PLoS ONE: En melanom hjernemetastaser med en donor-Patient Hybrid Genome efter knoglemarvstransplantation: First Beviser for Fusion i Human Cancer

Abstrakt

Baggrund

Tumor cellefusion med bevægelige knoglemarv -afledte celler (BMDCs) har længe været postuleret som en mekanisme for kræft metastaser. Mens der er stor støtte til dette fra cellekultur og dyreforsøg, det er endnu ikke bekræftet i human cancer, som tumor og marv-afledte celler fra den samme patient ikke let kan skelnes genetisk.

Metoder

Vi udførte genotypebestemmelse af en metastatisk melanom til hjernen, der opstod efter allogen knoglemarvstransplantation (BMT) ved anvendelse retsmedicinsk kort tandemgentagelse (STR) længde-polymorfier at skelne donor og patient genomer. Tumor celler blev isoleret fri for leukocytter med laser mikrodissektion, og tumorceller og pre-transplantation blod lymfocyt DNA blev analyseret for donor og patient alleler på 14 autosomale STR loci og kønskromosomerne.

Resultater

alle alleler hos donor og patient før BMT lymfocytter blev fundet i tumorceller. Allelerne viste uforholdsmæssige relative mængder i lignende mønstre hele tumoren, hvilket indikerer tumoren blev indledt ved en klonal fusion begivenhed.

Konklusioner

Vores resultater kraftigt støtter fusion mellem en BMDC og en tumor celle spiller en rolle i oprindelsen af ​​denne metastase. Afhængig af hyppigheden af ​​sådanne begivenheder, kunne resultaterne have stor betydning for forståelsen af ​​dannelsen af ​​metastaser, herunder oprindelsen af ​​tumorfremkaldende celler og kræft epigenome

Henvisning:. Lazova R, Laberge GS, Duvall E, Spoelstra N, Klump V, Sznol M, et al. (2013) En melanom hjernemetastaser med en donor-Patient Hybrid Genome efter knoglemarvstransplantation: First Beviser for Fusion i Human Cancer. PLoS ONE 8 (6): e66731. doi: 10,1371 /journal.pone.0066731

