PLoS ONE: Dybt Sekventering af RNA fra tre forskellige Ekstracellulær vesikel (EV) Undertyper frigivet fra Human LIM1863 coloncancercellelinie afdækker Tydelige Mirna-Berigelse Signatures

Abstrakt

Udskilte microRNA (miRNA) lukkede i ekstracellulære vesikler (elbiler) spiller en central rolle i intercellulær kommunikation ved at regulere recipientcelle genekspression og påvirker target cellefunktion. Her beskrives isoleringen af ​​tre forskellige EV undertyper fra den humane koloncarcinomcellelinie LIM1863 – kaste mikrovesikler (sMVs) og to exosom populationer (immunoaffinitetsteknikker isoleret A33-exosomer og EpCAM-exosomer). Deep sekventering af miRNA-biblioteker fremstillet ud fra forældrenes LIM1863 celler /afledt EV undertype RNA gav 254 miRNA identifikationer, hvoraf 63 er selektivt beriget i elbiler – miR-19a /b-3P, miR-378A /C /D, og ​​miR-577 og medlemmer af de lad-7 og miR-8 familier er den mest fremtrædende. Lad-7a-3p *, lad-7f-1-3p *, MIR-451a, MIR-574-5p *, MIR-4454 og MIR-7641 er fælles for alle EV undertyper, og 6 miRNA (MIR-320a /b /c /d, miR-221-3p, og miR-200C-3p) skelne LIM1863 exosomer fra sMVs; miR-98-5p blev selektivt kun repræsenteret i sMVs. Især A33-Exos indeholdt det største antal (32) udelukkende-berigede miRNA; 14 af disse miRNA er ikke blevet rapporteret i forbindelse med CRC væv /biovæske analyser og garanterer yderligere undersøgelse som potentielle diagnostiske markører for CRC. Overraskende miRNA passager tråde (stjerne miRNA) for miR-3613-3p *, -362-3p *, -625-3p *, -6842-3p * blev den dominerende streng i A33-Exos, det omvendte, der blev observeret i forældrenes celler. Dette fund tyder på miRNA biogenese kan forbundet med endosomal /exosomal behandling

Henvisning:. Ji H, Chen M, grønnere DW, han W, Rai A, Zhang W, et al. (2014) Deep Sekventering af RNA fra tre forskellige Ekstracellulær vesikel (EV) Undertyper frigivet fra Human LIM1863 coloncancercellelinie afdækker Tydelige Mirna-Berigelse signaturer. PLoS ONE 9 (10): e110314. doi: 10,1371 /journal.pone.0110314

Redaktør: Clark Chen, University of California, San Diego, USA

Modtaget: Maj 29, 2014; Accepteret: September 11, 2014; Udgivet: 17 oktober 2014

Copyright: © 2014 Ji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. FASTQ filer til alle fire små RNA biblioteker (LIM1863 celler og afledte sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos) er blevet forelagt for Sequence Læs Arkiv (SRA) i NCBI under tiltrædelsen nummer SRA106214

Finansiering.: Dette arbejde blev støttet af National Health og Medical Research Council of Australia (NHMRC) program tilskud # 487.922. MC og AR er understøttet af en La Trobe University Research Scholarship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ekstracellulære vesikler (EVS) er nano-membranøs partikler spænder fra 30-2,000 nm i diameter, der er frigivet fra de fleste celletyper i det ekstracellulære [1] miljø. Elbiler menes at omfatte tre hovedklasser afhængigt af deres oprindelse – exosomer (Exos, 50-150 nm), kaste mikrovesikler (sMVs, 400-1,500 nm), og apoptotiske organer (400-2,500 nm). Selv om der er en igangværende polemik blandt forskere vedrørende nomenklatur, biogenese, biokemiske og funktionelle egenskaber af EV undertyper, den foreliggende dokumentation tyder på, at exosomer stammer fra den indadgående knopskydning af endosomale rum kaldet multivesikulære organer (MVBs) og frigives fra cellen ind i mikromiljø efter fusion af MVBs med plasmamembranen, sMVs (ectosomes, mikrovesikler, mikropartikler, oncosomes) ved passiv spirende /blæredannelse fra plasmamembranen, og apoptotiske legemer gennem processen af ​​apoptose /celle krympning /cellekernefragmentering [2]. Ved begge funktionelle og biokemiske niveauer, har exosomer været den mest undersøgte af elbiler. Exosomer er blevet vist at indeholde forskellige proteiner (herunder oncoproteiner, tumorsuppressorproteiner, transkriptionelle regulatorer, splejsningsfaktorer [1], [3], [4], [5], [6], lipider [7], og RNA’er (mRNA’er , microRNA (miRNA) og andre ikke-kodende RNA) [8] – exosomal molekylær information lasten kan tilgås af offentligt-tilgængelige databaser såsom ExoCarta [9] og EVPedia [10] Selvom længe betragtet som celleaffald seneste exosom undersøgelser. vise, at de har vigtige biologiske roller i immunsystemet, kardiovaskulære og nervesystemer og i patogenesen af ​​sygdomme, såsom cancer [11], [12], [13]. i det sidste årti er det blevet fastslået, at elbiler spiller en central rolle i cancer progression og pre-metastatisk niche priming for tumor transplantation [14], [15], [16], [17].

