiske mekanismer tumorigenese. Identifikationen af ​​tumor kørsel transposoninsertioner kræver traditionelt generation af store tumor kohorter at indhente oplysninger om almindelige indsættelse sites. Tumor kørsel insertioner er også karakteriseret ved deres klonal ekspansion i tumorvæv, et fænomen, der fremmes af den langsomme og udviklende transformering af transposon mutagenese. Vi beskriver her en forbedret metode til påvisning af tumor køre indsættelser, der vurderer klonal ekspansion af indrykninger ved at kvantificere den relative andel af sekvens læser opnået i individuelle tumorer. Til dette formål har vi udviklet en protokol til indsættelse websted sekvensering, der udnytter akustisk klipning af tumor-DNA og Illumina sekventering. Vi analyserede forskellige solide tumorer genereret af PiggyBac mutagenese og for hver tumor 10

6 læser svarende til 10

4 insertionssteder blev opnået. I hver tumor, 9 til 25 indrykninger stod ved deres beriget sekvens læse frekvenser sammenlignet med frekvenser opnået fra halen DNA kontroller. Disse beriget indsættelser er potentielle klonalt udvidede tumor kørsel indsættelser, og dermed identificere kandidat cancer gener. De kandidat cancer gener af vores undersøgelse omfattede mange etablerede cancer gener, men også nye kandidatgener såsom Mastermind-like1 (

Mamld1

) og Diacylglycerolkinase delta (

Dgkd

). Vi viser, at klonal ekspansion analyse af high-throughput sekventering er en robust tilgang til identifikation af kandidat cancer gener i insertionsmutagenese skærme på de enkelte tumorer

Henvisning:. Friedel RH, Friedel CC, Bonfert T, Shi R, Rad R, Soriano P (2013) klonal ekspansion Analyse af transposoninsertioner ved High-Throughput Sequencing Identificerer Candidate Cancer Gener i en PiggyBac Mutagenese Screen. PLoS ONE 8 (8): e72338. doi: 10,1371 /journal.pone.0072338

Redaktør: Andrew C. Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 4, 2013; Accepteret: 8 jul 2013; Udgivet: August 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Friedel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud HD24875 fra National Institute of Child Health and human Development til PS, som udviklingsmidler fra Tisch Cancer Institute, Mount Sinai School of Medicine, til RF og P. S., og ved DFG tilskud FR2938 /1-1 til C.F. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Somatisk mutagenese af DNA transposoner i mus undersøger de underliggende genetik tumorigenese. Transposoner huser gen-aktiverende eller gen-trapping kassetter kan aktivere onkogener eller afbryde tumorsuppressorer, for derved at drive tumorvækst [1]. Ud over deres rolle i at opdage nye cancer gener, transposon mutagenese letter også mere detaljerede undersøgelser af genetiske og cellulære mekanismer i tumorigenese ved at udnytte sensibiliserende baggrund mutationer og celletype-specifik transposon aktivering [2]. To transposon systemer er blevet brugt med held i kræft skærme i musen: Sleeping Beauty [2-4] og PiggyBac [5,6]. Transposon insertionssteder identificeres ved sekventering junction fragmenter af transposon ender og flankerende genomisk DNA. Tumor kørsel kandidat cancer gener identificeres derefter ved fælles insertionssted (CIS) analyse, en proces med kortlægning insertioner af multiple tumorer og analyse af gener, der almindeligvis ramt i uafhængige prøver. CIS analyse har vist sig at være en vellykket tilgang til identifikation af kandidatgener, men det kræver et betydeligt antal tumorprøver (50-100 i de fleste undersøgelser), og det leverer meget lidt information om mutationen mønstre i individuelle tumorer.