Redaktør: Eva Mezey, National Institutes of Health, USA

Modtaget: Februar 27, 2013; Accepteret: 9 maj 2013; Udgivet: 26 juni 2013

Copyright: © 2013 Lazova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveres delvist af en ubegrænset gave fra Amway Corporation og fra University of Colorado Cancer center NCI Support Grant (P30CA046934). Yderligere omkostninger blev dækket internt af de involverede institutioner: Yale University, University of Colorado, og Denver Police Crime Lab. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Finansiering af denne undersøgelse blev leveret delvist af en ubegrænset gave fra Amway Corporation. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Tumor cellefusion med bevægelige leukocytter såsom myeloid herkomst celler eller stamceller er sat frem som et samlende forklaring på metastase [1] – [4]. Mere end et århundrede siden foreslog Aichel at kræft kan skyldes fusion mellem bevægelige leukocytter og andre somatiske celler, med de kvalitative forskelle mellem kromosomer forårsager hybrid at være “smidt ud af stien til moderen celler til at danne hvad der er kommet for at blive kendt som en malign celle “[5]. Cancer cellefusion blev først opdaget, da humane glioblastom-celler blev implanteret i hamstere og metastaser udviklet med en human-hamster karyotype [6]. Dette blev efterfulgt af rapporter fra mange laboratorier for kræft cellefusion i kultur og mus [1] – [3]. Mere for nylig, da dårligt metastatiske Cloudman S91 muse-melanomceller blev fusioneret med normal mus eller humane makrofager i kultur, hybrider implanteret i mus viste høje metastase med nedsat overlevelsestid på værterne i forhold til dem af de kontrolforanstaltninger melanomceller anvendt som fusionspartnere [7]. Metastatiske hybrider var meget pigmenteret, karakteristisk for melanocyt afstamning, og også udtrykte adskillige myeloide afstamningsceller egenskaber såsom forbedret kemotaktisk motilitet, autofagi og makrofag-lignende glycosyleringsmønstre [8] – [10]. Når humane makrofager blev anvendt som fusionspartnere med muse-melanomceller, hybrider udtrykkes både humane og muse SPARC gener, hvilket indikerer, at epigenomes begge fusionspartnere blev aktiveret [11]. Tilsvarende, når fluorescerende-mærket muse knoglemarvafledte celler blev indført gennem parabiosis i mus med intestinale tumorer, makrofag-cancer cellehybrider dannet som udtrykte transcriptomes karakteristiske for begge parentale fusionspartnere [12]. Ligeledes implantation af humane glioblastom eller Hodgkins lymfom celler i hamster kinder resulterede i metastatiske humane-hamster hybrider med co-ekspression af humane og hamster gener [13] – [14]. Således muse-mus, humant-muse og human-hamster hybrider alle co-udtrykkes cancercelle og normale cellegener og viste forstærket metastatiske kapaciteter. I andre undersøgelser fusion af cancerceller med BMDC er i kultur induceret aneuploidi, lægemiddelresistens, øget invasionsevne og tumor heterogenitet [15] – [20]. I humane melanomer, blev påvist “stealth” melanomceller i lymfeknudemetastaser, der viste egenskaber konsistente med at være fusion hybrider [21]. Cirkulerende tumorceller tilfangetagne fra blodet af patienter med melanom, bugspytkirtel og tarmkræft co-udtrykte carcinom og leukocytiske markører tyder BMDC-tumor cellefusion [22].

Men fusion og genomisk hybridisering er endnu ikke bevist på en genetisk basis i human cancer, idet genomiske forskelle mellem celler fra den samme patient ikke let skelnes. For at omgå dette problem, vi har analyseret sekundære maligniteter opstår post-allogene knoglemarvstransplantationer (BMT). I to tidligere rapporter demonstrerede vi donor alleler i patientens kræftceller, men der var ingen bestemmelse til at identificere patientens alleler og fusion kunne således ikke bevises [23] – [24]. Her brugte vi STR længde-polymorfier og retsmedicinske genetiske teknikker til at analysere genomisk DNA i et melanom hjernemetastaser fra en patient, der tidligere havde modtaget en BMT fra sin bror. Resultaterne viser tilstedeværelse af donor og patient alleler i kræftceller i hele tumoren, hvilket indikerer, at en BMDC-kræftcelle fusion begivenhed havde indledt generation af denne tumor. Patologi analyser og matematisk modellering af allele mønstre støttede denne konklusion.

Metoder

Etik erklæring

Alle prøver, der anvendes i denne undersøgelse blev allerede eksisterende og anonymiseres, før de modtages af Yale forskerholdet. Fritagelse blev givet under Yale IRB-protokol # 070900309 (JP og RL) fra Yale University menneskelige forskningspotentiale Protection Program, Institutional Review Board.

Kilde af væv

Patienten var en 68-år- gammel mand, der fik en allogen BMT fra sin bror til behandling af B-celle lymfom. Hans sidste engraftment /kimærisme profil var Modtager 3%; Donor 97%. Seks år senere blev patienten diagnosticeret med metastatisk melanom involverer lymfeknuder, lever og hjerne, der stammer fra en ukendt primær tumor. Vi analyserede en hjernemetastaser (betegnet “MH3”) bestående af en 0,5 × 0,2 × 0,3 cm formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv. Tumoren blev fjernet kirurgisk, fikseret i formalin, og indlejret i paraffin ved standard histologiske procedurer. Pre-transplantation donor og patient lymfocytter blev opbevaret ved -90 ° C i Yale-New Haven Hospital stamcellebank og hentes efter tumor analyser blev gennemført.