det er velkendt, at tumoren mikromiljø spiller en afgørende rolle i kræft initiering , progression og metastase [18]. intercellulær kommunikation mellem tumor-stroma kan medieres af opløselige faktorer, herunder cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer [19]. Var et nyt koncept er, at tumor-stroma-interaktioner også kan involvere direkte udveksling af genetisk information, hovedsagelig i form af miRNA, en klasse af ikke-kodende RNA’er (18-25 nukleotider lange), der regulerer ekspressionen af ​​multiple målgener ved at binde til deres kodede mRNA’er [13], [20], [21]. Denne overførsel af genetisk materiale kan forekomme, når elbiler indeholdende miRNA fragt frigives af en donor cellen til det ekstracellulære miljø og funktionelt overført til recipientceller. Overførte miRNA kan være funktionelle både

in vitro

[8], [22], [23], [24], [25], og

in vivo

[26], [27] , [28]. Undersøgelser er begyndt at undersøge sammenslutningen af ​​microRNA-relaterede polymorfier og deres forbindelse med forekomsten af ​​kræft og prognose samt potentialet for cirkulerende microRNA eller fækal microRNA udtryk som ikke-invasive tidlig påvisning biomarkører for kolorektal cancer [29], og nytten af ​​miRNA i tilbagefald, metastaser og terapeutiske resultater [30]. Et stort fremskridt i vores forståelse af exosomal miRNA biologi var konstateringen af, at sumoylated hnRNPA2B1 dirigerer læsningen af ​​visse miRNA i exosomer gennem anerkendelse af specifikke korte motiver til stede i miRNA [31].

For nylig beskrev vi isolering af to populationer af exosomer samt sMVs fra samme humane koloncarcinomcellelinie LIM1863 [4]. De sMVs blev fremstillet ved differentiel centrifugering og exosomer oprenset ved sekventiel immunocapture anvendelse af anti-A33- og anti-EpCAM koblede magnetiske perler. Mens exosom populationer (A33-Exos og EpCAM-Exos) ikke kunne skelnes ved hjælp af elektronmikroskopi, aerometermassefylde eller stereotype exosomer markører (TSG101, Alix og HSP70), protein maskinskrivning hjælp GeLC-MS /MS [3], [6] afslørede, at deres protein kompositioner var ganske tydelig – EpCAM-Exos indeholder klassiske apikale menneskehandel komponenter og A33-Exos, beriget med basolaterale menneskehandel molekyler. Proteomet profiler af både exosom befolkninger, til gengæld var ganske forskellig fra den oprindelige rapport af sMVs frigives i samme dyrkningsmedium. For yderligere at definere disse EV undertyper, vi undersøgte deres molekylære sammensætning bruge en anden

omik

tilgang, RNA skrive.

I denne undersøgelse viser vi at bruge dybe sekventering, at der er i alt 254 miRNA identificeret i fire miRNA biblioteker fremstillet (A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs og forældre LIM1863 celler), hvoraf 63 er højt beriget med elbiler. De tre LIM1863-afledte EV undertyper er beriget med specifikke miRNA underskrifter, sammenlignet med den parentale cellelinie LIM1863. Især rapporterer vi, at 32, 2 og 4 miRNA, der udelukkende beriget med A33-Exos, EpCAM-Exos, og sMVs henholdsvis – hvoraf nogle giver exosomer kan skelnes fra sMVs. Af de 32 miRNA selektivt beriget med A33-Exos, 13 er ikke tidligere blevet impliceret med kolorektal cancer (CRC), og vi diskuterer, hvordan disse oplysninger kan udnyttes mod potentialet for CRC diagnostik. En bemærkelsesværdig konklusion i vores undersøgelse var konstateringen af ​​’passager Strand’ miRNA (miRNA stjerne) sekvenser beriget med elbiler i forhold til forælder LIM1863 celler.