En vigtig egenskab ved transformation ved transposoner er den kontinuerlige tilvejebringelse i og ud af insertionssteder. Denne mekanisme letter positiv selektion og klonal udvidelse af tumor-drivende indsættelser under tumor udvikling over neutrale passager indrykninger. Klonal ekspansion af transposoninsertioner kan vurderes ved at analysere de relative andele af sekvens læser opnået fra insertioner i individuelle tumorer. Imidlertid har tidligere transposon tumor skærme ikke udnyttet klonal ekspansion analyse, sandsynligvis på grund af begrænsninger i antallet af sekvensen læser opnået ved 454 Pyrosekventering fremgangsmåde, der anvendes i disse undersøgelser. Desuden standard protokoller for tumor DNA-fremstilling involverer fragmentering ved restriktionsfordøjelser, som indfører bias for insertioner repræsenteret ved kortere restriktionsfragmenter, der er mere effektivt amplificeret ved PCR [7]. En alternativ metode til DNA-fragmentering, akustisk klipning, kan reducere PCR bias, da hver indstiksstedet er repræsenteret ved et sæt af fragmenter med lignende område længde [8].

For at opnå en forbedret kvantitativ repræsentation af indsættelsessteder ved deres sekvens læse tal, vi kombineret to tekniske fremskridt i de seneste rapporter – Illumina sekventering at opnå 10

6 læser per prøve [7], og akustisk klipning at reducere PCR bias [7,8] – og udviklet en protokol for effektiv high-throughput sekventering af transposoninsertioner. Vi ansøgte vores protokol til analyse af elleve forskellige solide tumorer, som vi havde genereret ved mutagenese med PiggyBac transposon vifte ATP1-S2 [5]. For hver indsættelse i hver tumor, vi beregnet en relativ læse frekvens, som gjorde det muligt for os at identificere mellem 9-25 indrykninger pr tumor repræsenterer klonalt udvidede tumor kørsel indrykninger. Blandt generne muteret ved klonisk udvidede indrykninger var mange etablerede cancer gener, og også flere nye kandidat cancer gener.

Vi viser her, at high-throughput sekventering af indstiksstedet biblioteker identificerer klonalt udvidede mutationer i enkelte tumorer. Denne tilgang vil væsentligt forbedre kvaliteten af ​​kandidat kræft gen forudsigelser af insertionsmutagenese skærme, og det vil lette identifikationen af ​​netværk af samarbejdende mutationer i individuelle tumorer.

Resultater

PiggyBac transposon mutagenese

en transposon mutagenese skærm blev udført på mus, der bærer en ubikvitært udtrykt PiggyBac transposasen (ROSA26-PBase) og en transgen PiggyBac transposon array (ATP1-S2) [5]. Den ATP1-S2-array indeholder 20 kopier af transposonet ATP1, som er udstyret med splice acceptorer for indfangning af tumorsuppressorgener og et CAG promotor til aktivering af onkogener. Disse elementer gør det muligt ATP1 at forårsage faste tumorer efter transposition [5]. Vi avlet en test kohorte af 27 mus, der gennemførte ROSA26-PBase og ATP1-S2, og en kontrolgruppe kohorte af 27 mus med ATP1-S2 alene. Kohorter var alderen, og mens der sås ingen tumorer i kontrolgruppen kohorte, observerede vi 11 makroskopiske tumorer blandt 8 mus inden testen kohorten mellem 59 til 85 uger (figur 1a). Tre dyr gennemføres tumorer ved to uafhængige steder, og i et tilfælde, genetisk analyse af insertionssteder indikerede, at begge tumorer har fælles oprindelse (se nedenfor), mens alle andre tumorer tilsyneladende opstod uafhængigt. Tumortyper omfattede pladecellecarcinomer af huden, faste tumorer i lunge og tarm samt follikulært lymfom af milten. Indholdet af tumorceller i de dissekerede prøver varierede fra 30-100%, som bedømt ved histopatologisk analyse af hematoxylin og eosin farvede snit (fig S1). Vi isoleret DNA til analyse af transposon insertion sites fra alle 11 tumorer. For at kontrollere for tilfældige indsættelser af PiggyBac i ikke-kræft væv, isolerede vi også DNA fra 6 hale tips af tumor bærende mus.