Laser mikrodissektions

Håndtering og bearbejdning af vævsprøver blev udført under anvendelse ultrarent, DNA-free udstyr. Fem u–tykke histologiske snit blev skåret og immunfarvet for LCA /CD45 (klon 2B11 + PD7 /26, Dako, katalog N1514) ved hjælp af en autostaineren (DAKO, Carpinteria, CA) på Yale Dermatopathology Laboratories. Antistoffet blev undersøgt for farvning effektivitet som beskrevet i File S1. Tumor celler blev mikrodissekeres fri af LCA /CD45-positive celler fra 9 tumor regioner ved hjælp af en Arcturus XT laser dissektion mikroskop system. Hver prøve bestod af dissekerede tumorceller puljede fra et eller flere områder af den samme sektion.

DNA-ekstraktion

DNA-ekstraktion og STR-analyser var ved Denver Police Department Crime Laboratorium DNA Unit ved hjælp standard retsmedicinske drift og valided procedurer [25]. Prøver blev opsamlet i GeneAmp tyndvæggede reaktionsglas (0,5 ml; Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Lymfocyt DNA blev ekstraheret på BioRobot EZ1 platform med EZ1 DNA Investigator kit trace DNA protokol (Qiagen i USA). Total human og mandlige DNA blev vurderet med Quantifiler Duo DNA Kvantificering Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). To DNA ekstraktionsmetoder blev anvendt. For tumorprøver 1-4 blev DNA ekstraheret under anvendelse af 5% Chelex med proteinase K procedure [26]. For prøver 5-9 blev DNA ekstraheret under anvendelse RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE væv (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), hvilket forbedrede DNA udbytte ca. 5 gange (ikke vist). Antallet af tumorceller mikrodissekeres pr prøve blev automatisk registreret af Arcturus XT-systemet.

PCR amplifikation

PCR blev udført med AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA ). Almindeligvis blev 1 ng total DNA målrettet i hver PCR-amplifikation. I prøver med mindre DNA ( 0,1 ng /pl) blev prøver opkoncentreret 5-20 gange ved anvendelse af en Microcon centrifugal filter (Ultracel YM-100, Millipore, Billerica, MA, USA)

Forensic genetiske analyser. af STR loci

Hver STR locus blev valgt til at være neutrale i forhold til andre genetiske kobling eller foreninger med enten Mendelsk eller ikke-mendelske lidelser. Den loci var polymorfe og udstillet acceptable niveauer for heterozygositet, typisk 70% eller højere. De kunne analyseres sammen som en PCR multiplex og var robust for nedbrudt DNA [25]. Genotypebestemmelse af PCR-produkter og fortolkning af Short Tandem Repeat-STR alleler blev udført ved hjælp af kapillar elektroforese på en ABI Prism 3130 Genetic Analyzer med GeneMapper ID Software version 3.2 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). X og Y-kromosomer blev påvist under anvendelse af amelogenin assay samtidig med autosomal STR analyser [25]. Kvalitative og kvantitative signal-til-støj tærskler blev bestemt med ABI Identifiler Kit. Alle toppe 50 relative fluorescens enheder blev scoret som sande alleler baseret på a) højde og b) peak morfologi [25]

Allelic stutter

Allel signal toppe kan overlappe teknisk “stutter”. positioner fra andre alleler. Valideringsundersøgelser etableret fortolkningsretningslinjer for retsvidenskabelige markører til at skelne ægte allel signaler fra stutter for en given allel i hvert locus [27] – [28]. Alle allel opkald skønnes væsentlig i denne undersøgelse var i overensstemmelse med disse retningslinjer, og blev ikke stutter overlapninger.

Statistisk modellering og analyse

Bayesianske statistiske modeller for fusion og donor celle forurening blev monteret og sammenlignet ved hjælp af Markov kæde Monte Carlo metoder [29] gennemført ved hjælp JAGS [30] og R [31] software som beskrevet i File S2.