Materialer og metoder

Cell kultur og isolering af ekstracellulær vesikler

LIM1863 celler [32] var oprindeligt dyrket til -80% sammenløb i en 175 cm

2 kolbe i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 5% føtalt kalveserum ( FCS), 0,1% insulin-transferrin-selen (ITS, Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO

2. LIM1863 celler (-3 × 10

7-celler) blev høstet (140

g

, 3 min), suspenderet i 15 ml phenolrødt frit RPMI-1640 medium (indeholdende 0,5% ITS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) og overføres til Dyrkning kammer i et cellelinie CL-1000 Bioreactor klassiske kolbe (Integra Biosciences); Nutrient Supply kammeret indeholdt 500 ml RPMI-1640 suppleret med 5% FCS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 atmosfære. Dyrkningsmedium i næringsstoftilførsel kammeret blev erstattet to gange om ugen, og cellesuspensionen fra Dyrkning kammeret blev høstet hver 48. time. Efter hver samling, blev cellesuspensionen centrifugeres ved 140

g

i 3 min for at sedimentere LIM1863 celle organoids, som blev resuspenderet i 15 ml dyrkning medium og re-seedede tilbage i Dyrkning kammer. Supernatanten blev centrifugeret ved 2.000

g

i 10 minutter til fjernelse af flydende celler /cellerester og derefter centrifugeret yderligere ved 10.000

g

i 30 minutter ved 4 ° C for at indsamle kaste mikrovesikler (sMVs) . Den resulterende supernatant blev yderligere centrifugeret (100.000

g

, 1 h) at indsamle rå exosomer. Rå exosomer blev fraktioneret i to adskilte exosom subpopulationer (A33-Exos og EpCAM-Exos) ved sekventielle immunocapture hjælp Dynabeads (Invitrogen) fyldt med anti-human-A33 monoklonale antistoffer [33] i tandem med anti-EpCAM (CD326) -antistof bundet magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotec), som beskrevet [4].

Proteinkvantificering

proteinindhold blev estimeret ved 1D-SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteinfarvning densitometri, som tidligere beskrevet [5] .

Transmission (TEM)

A33-Exos og EpCAM-Exos blev elueret fra deres respektive magnetiske perler med 0,2 M glycin, pH 2,5 og høstet ved centrifugering (100.000

g

, 1 h). For TEM blev prøver (sMVs, A33- og EpCAM-Exos, 1 ug /10 pi PBS) påført i 2 min til 400 mesh kobbergitre overtrukket med et tyndt lag carbon. Overskydende materiale blev fjernet ved blotting med filtrerpapir, og prøver negativt farvet to gange med 10 pi af en 2% uranylacetat opløsningen i 10 minutter (ProSciTech, Queensland, Australien). Gitre blev lufttørret og filmede med en JEOL JEM-2010 transmission electron microscope betjent ved 80 kV.

Western blot-analyse

Sample Proteinkoncentrationer blev bestemt ved hjælp af en-dimensionel SDS-PAGE /SYPRO Ruby proteinfarvning /densitometri, som beskrevet [5], [6]. Kort fortalt blev prøver lyseret i SDS-prøvebuffer i 20 minutter ved stuetemperatur, og proteiner (10 ug /prøve) opløst ved SDS-PAGE, elektrooverført på nitrocellulosemembraner ved anvendelse af iBlot Dry Blotting System (Life Technologies), og membraner blokeret med 5 % (vægt /volumen) skummetmælkspulver i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% (v /v) Tween-20 (TTBS) i 30 min. Membraner blev undersøgt natten over i TTBS med primær muse-anti-CD9 (ved 1:1000) og muse-anti-TSG101 (ved 1:1,000) fra BD Biosciences, muse-anti-Alix (ved 1:1,000) fra cellesignalering eller mus anti -A33 (1 pg /ml) (gave fra doktor A Scott, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne). Efter vask med TTBS (3 x 10 min) membraner blev inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-muse IgG (Sigma) eller IRDye 800 anti-muse-IgG (Li-COR Biosciences). Proteiner blev visualiseret ved at inkubere membraner med vestlige HRP substrat (Merck-Millipore) efterfulgt af billeddannelse med ChemiDocMP System (Bio-Rad), eller ved at billeddannelse direkte med Odyssey Infrared Imaging System (v3).