A) Kaplan-Meier overlevelse plot af kohorter bærer enten PiggyBac vifte alene (ATP1-S2 ) eller PiggyBac array og konstitutiv transposase (ATP1-S2; R26-PBase). Røde pile angiver tumor forekomst. Aksemærker betegner censureret dyr (ingen tumor observeret ved tidspunktet for aflivning).

B) opstillinger af Illumina genomisk sekvens læser opsige i positioner, der genereres af akustisk klipning. PB3 /PB5, PiggyBac 3 ‘/5’ terminale gentagelse; SA, splejsningsacceptor; P, CAG promotor.

C) Eksempel på kortlagt sekvens læser for PB3 og PB5 sider af en PiggyBac insertion, set i UCSC genom browser. Bemærk, at akustisk klipning forårsager tilfældige DNA break punkter, som Splinkerette adaptere ligeres, hvilket fører til en trappe-lignende mønster af sekvenssammenligninger. Den konstante ende af linjeføringer til højre og venstre er forårsaget af uforanderlig sekvens læst længde af Illumina-systemet.

D) Kvantitativ overblik over sekvens læser, kortlagt læser, og unikke indsættelse sites fra hale og tumorprøver.

High-throughput sekventering af transposoninsertioner

Vi udnyttede Illumina high-throughput sekventering for at opnå en omfattende læsning dækning af transposoninsertioner i de enkelte tumorprøver. I de fleste tidligere transposon mutagenese-skærme, blev tumor-DNA fordøjet med restriktionsenzymer, som genererer fragmenter af en konstant størrelse for individuelle insertioner. Som PCR forstærker kortere fragmenter mere effektivt end længere fragmenter, er en skævhed indført under den efterfølgende PCR-amplifikation for indsættelser, der er repræsenteret ved korte restriktionsfragmenter [7,8]. At opnå en mere proportional repræsentation af insertioner, vi fragmenteret tumor DNA ved akustisk forskydning i fragmenter på 200-400 bp størrelse (se Methods S1 for en detaljeret protokol). Derved insertioner repræsenteret af fragment puljer med tilsvarende størrelse. Klipning blev efterfulgt af DNA ende reparation, A-hale af 3′-ender og ligering til Splinkerette adaptere med 3′-T-overhæng (figur S2). I separate reaktioner, forbindelsesfragmenter for 3′- og 5′-enderne af PiggyBac transposon (PB3 og PB5) blev derefter amplificeret i to på hinanden følgende PCR runder at generere PB3 og PB5 biblioteker for hver prøve. PCR-primerne indeholdt terminaladapter sekvenser for Illumina fast-fase-amplifikation og sekventering og en 6-base-stregkode at skelne prøver i multiplex-sekventering. Vi forberedt to puljer af PB3 og PB5 biblioteker, og hver pulje blev sekventeret på en enkelt bane af et Illumina HiSeq2000 enhed med 100 baser læse længde. Sekvens aflæsninger blev demultiplekses efter deres stregkode og kortlagt til musegenomet hjælp af Bow tie algoritme [9].

Justering af sekvens læser i UCSC genom browser bekræftede saglig karakter af DNA fragmentation af akustisk klipning. Den tilfældige fordeling af DNA break point forårsaget sekvens læser fra transposoninsertioner at tilpasse i en trappe-lignende mønster omkring den centrale TTAA sekvensen af ​​PiggyBac insertion (figur 1B, C). For hver prøve, vi opnåede i gennemsnit ~ 5×10

6 bar-kodet læser, med lignende tal for tumorer og hale kontroller (Figur 1D; Tabel S1).