Resultater

Patologi analyserer

Vi udførte omfattende patologiske analyser at sikre, at laser dissekeret tumorprøver blev ikke angrebet af infiltrerende donor leukocytter. For at detektere leukocytter vi anvendte et antistof mod leucocyt fælles antigen (LCA /CD45) udtrykt på overfladen af ​​modne leukocytter og hæmatopoietiske progenitorceller. I positive kontrolforsøg antistoffet viste . 99% farvning effektivitet mod testcases af dermatitis og lymfom (. Figur S1 og S2, tabel S1 i File S1)

Farvning af MH3 melanom for LCA /CD45 afsløret at nogle regioner indeholdt LCA /CD45-positive leukocytter blandet med LCA /CD45-negative melanomaceller (fig. 1A). Disse blev anset for ikke egnet til laser mikrodissektion. Men andre områder indeholdt rene populationer af LCA /CD45-negative melanomceller i grupper af ti til hundrede, der var egnet til mikrodissektion (Fig. 1B-D). Tilsvarende, når den tumor blev farvet for S100 til påvisning melanomceller [32] blev nogle tumor regioner infiltreret med S100-negative leukocytter, mens andre kun indeholdt S100-positive melanomceller (fig. 2A og B). Således viste to forskellige immunkemiske analyser, at MH3 tumoren indeholdt områder af næsten rene maligne melanomceller, der kunne være rent mikrodissekeret med 1% kontaminerende leukocytter. En mere detaljeret analyse af S100 farvning præsenteres i fig. S3 og S4 i File S1.

A. Et område med brune LCA /CD45-positive leukocytter (pil) blandet med blå LCA /CD45-negative kræftceller. B-D. Tilstødende områder fra samme sektion, der kun indeholder blå LCA /CD45-negative kræftceller.

A. Et område på S100-positive tumorceller blandet med infiltrerende S100-negative leukocytter (pile). B. Et område, der kun indeholder S100-positive tumorceller. Mere detaljerede patologi analyser præsenteres i figurerne S3 og S4 i File S1.

Laser mikrodissektion og STR-analyser

Tumor sektioner blev farvet med LCA /CD45 før laser dissektion og tumorceller blev dissekeret fri af LCA /CD45-positive leukocytter. Tumorceller blev isoleret fra 9 regioner i hele tumoren (prøverne 1-9), og DNA blev ekstraheret og amplificeret i alleler i 14 STR-loci. Alle alleler fundet i forud for transplantation donor og patient blodlymfocytter blev også påvist i tumorceller. For hvert locus der var mindst en allel er fælles for både donor og patient, i overensstemmelse med den broderlige forhold. Otte loci udstillet donor- specifikke alleler og seks af disse udstillede både donor og patient specifikke-alleler. Dette indikerede, at tumorcellerne var donor-patient hybrider (fig. 3, tabel 1). Især tumor allele forhold afveg mellem loci, men for enhver given locus allel forhold var ens i alle 9 regioner af tumoren. Dette antydede en forholdsvis stabil genotype og sandsynligvis klonal oprindelse metastase. De resterende loci var intetsigende vedrørende fusion med kun delt eller patient specifikke alleler og ingen donor alleler (tabel 2;. Figur S5 i File S1).

Vist er “informative” loci udstiller donor og patient specifikke alleler i præ -BMT lymfocytter. Tumor loci er anført i rækkefølge efter relativ overflod af donor-specifikke alleler (rød stjerne) sammenlignet med patient-specifikke (blå stjerne) og delte alleler (sort stjerne). Allel toppe 50 relative fluorescens enheder blev censureret som “ingen opkald” (åbne cirkler). Loci med ingen påviselige alleler efter PCR-amplifikation (-). Vejviser