Total RNA isolering

Total RNA fra LIM1863 celler, sMVs, A33- og EpCAM-Exos blev isoleret med TRIzol (Life Technology), i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev prøver lyseret i 1 ml TRIzol Reagent ved gentagen pipettering i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Chloroform (0,2 ml /ml TRlzol Reagent) blev tilsat til solubiliserede prøver og blandinger hvirvlet kraftigt i 15 s, inkuberet ved stuetemperatur i 2-3 minutter og derefter centrifugeret (12.000

g

, 15 min, 4 ° C) . Vandige fase blev opsamlet, blandet med 5 ug af glycogen (20 mg /ml vandig glycogen, Invitrogen) og isopropylalkohol (0,5 ml isopropylalkohol /1 ml vandig fase) og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Totalt RNA blev udvundet ved centrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Resulterende RNA-pellets blev vasket en gang med 75% vandig ethanol, lufttørret i 5 minutter og genopløst i RNase-frit vand. Den mængde, kvalitet og sammensætning af RNA-prøver blev vurderet ved anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Lille RNA bibliotek konstruktion og sekventering

Fire små RNA-biblioteker (fra forældrenes LIM1863 celler og afledte sMVs, A33- og EpCAM-Exos) blev bygget og sekventeret med Illumina TruSeq dyb sekventering teknologi (Prøveforberedelse guide, Par # 15.004.197 Rev.A, Illumina, San Diego, CA). Kort beskrevet blev totalt RNA prøver fraktioneret på en 15% Tris-borat-EDTA (TBE) polyacrylamidgel (Invitrogen) og et bånd svarende til små RNA’er (18~30 nt) blev udskåret og små RNA’er ekstraheret ved centrifugering. Efter ligering af 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’) og 3 ‘(5′-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3’) adaptere, små RNA-molekyler blev revers transkriberet til cDNA og derefter amplificeret ved anvendelse af adapter-primere i 14 cyklusser og fragmenterne ( -150 bps) blev isoleret fra en 6% TBE PAGE-gel. Det oprensede cDNA blev anvendt direkte til klynge generering og sekventeret under anvendelse af et Illumina HiSeq 2000 platform. Billedfiler genereret af sequencer blev behandlet til at producere data digital kvalitet (rå FASTQ filer). FASTQ filer til alle fire små RNA biblioteker (LIM1863 celler, og afledte sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos) er blevet indsendt til Sequence Læs Arkiv (SRA) i NCBI under tiltrædelsen nummer SRA106214.

Kvantitativ real -tid PCR

Total RNA (3 pi indeholdende 12 ng RNA /ul) fremstillet af LIM1863 celler og afledte elbiler var omvendt transskriberet ved hjælp af en TaqMan miRNA Reverse Transcription (RT) Kit fra Applied Biosystems /Life Technologies med Megaplex RT primere (human Pool A og Pool B, Applied Biosystems). RT reaktionsbetingelser, baseret på producentens anvisninger, var: 40 cykler af 16 ° C i 2 min, 42 ° C i 1 min og 50 ° C i 1 sek. Resulterende Megaplex RT produkter (2,5 pi) blev derefter blandet med 22,5 pi Megaplex Preamp Reaction Mix indeholder 2,5 ul Megaplex Preamp Primere Pool A og B (Applied Biosystems). Pre-amplifikationscyklusprogrammet var: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min, 75 ° C i 2 min efterfulgt af 12 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 4 min. Efter fortynding af præ-amplificerede cDNA’er (25 pi) med 75 pi Tris-EDTA-buffer (1 mM Tris-buffer indeholdende 0,1 mM EDTA, pH 8,0), 15 pi fortyndet cDNA-produktet blev blandet med 450 pi TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) og 435 pi nuclease-frit vand. For at validere de dybe sekventering data blandingen udsat for kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse ved hjælp af TaqMan lav densitet array (TLDA) kort (sæt v3.0), der repræsenterer i alt 754 analyser specifikke for humane miRNA (nuværende i Sanger miRBase v14). QRT-PCR blev udført på en 7900 HT Thermocycler (Applied Biosystems) under anvendelse af producentens anbefalede cykelforhold: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. QRT-PCR-data blev indsamlet ved afslutningen af ​​hver cyklus. Cyklus tærskel (CT) værdier blev beregnet under anvendelse af SDS software v2.4; automatiske baseline indstillinger blev tildelt en minimal Ct tærskelværdi på 0,2. Ct-værdier 35 blev anset for at være under assay afsløring niveau og udelukket fra dataanalyse. Dataene blev analyseret ved hjælp af ΔΔCt metoden med LIM1863 celle RNA som reference og global normalisering med U6 snRNA og MaMMU6 som kandidat kontrol ved hjælp af Expression Suit Software v1.0.3 (Applied Biosystems).