Om 19,3% af læser fra tumorprøver kunne kortlægges til musegenomet. For hale prøver, kunne 15,3% af læser kortlægges. Disse læser repræsentere nye indrykninger af ATP1 transposon uden for dens donor array. Denne mindre andel af konfigurerbare læser skyldes primært en stor brøkdel af læser, der indeholdt plasmid sekvens flankerende unmobilized transposoner på donor array og dermed ikke kunne kortlægges. For at bestemme den del af ATP1 transposoner, der forbliver i ATP1-S2 donor array, udførte vi Southern blot analyse af haler på ROSA26-PBase; ATP1-S2 mus og fandt, at omkring 40% af ATP1-S2 transposoner ikke blev mobiliseret fra arrayet (fig S3). Denne ufuldstændige mobilisering af ATP1 kan skyldes den specifikke in vivo-kromatin status ATP1-S2 array. Som DNA methylering på CpG sites kan være hæmmende for PiggyBac gennemførelse [10], analyserede vi status for methylering af ATP1-S2 ved Southern blot med en methylering følsom restriktionsfordøjelse. CpG methylering af ATP1-S2-array blev registreret, hvilket giver en mulig forklaring på den moderate gennemførelsesgraden (Figur S3). En yderligere faktor, der reducerer nye transposoninsertioner er tabet af transposoner under gennemførelsen (dvs. excision uden at følge reintegration), og en tidligere undersøgelse viste, at omkring halvdelen af ​​alle ATP1 transposon kopier tabt under gennemførelsen aktivitet [5]. På trods af den moderate del af konfigurerbare sekvens læser, vores high-throughput sekventering protokol tilladt os at inddrive et betydeligt antal af læser til målene for vores undersøgelse med ~ 1×10

6 læser kortlagt i gennemsnit for tumorprøver og ~ 0.7×10

6 læser til hale kontroller (Figur 1D).

ensidig og tosidet læse dækning af indsættelser

alt i alt fandt vi 4.210 nye indsættelsessteder i tumor og hale prøver kombineret, som blev støttet af read mappings på begge sider af PiggyBac transposon insertion (PB3 og PB5). De fleste indsættelser blev dog identificeret ved kortlagt lyder på kun én side af transposonet (314,970 indrykninger med læser på kun PB3 eller PB5 side). Interessant, at langt størstedelen af ​​indrykninger i vores undersøgelse, navnlig med læser mappet til kun den ene side af transposonet, var repræsenteret ved små Læs numre (Figur S4). En lignende observation om den høje andel af sjældne indsættelser er sket i en Sleeping Beauty undersøgelse [7]. Det er tænkeligt, at disse sjældne insertioner undslippe opdagelse på begge sider af transposonet følge af deres lave forekomst, hvilket resulterer i den høje andel af insertioner dækket på kun én side. Interessant vi også observeret flere insertioner med høje læse tal, der var omfattet kun på den ene side (fig S4). Potentielle årsager til ensidig læse dækning i disse tilfælde omfatter flankerende repetitive eller lav kompleksitet DNA strækninger, der forhindrer kortlægning, eller små DNA rearrangementer (sletninger, inversioner) forårsaget af transposonet indsættelse. For omfattende analyse, vi indgår i vores undersøgelse alle insertionssteder, der kombinerer indsættelse sites med ensidig og med to-sidet sekvens læse dækning, hvilket resulterede i ~ 2×10

4 unikke transposoninsertioner i gennemsnit per prøve (Figur 1D).

PiggyBac muterer genomet jævnt

data om kromosomale fordeling af ATP1 indrykninger afslørede, at ATP1 PiggyBac transposonet muterer kromosomer jævnt i forhold til deres TTAA indhold, både i tumorer og haler (figur 2A) . Dette mønster er i overensstemmelse med tidligere data rapporteret for indsættelse mønster af den tilhørende ATP2 transposon [5]. Undtagelsen til den forholdsmæssige fordeling af insertioner var den proximale ende af kromosom 10, som huser ATP1-S2 donor array. Her, observerede vi en berigelse af insertioner i området ~ 2 Mb ved den proximale ende af kromosom 10 (figur 2B). Denne skævhed er sandsynligvis forårsaget af en lokal hopping effekt af PiggyBac transposon i nærheden af ​​donor array, og indsættelser på dette område blev derfor udelukket fra yderligere analyse.

A) Relativ fordeling af PiggyBac indsættelsessteder løbet kromosomer sammenlignet med andelen af ​​TTAA sites på kromosomer. Bemærk overrepræsentation af kromosom 10, som bærer transposonet donor array. Kromosom Y, der hovedsagelig består af stærkt repetitive elementer, viste en lille præference for PiggyBac insertioner.