Endelig passer vi statistiske modeller til sammenligning sandsynligheden for donor BMDC-tumor cellefusion versus donor leucocyt forurening (Fig . 4), der er beskrevet detaljeret i fig. S6, S7, S8, S9, tabel S2 i File S2. Sammensmeltningen model passer til dataene bedre, som det fremgår af dens mindre afvigelser (fig. 4A og B) og dens højere log pseudo-marginal sandsynlighed (LPML), hvilket oversteg LPML for kontaminering model ved en forskel på 71,4 (Fig. 4C og D, rød linje). . En kalibrering procedure [33] – [34] for at vurdere betydningen af ​​denne forskel gav sandsynligheder

P

0,005 for forurening og

P

0,3 til fusion (fig 4C og D ), der viser, at den observerede LPML forskellen er meget sjældent under forureningen model, men ikke sjældent under fusion model. disse data stærkt Således støtter fusion løbet donor forurening celle som forklaringen på de observerede allele doser

Paneler A og B:. afvigelser under forurening og fusion modeller; mindre afvigelser indikerer bedre pasform. Paneler C og D: En kalibrering viser den observerede LPML forskel (røde linjer) er sjælden under forureningen model, men typisk under fusion model. Mere detaljerede statistiske analyser præsenteres i File S2.

Diskussion og konklusion

STR analyser af tumor-DNA afslørede, at donor og patient alleler var til stede sammen på flere loci, og at der var udbredte allele ubalancer og aneuploidi. En ulempe var den manglende evne til at udføre STR-analyser på individuelle tumorceller, men for denne tumor den nedre grænse for DNA opsving for STR-analyser var omkring 500 celler, selv ved anvendelse af proceduren DNA-ekstraktion for FFPE celler, der forbedrede DNA opsving. Således kunne vi ikke definitivt udelukke, at de mønstre kan skyldes en kimære blanding af patientens tumorceller og donor BMDCs. Men dette er usandsynligt af følgende grunde: 1) i et givet locus allel forhold var ens i hele tumoren. Det er vanskeligt at forklare disse gentagne mønstre som følge af kimære blandinger, da dette ville kræve, at de forskellige celletyper eksisterede sammen i de samme forhold i hele tumoren. Især mens de fleste af den informative tumor loci havde patient- og delte alleler i større relativ overflod til donor-specifikke alleler blev tumor locus D13S317 vendt, med patienten specifikke allel fraværende og donor-specifikke allel i forgrunden. Siden den første dosis af genomisk DNA for hver prøve var afgørende for, PCR-produkt intensitet og varierede meget mellem prøver, i betragtning af den sammenhæng i allele nøgletal fra prøve til prøve tilbageførsel af DNA dosering på locus D13S317 kan ikke forklares med fortrinsret PCR eller leukocyt forurening. 2) De tumorceller blev dissekeret fra regioner fri af LCA-positive celler (fig. 1). 3) Det er usandsynligt, at resultaterne skyldtes kontaminerende DNA fra eksogene kilder. Enhver kontaminerende DNA ville have haft til at komme fra donor eller patient, da alle de fundne i tumorcellerne kunne bogføres i pre-transplantation lymfocytter fra den ene eller den anden af ​​disse personer alleler. En kilde til denne kontamination kan lymfocytterne selv som de indeholdt store mængder DNA sammenlignet med dem i tumorprøverne. Dette blev imidlertid udelukket, fordi de lymfocytter blev hentet fra langtidsopbevaring i flydende N

2 først efter tumor analyser blev gennemført. Også, havde der været en omsiggribende kilde til forurenende DNA i tumoren, burde det have været til stede på samme niveau i de nekrotiske områder og dette ikke var tilfældet, som diskuteret ovenfor. 4) Vores statistiske analyser af allele mønstre stærkt begunstiget BMDC-melanom cellefusion løbet leukocyt forurening modeller.