Bioinformatik analyser

En bioinformatik rørledning udviklet i BGI-Shenzhen blev ansat til at identificere miRNA og andre små RNA kategorier. Kort fortalt lav kvalitet læser (små RNA, som indeholder base “N” (udefinerede af sequencer) eller mere end 6 baser med kvalitet lavere end 13 eller mere end 4 baser med kvalitet under 10), adaptere og læser mindre end 18 nt blev udelukket fra de rå data til at generere ren læser (18-30 nt). Clean læser blev justeret til miRBase (V20, https://www.mirbase.org) ved hjælp af BLAST software fra NCBI at identificere kendte miRNA og generere udtryk profiler. Fold ændringer i ekspressionsniveauer (prøve gruppe versus kontrol) blev beregnet for hver miRNA som log

2 nøgletal hjælp normaliseret TPM (udskrifter per million læser) værdier i overensstemmelse med formlen: Fold forandring = log

2 (prøve gruppe /kontrol). P-værdien for hver miRNA i en parvise sammenligning blev udført baseret på Poisson test [34]. Clean læser blev justeret til Human reference genom (hg19, https://hgdownload.soe.ucsc.edu/) ved hjælp af SOAP 2 [35] til at klassificere gentage associerede små RNA og mRNA nedbrydes fragmenter. rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA blev identificeret ved at kortlægge ren læser til GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) og Rfam (https://rfam.sanger.ac.uk/) databaser.

Gene ontologi og Kegg Pathway Analyse

Targetscan 6.0 (https://www.targetscan.org) blev anvendt til at forudsige målgener for miRNA kandidater. De potentielle funktioner miRNA målgener blev kommenteret af Gene ontologi og Kegg pathway database. WEGO metode [36] blev brugt til at præsentere væsentlige GO vilkår. To statistiske værdier,

P-værdi

(Fishers eksakte test) og

q-værdi

[37], blev beregnet til at opnå veje, der var betydeligt beriget og kontrollerer den falske opdagelse sats.

Resultater

Tilstedeværelse af RNA i elbiler frigivet fra den humane koloncarcinomcellelinie LIM1863

Tidligere vi rapporterede, at LIM1863 celler frigiver to EV undertyper – exosomer og kaste mikrovesikler [4] og at inden exosomet subtype der er to forskellige exosom populationer, én beriget ved apikale overflade sortering proteiner (EpCAM-exos), den anden, basolaterale overflade sortering protein (A33-Exos); alle tre EV populationer har distinkte proteomanalyse profiler [4]. For at vurdere, om RNA’er specifikt sorteres i elbiler, og om de repertoirer af miRNA (Mirs) i de tre populationer vi isolerede forskellige, vi indledte en storstilet rensning af elbiler fra LIM1863 dyrkningsmedium (CM). For at generere nok elbiler for total RNA-analyse vi ansat en kontinuerlig cellekultur tilgang med cellelinie CL-1000 bioreaktor kolber for at generere ~1200 ml LIM1863 CM. sMVs blev oprenset under anvendelse af differential centrifugering og A33-Exos og EpCAM-Exos ved sekventiel immunoaffinitet capture, se figur. 1A. Exosomet populationer (A33-Exos og EpCAM-Exos) kunne ikke skelnes ved elektronmikroskopi (50-150 nm i diameter), mens sMVs var mere heterogen størrelse (100-1,500 nm diameter) og i overensstemmelse med den kendte morfologi (figur 1 AD); alle tre EV subpopulationer indeholdt stereotype exosom markører (TSG101, Alix, CD9) (figur 1E). Denne fremgangsmåde gav -20 mg sMVs og -3 mg A33- og EpCAM-Exos. For at bestemme om LIM1863 celle elbiler indeholder RNA, blev oprensede elbiler ekstraheret for total RNA, herunder små RNA fraktionen ved anvendelse af standard RNA-ekstraktion metode. Kvaliteten og kvantiteten af ​​det isolerede RNA blev bestemt under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (figur 1F). RNA udbytte: A33-Exos 8,8 ug RNA /-3 mg protein, EpCAM-Exos 9,2 ug RNA /-3 mg protein, og SMV: 72 ug RNA /-20 mg protein. Total RNA Bioanalyzer profiler viste, at LIM1863 celle-afledt sMVs indeholdt 18S og 28S ribosomale RNA (rRNA), mens A33- og EpCAM-Exos mangler påviselige mængder af disse arter af RNA i aftale med exosomer fra andre cellelinjer [22], [38 ], [39], [40].