B) Lokalt hopping virkning på kromosom 10. Histogram af insertion densitet på kromosom 10 viser en positiv bias for insertioner i proximale ende (pile), hvor ATP1-S2 donor array er placeret

C) Fordeling af PiggyBac indrykninger i genomiske regioner:. Arrangøren (10 kb opstrøms af TSS), exoner, introner og intergeniske regioner

.

Vi sammenlignede også fordelingen af ​​insertionssteder i gen regioner (promotor, exon, intron) og intergeniske regioner. Samlet set viste både hale og tumorprøver en fordeling af indsættelser, der lignede den gennemsnitlige andel af gen-regioner i musen genom, selv om der blev observeret PiggyBac indrykninger i noget højere end forventede antal i intergeniske regioner (Figur 2C).

klonal ekspansion af transposoninsertioner

Vores analyse af transposoninsertioner viste ingen væsentlige forskelle i indsættelse mønstre af PiggyBac transposoner i tumor og hale prøver i form af kromosom distribution og gen-regioner. Vi analyserede næste de kvantitative forskelle i sekvens læser tal for indrykninger i de enkelte prøver. Den underliggende antagelse er, at klonisk udvidet indsættelser er til stede i de fleste celler i en prøve, og bør være repræsenteret af højere læste tal end neutrale indsættelser, der kun er til stede i en mindre brøkdel af prøven.

For at justere for variationer i sekvensen læst dækning af forskellige prøver, vi først genereret relative læste frekvenser ved at normalisere PB3 og PB5 side læse tal for det samlede antal læser fra den respektive prøve biblioteket. Som PB3 og PB5 læse frekvenserne blev afledt uafhængigt fremstillede PCR-biblioteker, en perfekt korrelation mellem PB3 og PB5 læser ikke kan forventes frekvenser. Ikke desto mindre, vi observerede en robust sammenhæng mellem PB3 og PB5 læse frekvenser for PiggyBac indsættelser (Figur S5). For at kombinere oplysningerne om læste frekvenser af PB3 og PB5 sider af hver indsættelse, vi så beregnet for hver indsættelse den gennemsnitlige læse frekvensen fra sin PB3 og PB5 læse frekvenser. For insertioner, der var repræsenteret af læser på kun den ene side, den gennemsnitlige frekvens svarer til 0,5 af den respektive ensidig frekvens.

I en sammenlignende analyse af læse- frekvensfordelinger i tumor og hale prøver, vi plottet den gennemsnitlige read frekvenser af alle insertionssteder i en kasse plot diagram (figur 3). Dette diagram afslørede, at mere end 99% af insertioner i tumorer og haler var repræsenteret ved en lille brøkdel af læser med aflæste frekvenser under 0,1%. Interessant, men når vi fokuseret på de øverste outliers af hver prøve, bemærkede vi, at tumor prøver indeholdt et mindre antal outliers med berigede læse frekvenser, der var klart højere end de stærkeste outliers af hale prøver. Disse højfrekvente indsættelser vil sandsynligvis være klonalt udvidede indsættelser, der er blevet positivt udvalgt til under tumorvækst.

Box plot af Average Læs frekvenser af transposoninsertioner i tumorer og hale kontrol. Prikker viser de øverste 1% indrykninger af hver prøve sorteret efter gennemsnitlige læste frekvenser. Lodret linje angiver fordelingen af ​​2-25% percentilen gruppe, og felter angiver fordelingen af ​​den nederste 75% af indrykninger. En tærskelværdi for outliers (punkteret vandret linje) blev beregnet som gennemsnittet de læste frekvenser af de øverste 10 indrykninger af hver hale prøve.

I mangel af et effektivt statistisk metode til at skelne sande outliers fra tilfældigt beriget indrykninger , besluttede vi at definere klonal ekspansion af en tærskel fremgangsmåde. Vi udnyttede hale kontrol som reference for fordelingen af ​​aflæste frekvenser i ikke-tumorvæv, og beregnet en tærskel for outlier detektion ved gennemsnittet af de 60 højeste frekvenser af halen kontrolprøver (top 10 frekvenser af hver hale prøve). Dette resulterede i en tærskel på 0,37% for vores datasæt. Vi identificerede mellem 9-25 indrykninger for hver tumor prøve over tærsklen, men kun 2-6 indrykninger i hale prøver (tabel S2).