I stamcellebiologi både transdifferentiering og fusion synes at være operativ i omdannelsen af ​​stamceller til differentierede somatiske celler [ ,,,0],35] – [38]. Men oprindelsen af ​​cancer stamceller /tumorfremkaldende celler er kontroversiel. I to tidligere rapporter om sekundære malignances opstår i patienter skrive allogen knoglemarvstransplantation, blev donor-gener fundet i tumorceller, hvilket kraftigt antyder fusion [23] – [24]. Men i ingen af ​​tilfældene var patientspecifikke gener også identificeret i tumorcellerne og alternative mekanismer til fusion kunne ikke udelukkes, såsom transdifferentiering af donor stamceller til kræftceller. Men i tumoren heri beskrevne analyser retsmedicinske STR afslørede, at både donor og patient alleler var til stede i tumorcellerne hele og tumoren syntes at bestå hovedsagelig om ikke udelukkende af BMDC-tumor cellehybrider. Endvidere er de gentagne alleliske mønstre for hvert locus i hele tumoren indikerede en klonal oprindelse metastase og foreslog, at tumoren blev genereret fra en tidligere fusion begivenhed mellem en donor BMDC og en patient tumorcelle. I det mindste i dette tilfælde konkluderer vi, at den tumorfremkaldende cellen var en BMDC-tumorcelle hybrid. I hvilket omfang denne mekanisme er operativ i andre tumorer er endnu ikke fastslået.

I tidligere undersøgelser, eksperimentel tumor hybrider genereret

in vitro

mellem kræftceller, herunder melanom, og normale epitelceller eller fibroblaster blev generelt undertrykt i tumorigenicitet og ekspressionen af ​​differentierede funktioner, der fører til opdagelsen af ​​tumorsuppressorgener [39] – [40]. Men senere, ved hjælp af makrofager som fusionspartnere med melanomceller, de heraf hybrider udtrykte gener og differentierede træk fra både forældre og metastase blev markant forbedret [7] – [11]. Dette indikerede co-ekspression af epigenomes fra begge forældrenes slægter. Co-udtrykkes hybride genomer kunne forklare kompleksiteten af ​​genekspressionsmønstre i cancerceller og også hvordan maligne celler kunne have sådan et stort repertoire af myeloide-lignende funktioner såsom angiogenese, matrix ændringer, motilitet, kemotaxi og immune signalveje, samt som gennemgår epidermal-mesodermal overgang [1], [41].

En model for metastase som følge af fusion af knoglemarv-afledte celler et diagram skematisk i figur 5. Mens dette er stort set blevet verificeret i dyretumormodeller og cellekultur, beviser til fusion i human kræft har hidtil manglet. Vores resultater viser for første gang i en human cancer, at frembringelsen af ​​en metastase og erhvervelse af dens afvigende genetiske mønstre skyldtes fusion og genomisk hybridisering mellem en BMDC og en cancercelle. Afhængig af hyppigheden af ​​sådanne begivenheder, kunne resultaterne have stor betydning for forståelsen af ​​metastase, herunder oprindelsen af ​​tumorfremkaldende celler og kræft epigenome.

En motile BMDC (rød), såsom en makrofag eller stamcelletransplantation er tiltrukket af en cancercelle (blå). De ydre cellemembraner af de to celler bliver knyttet. Fusion forekommer med dannelsen af ​​en bi-nukleeret heterokaryon har en kerne fra hver af fusionspartnere. Den heterokaryon går gennem genomisk hybridisering skabe en melanom-BMDC hybrid med co-udtrykte epigenomes, giver dereguleret celledeling og metastatisk kompetence til hybrid.

Støtte Information

File S1.

Tal S1, S2, S3, S4, S5 og tabel S1

doi:. 10,1371 /journal.pone.0066731.s001

(PDF)

File S2.

Tal S6, S7, S8, S9 og tabel S2

doi:. 10,1371 /journal.pone.0066731.s002

(PDF)

Tak

Vi takker Prof. Douglas Pågående, Yale School of Medicine, for første antyder brugen af ​​sekundære maligniteter efter BMT og for hans hjælp med manuskriptet.