(A) LIM1863 celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 5% FCS (exosom-forarmet), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i cellelinie bioreaktor klassiske kolber og dyrkningsmediet (CM) opsamlet. sMVs blev først isoleret fra CM (udbytte: -20 mg protein, 72 ug RNA). Derefter blev A33-Exos isoleret fra SMV-fri CM via anti-A33 antistof capture (udbytte: -3 mg protein, 8,8 ug RNA) og EpCAM-Exos blev isoleret fra A33-Exos-depleteret CM hjælp EpCAM-koblet magnetisk perler (udbytte: -3 mg protein, 9,2 ug RNA). (BD) elektronmikroskopi billeder af sMVs (B), A33-Exos (C) og EpCAM-Exos (D) viser en størrelse på 150-300 nm diameter og 40-100 nm i diameter for sMVs og A33- /EpCAM-Exos, henholdsvis. Scale bar: 100 nm (n = 3). (E) Western blot af elbiler (10 ug protein) til A33, Alix (PDCD6IP), TSG101, og CD9. (F) Total RNA elektroferogram analyse (Agilent Bioanalyzer) fra LIM1863 celler og afledte elbiler. Y akse elektroferogram er vilkårlig fluorescens enhed intensitet (FU) og x-aksen er migration tid i sekunder (s) og nukleotider (nt).

Et øjebliksbillede af små RNA-sekventering data

for at karakterisere små RNA i LIM1863-afledte elbiler blev Illumina HiSeq 2000 high-throughput teknologi ansat til at sekventere fire små RNA biblioteker (LIM1863 celler (CL), sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos). I første omgang lyder 20330356, 25388242, 22512338, og 24096270 rå blev produceret. Efter trimning lav kvalitet læser, adapter sekvenser og læser, hvor længder var mindre end 18 nt (BGI in-house software), svarende 18.850.584, 22.762.038, 16.407.260 og 18.195.289 total ren læser blev opnået. Vi næste kortlagt alle rene læser til miRBase (V.20) at anmærke kendte miRNA i hvert bibliotek. Resultaterne viste 15367876, 152815949, 12771308, og 13611284 kommenteret ren læser svarende til CL, sMVs, A33-Exos, og EpCAM-Exos henholdsvis; ren læser identificeret for andre små RNA-kategorier (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA, gentag-associerede RNA’er, mRNA nedbrydning) og fremavlet RNA’er er vist i tabel 1. Andelen af ​​miRNA i total RNA isoleret fra hver prøve svarede til 77,84, 74,81, 67,14 og 81,52 for A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs, og CL, henholdsvis.

Vi næste undersøgt de fire LIM1863 celle-afledt miRNA biblioteker til at fastslå, hvor mange af de 2578 kendte miRNA i miRBase v20 var påviselige. Uden cut-off 891, 863, 770, og 759 miRNA var repræsenteret i CL, sMVs, A33-Exos og EpCAM-Exos hhv. For denne undersøgelse, besluttede vi at bruge en strengere grænseværdi ( 5 TPM cut-off) at give os mulighed for at fokusere på højt repræsenteret miRNA. Dette resulterede i alt 254 miRNA til yderligere analyse (tabel S1), herunder hierarkisk gruppering af ekspressionsniveauerne (figur S1).