Vi yderligere forhørt reproducerbarheden af ​​ranking insertionssteder ved læsning frekvens i en serie af kontroleksperimenter. Vi spurgte først, hvis indstiksstedet ekspansion ville variere mellem forskellige dele af en enkelt tumor masse (figur S6). Ved at sammenligne læste frekvenser af Mikrodissekterede prøver fra enkelte tumor masserne, observerede vi en fuldstændig overlapning af de mest beriget indrykninger mellem prøver og en kamp af mere end 50% af indrykninger over tærskel samlet.

Vi derefter undersøgt, om udvidet indsættelser i tumorer kan allerede være til stede som udvidede indsættelser i præ-kræft væv, hvorfra tumoren opstår. Til dette formål har vi sammenlignet transposoninsertioner til gener fra en lunge tumor med insertioner af tilstødende normale lungevæv (Fig S7). De mest beriget tumor indrykninger var ikke til stede i det normale væv, bekræftelse af validiteten af ​​vores tilgang til at identificere kandidat cancer gener. Imidlertid blev 2 af 6 ekspanderede genindsætninger af tumoren også detekteret ved tilsvarende niveauer i det normale lungevæv, hvilket indikerer, at nogle klonalt udvidede indsættelser i tumorer kan være afledt af præcancerøse klonale insertioner.

Endelig vi spurgte, om organer ville bære en højere baggrund på udvidede pre-cancer indrykninger end hale væv, som organer har typisk en mere homogen sammensætning af celletyper end den heterogene hale (figur S7). Faktisk fandt vi, at DNA fra kan organer i nogle tilfælde indeholder mere udvidede indrykninger end hale væv. Antallet af udvidede indrykninger varierede til 3 til 23 i organer, med et gennemsnit på 11 udvidede indrykninger per prøve. Som tumor prøver af vores kohorte transporteres i gennemsnit 16,4 udvidede indsættelser, vi anslår, at i gennemsnit 66% (11 /16,4) af udvidede indrykninger i tumorer kan afspejle udvidet pre-cancer indrykninger. Baseret på disse kontrolforsøg, konkluderer vi, at klonal ekspansion analyse er en passende metode til at identificere kandidat cancer gener i individuelle tumorer. Men et vigtigt forbehold er tilstedeværelsen af ​​udvidede pre-cancer indsættelser i tumorvæv, og hastigheden af ​​disse indsættelser kan variere meget mellem prøverne afhængig tumortype og vært væv.

Blandt klonisk udvidede indsættelser i tumorer, 56,9% blev fundet i genregioner (promotorer, exons og introns), -en signifikant højere andel end for alle PiggyBac insertioner i tumorer (33,4%, se Figur 2C) – og 43,1% blev fundet i intergeniske regioner. Klonisk udvidede indrykninger i intergeniske regioner kan udøve langtrækkende cis-effekter på tilstødende gener. Men da de nuværende databaser ikke indeholder oplysninger om onkogene rolle intergeniske regioner, begrænsede vi vores videre analyse til transposoninsertioner i genregioner.

Klonale udvidelser identificere kandidat cancer gener

klonal ekspansion analyse af transposoninsertioner i genregioner identificeret 88 unikke gener, der repræsenterer potentielle kandidat cancer-gener (figur 4A). Efter aftale med denne forudsigelse, vi observeret flere gener blandt vores kandidatgener, der er impliceret i kræft. For eksempel blev ni af vores kandidat cancer gener også indeholdt i Cancer Gene Census liste, der omfatter 487 gener kausalt forbundet med kræft [11], der repræsenterer en meget betydelig berigelse (

Abl2

,

BRAF

,

Fbxw7

,

Foxp1

,

Ipo11

,

Mllt3

,

Fas

,

PTEN

og

NF1

; p. 0,0002, Fishers eksakte test)

A) klonalt udvidede gen indrykninger i tumor prøver, sorteret efter deres gennemsnitlige læste frekvenser (

f

) . Tre mus husede to tumorer hver (tumor 01 og 08, tumor 05 og 09, og tumorceller 04 og 10, henholdsvis). En blå stjerne angiver gener til stede i Cancer Gene Census liste, en liste over 487 gener kausalt impliceret i kræft.

Mamdl1

og

Dgkd

blev ramt i uafhængige tumorprøver og er fremhævet med rødt og pink, henholdsvis.

B) cellulære processer, der berøres af klonisk udvidet gen indrykninger. Proceskategorier blev indsamlet fra funktionelt gen information på www.omim.org og www.informatics.jax.org.

I vores undersøgelse, tre kohortedyr gennemført to tumorer hver (figur S1). Interessant, to par tumorer viste ingen overlapning af kandidat cancer-gener (tumorer 01 og 08; tumorer 04 og 10), hvilket indikerer uafhængig oprindelse tumorer. Derimod tumorer 05 (fast tumormasse i leveren) og 09 (follikulær lymfom) delt 5 kandidat cancer-gener, hvilket indikerer en fælles oprindelse. Da leveren er et fælles sted for invasion for lymfatisk leukæmi [12], er det muligt, at levertumor 09 er en metastatisk tumor masse, der er afledt af milten lymfatisk tumor 05. Af note, 5 delt kandidat cancer gener af tumorer 05 og 09 (

PTEN, Fas, ESR1, Abl2, Lrp1b

) blev uafhængigt opnået i begge tumorer med lignende Average Læs frekvenser, hvilket bekræfter robusthed vores sekventering metode til at identificere klonal udvidelse af indrykninger.

Ved analyse af kandidatgener for betydelig berigelse af funktionelle kategorier ved hjælp af DAVID bioinformatik ressource (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [13], fandt vi en signifikant berigelse af protein kinase relaterede kategorier og veje (f.eks Kegg : MAPK signalvejen, s 0,016; INTERPRO: Protein kinase, kerne, s 0,016; Benjamini-Hochberg korrigeret P-værdi tabel S3). Ligeledes når vi manuelt grupperet kandidatgener af deres kendte cellulære proces, fandt vi, at gener involveret i signaltransduktion repræsenterede den største gruppe af gener (figur 4B). Andre fremtrædende cellulære processer af kandidatgener var apoptose, chromatin remodeling, transkription, og protein transport /sortering (figur 4B). Interessant, når man ser på cellulære processer på de enkelte tumorer, fandt vi, at hver tumor havde en eller flere mutationer i signalering gener, og en blanding af indrykninger påvirker mindst to andre cellulære processer. Dette mønster af flere muterede processer for hver tumor er i overensstemmelse med det koncept, at flere genetiske ændringer i forskellige cellulære processer drive tumorvækst [14].

Blandt kandidat cancer gener defineret af klonal ekspansion blev to gener ramt uafhængigt på forskellige TTAA steder i flere tumorer (ekskl gener deles af tumor 05 og 09, som deler en fælles oprindelse): mastermind-domæne som en (

Mamld1

) og Diacylglycerolkinase delta (

Dgkd

). Således disse gener er særligt stærke kandidat cancer gener, da de dobbelt defineres både ved klonal ekspansion af indrykninger i de enkelte tumorer og uafhængig forekomst så almindeligt indsættelsessteder i flere tumorprøver.

Mamld1

gen er blevet muteret af indsættelser i epitel tumorer i huden (tumor 01, 02, og 03).

Mamld1

er blevet foreslået at være en co-aktivator af ikke-kanoniske Notch signalering [15]. I human hud, er Notch signalering komponenter rigeligt udtrykt, og de-regulering af Notch signalering fører til forskellige former for hudkræft [16]. ,

Mamld1

er således en ny kandidat kræft-gen som en regulator af Notch signalering for epitel tumorer.