LIM1863-afledte elbiler indeholder 254 forskellige miRNA

En inspektion af tabel S1 viser, at 254 miRNA er repræsenteret i alle fire biblioteker, om end på forskellige niveauer af berigelse. Betydeligt, er mere end 75% af disse 254 miRNA stærkt repræsenteret i hvert bibliotek ( 10 TPM) (figur 2A), og de 20 miRNA i A33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs og CL biblioteker udgør 91,02%, 90,72%, 91,02%, og 91,42% af den tilsvarende samlede læser af miRNA. Interessant, de tre mest underrepræsenterede miRNA identificeret i LIM1863-afledte elbiler – miR-192-5p, miR-10a-5p, og miR-191-5p – tidligere er blevet rapporteret i væv og serum af CRC patienter som potentielle diagnostiske biomarkører. For eksempel har MIR-192 blevet observeret i væv [41] og serum /plasma [42] fra CRC patienter, MIR-191 i væv [41], [43] og serum /plasma [44], og MIR-10a i væv [45] og serum /plasma [42] fra CRC patienter. Desuden er MIR-192 rapporteret at undertrykke metastase af CRC [46] og dets syntese, sammen med den af ​​MIR-215 (også stærkt repræsenteret i vores 254 miRNA datasæt), induceres af p53 og vist at spille en vigtig regulerende rolle gener involveret i TGF-β-signalvejen [47], [48]. Salg

(A) fordeling af kendte miRNA sekvenser i CL, sMVs, A33- og EpCAM-exos baseret på normaliserede ekspressionsniveauer værdier (transkripter pr millioner læser, TPM). (B) Top 10 miRNA klynger baseret på analyse af de 254 miRNA identificeret med hensyn til deres placering på den menneskelige henvisning genom (hg19). (C) Fordeling af klynger miRNA på forskellige menneskelige kromosomer. Clustered miRNA (herunder miRNA nummer) blev identificeret i henhold til deres kromosomale steder, som bør være inden for 10 k bp på kromosomet; miRNA fra samme forløber (-5p, -3p) kun blev anset for én gang. (D) Tre-vejs Venn-diagram skildrer de 63 miRNA beriget med sMVs, A33- og EpCAM-Exos, i forhold til CL. 6 miRNA er fælles for alle elbiler, mens 22 miRNA er fælles for begge exosomal datasæt. miRNA selektivt beriget i hvert EV miRNA datasæt:. A33-Exos 32/56, EpCAM-Exos 2/25, og sMVs 4/13

Vi næste foretaget en detaljeret miRNA cluster analyse (dvs. identificering grupper af miRNA kodet af polycistroniske udskrifter, menes at være co-udtrykte [49]) af de 254 miRNA datasæt. Af de 153 kendte miRNA klynger beliggende inden 10 K bp afstand på det menneskelige genom 34 blev identificeret. Flere af disse klynger er statistisk beriget (figur 2B, tabel S2). Ifølge

s

-værdier beregnes ved Fishers eksakte test de fem miRNA klynger identificerede

klynge 6

(6/6 medlemmer identificeres miR-17, -18a, -19a, -19b -1, -20a, og -92a-1),

klynge 4

(6/8 medlemmer identificeres miR-532, -188, -500a, -362, -501, -500b, -660, og -502),

cluster 16

(4/4, miR-941-1, -941-2, -941-3, og 941-4),

klynge 21 Hotel (3 /3 medlemmer identificeres miR-200a /200b /429), og

cluster 28

(3/3 medlemmer identificeret, miR-23a, -27a, og 24-2). Af disse

cluster 6

miRNA (MIR-17~92a familie) er blevet rapporteret at være stærkt repræsenteret i flere faste tumorer, herunder bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata- og mave [50]. Ekspression af

klynge 4

miRNA reguleres af E2F1 [50], kan direkte målrette BCL2 /11 /Bim at undertrykke Myc-induceret B-celle-lymfom genesis [51] og regulere adskillige gener i TGF-β pathway [ ,,,0],52]. Det kromosomale fordeling af disse klynger (figur 2C) viste kromosomer-X (8 klynger), -1 (5 clusters), og -9 (3 klynger) for at være den mest fremtrædende.

Vi undersøgte dernæst repræsentation af forskellige miRNA familiemedlemmer i 254 miRNA datasæt (tabel S3). Denne analyse afslørede fremtrædende plads i alle tre elbiler af medlemmer fra følgende familier: lad-7 (12/12 medlemmer observerede, lad-7a /b /c /d /e /f /g /i, miR-98-5p) , miR-181 (6/6, miR-181a-1 /a-2 /b-1 /b-2 /c /d), miR-30 (6/6, miR-30a /b /c-1 /c-2 /d /e), mIR-320 (7/8, mIR-320a /b-1 /b-2 /c-1 /c-2 /d-1 /d-2), mIR-8 ( 5/5, mIR-141, mIR-200a /b /c og mIR-429), mIR-17 (6/8, mIR-106a /b, mIR-17, mIR-18a, mIR-20a og mIR-93 ), miR-192 (2/2, miR-192 og miR-215) og miR-25 (3/4, mir-25 og mir-92a /b).