Dgkd

gen er blevet fundet muteret i solide tumorer 05 (lymfatisk metastase i leveren) og 07 (lunge).

Dgkd

metabolizes 1,2, diacylglycerol (DAG) til phosphatidsyre (PA). Både DAG og PA spiller vigtige roller som sekundære budbringere for mitogene signaler og graduering af deres niveauer ved

DGK

proteiner er blevet foreslået at være en potentiel mekanisme i kræft [17].

Diskussion

Vi viser her, at high-throughput sekventering analyse af forskydningspåvirket DNA fra transposon-genererede tumorer tilvejebringer midler til at identificere kandidat cancer gener ved klonal ekspansion analyse. Denne fremgangsmåde repræsenterer en forbedret strategi til identifikation af kandidat cancer gener i transposon skærme, og tillader for første gang identifikationen af ​​kandidat cancer gener på niveauet for individuelle tumorer.

Kvantificering af klonal ekspansion

Aktuelle protokoller bruger begrænsning fordøjer at fragmentere tumor-DNA, hvilket resulterer i en bias i retning af indsættelser, der er repræsenteret af korte fragmenter [7] og derved reducere det kvantitative aspekt af læse nummer analyse. Vi anvendte akustisk klipning for DNA fragmentation at minimere størrelsen forskelle i indføringsstedet fragmenter. Denne forbedring i kombination med Illumina højt gennemløb sekventering, tilladt os at få en semi-kvantitativ vurdering af den forholdsmæssige repræsentation af indrykninger. Adskillige observationer tyder på, at vores metode nåede et niveau på kvantitativ nøjagtighed tilstrækkelig til at identificere klonalt udvidede indsættelser, der definerer kandidat cancer gener. Først, sammenligning af tumor og kontrolprøver viste en tydelig berigelse af insertion læser i tumorprøver. For det andet, analyse af de relaterede tumorer 05 og 09 viste en stærk korrelation af læste frekvenser af klonisk udvidet indrykninger. Endelig gener muteret ved klonisk udvidede indrykninger omfattede mange veldefinerede cancer gener.

, et vigtigt forbehold af klonal ekspansion analyse er, at organer kan bære en række pre-cancer indsættelser, der klonisk udvidet ved en tilfældighed. Som vores kontrolforsøg angiver, kan disse insertioner udgør gennemsnitlig to tredjedele af klonisk ekspanderede insertioner. Selv vores metode er klart effektive til at identificere kandidat cancer gener i individuelle tumorer, behov kræft drivende funktion af hvert gen, der skal bekræftes af alterative metoder, såsom CIS analyse eller funktionelle assays.

En faktor, kan påvirke den klonale ekspansion på insertioner er aktiviteten af ​​PiggyBac transposasen. Hvis PiggyBac gennemførelse aktivitet ville ophøre under hele musen, ville det løse visse indsættelser, hvilket synes som klonede udvidelser i vores analyse. Vi vil behandle den fortsatte aktivitet PiggyBac transposasen i voksne mus væv i fremtidige undersøgelser af immunhistokemiske analyser.

Flere skævheder i rækkefølge læse repræsentation i vores klonal ekspansion analyse tilbage, for eksempel dem, der indføres af forskellige GC-indhold af fragmenter under PCR-amplifikation. En anden faktor, der reducerer kvantitative magt vores metode er den potentielle tilstedeværelse af ikke-tumor stromale væv i prøverne, der udvander klonalt udvidede tumor drivende insertioner. Derudover en advarsel af vores metode er, at ikke-specifik Splinkerette primer binding kunne føre i nogle tilfælde til en fremherskende forstærkning af genomiske websteder, der ikke sande transposoninsertioner. Yderligere tekniske raffinementer vil være forpligtet til at bringe analyse af klonal ekspansion til et absolut kvantitativt niveau

High-throughput sekventering af transposoninsertioner

Vores sekventering tilgang gav . 10

6 kortlagt læser per tumor prøve. En række 10

5 læser per prøve var blevet foreslået at være tilstrækkelig til at afsløre alle indsættelser af Tornerose genereret tumorer [7].