63 miRNA er fortrinsvis beriget med LIM1863-afledte elbiler

for at vurdere, om nogle miRNA specifikt sorteres i elbiler, vi gennemførte en miRNA-berigelse analyse for A33-Exos, EpCAM-Exos og sMVs. MiRNA med 2 gange skifter i forhold til CL miRNA blev filtreret ud, hvilket giver 63 miRNA til sammenligning (tabel 2). Mirna repræsentation var mest fremtrædende i oprenset A33-Exos (56 miRNA repræsenteret, hvoraf 32 er selektivt beriget i forhold til andre elbiler), efterfulgt af EpCAM-Exos (25 miRNA, 2 selektivt beriget) og sMVs (13 miRNA, 4 selektivt beriget) (tabel 2, figur 2D). Der er kun 6 miRNA sekvenser fælles for alle tre EV undertyper, herunder tre ‘passager Strand’ miRNA (miRNA * sekvenser) (miR-451a, miR-4454, miR-7641, lad-7a-3p *, lad-7f-1 -3p * og mIR-574-5p *). Til dato har kun miRNA-451a tidligere blevet observeret i elbiler (embryonale stamceller-afledte elbiler, [53]). Betydningen af ​​tre miRNA * sekvenser, der er fælles for alle tre EV undertyper er ikke klart på nuværende tidspunkt, og må afvente en analyse af en statistisk signifikant antal EV prøver fra andre CRC-cellelinje kilder. Samlet set i berigede 63 miRNA datasæt vi observerer 12 bestemte miRNA * sekvenser, hvoraf tre (lad-7a-3p *, lad-7f-1-3p *, miR-574-5p *), er stærkt repræsenteret i alle EV subpopulationer (tabel 2).

Vi næste undersøgt 63 miRNA datasæt (tabel 2) at undersøge, om der var nogen miRNA, der gjorde det muligt at skelne mellem exosomer (A33-Exos og EpCAM-Exos) og sMVs. Denne analyse viste 7 miRNA betydeligt beriget med exosomer (HSA-miR-320a 320b, -320c, -320d 221-3p, -374-5p, og -200c-3p), i forhold til sMVs. Påfaldende, Mirs-320a /b, -221-3p og -200c-3pc havde mere end 1000 TPM i hvert exosome bibliotek med 1,18-2,28 log

2 forholdet fold ændringer i forhold til tilsvarende værdier i området 500-800 TPM ( -0.33-1.88 log

2 fold ændringer) i sMVs og CL-biblioteker. MIR-320a er impliceret i CRC på grund af sin evne til at undertrykke celleproliferation ved at målrette β-catenin [54]. Ekspressionen af ​​MIR-320a kan anvendes til at vurdere risikoen for CRC metastase grund af sin evne til at binde direkte til 3′-UTR af neurophilinligander (NRP-1), en co-receptor for vaskulær epitelial vækstfaktor [55]. Tilstedeværelsen af ​​miR-320a i plasma er blevet rapporteret som en potentiel biomarkør for tidlig påvisning af CRC [44]. MIR-221-3p, sammen med MIR-222, som vi også ser i højt udtrykte 254 miRNA datasæt (tabel S1), er blevet valideret eksperimentelt at regulere celleproliferation ved at målrette p27 /Kip1, en cellecyklusinhibitor og tumor suppressor, at fremme tumorigenese [56], [57]. Interessant nok har forhøjede niveauer af MIR-222, sammen med MIR-17-3p, -135b, -92 og -95, er rapporteret i CRC patient plasma og tumor væv [58]. MIR-200c, der sammen med MIR-141 er et medlem af MIR-141~200c klynge (cluster 59, tabel S2) samt MIR-8-familien (tabel S3) er rettet mod transskriptionsrepressor zink-finger E-box bindende homeobox 1/2 (ZEB1 /2) [59] og SIP1 [60] er en kritisk inducer af EMT i flere kræfttyper, herunder colorectal [61]. Cirkulerende miR-141 er en potentiel biomarkør for CRC metastaser [62]

Et iøjnefaldende træk ved de 63 miRNA (TPM 5). Beriget med LIM1863-afledte elbiler (tabel 2) var den observation, at 38 var udelukkende repræsenteret i

en

eller

andre

af de tre EV biblioteker, i forhold til CL-biblioteket. Fremmest var konstateringen af, at 32/38 identificerede miRNA var eksklusivt til A33-Exos.