PLoS ONE: Påvisning af somatiske mutationer af High-Resolution DNA Melting (HRM) Analyse i flere kræftformer

Abstrakte

Identifikation af somatiske mutationer i kræft er et vigtigt mål for at forstå og overvåge de begivenheder relateret til kræft initiering og progression. Høj opløsning smeltning (HRM) kurveanalyse repræsenterer en hurtig, post-PCR høj kapacitet fremgangsmåde til scanning af somatiske sekvensændringer i målgener. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere følsomheden og specificiteten af ​​HRM analyse for tumor mutation screening i en række tumorprøver, som omfattede 216 frosne pædiatriske små afrundede blå-celletumorer samt 180 paraffinindlejrede tumorer fra bryst-, endometrie- og ovariecancere (60 af hver). HRM analyse blev udført i exons fra følgende kandidatgener kendt for at havnen etablerede almindeligt observerede mutationer:

PIK3CA

,

ERBB2

,

KRAS

,

TP53

,

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, og

FGFR3

. Tovejs sekventering analyse blev anvendt til at bestemme nøjagtigheden af ​​HRM analyse. For de 39 mutationer observeret i frosne prøver, følsomheden og specificiteten af ​​HRM analyse var 97% og 87%, hhv. Der var 67 mutation /varianter i paraffinindlejrede prøver, og følsomheden og specificitet for HRM-analyse var 88% og 80%, hhv. Paraffinindlejrede prøver kræver større mængde af renset DNA for høj ydeevne. Sammenfattende HRM analyse er en lovende moderat-throughput screening for mutationer blandt kendte kandidat-genomiske regioner. Selv om den samlede nøjagtighed synes at være bedre i frosne prøver, blev der påvist somatiske ændringer i DNA ekstraheret fra paraffinindlejrede prøver

Henvisning:. Gonzalez-Bosquet J, Calcei J, Wei JS, Garcia-Closas M, Sherman ME, Hewitt S, et al. (2011) Påvisning af somatiske mutationer af High-Resolution DNA Melting (HRM) Analyse i flere kræftformer. PLoS ONE 6 (1): e14522. doi: 10,1371 /journal.pone.0014522

Redaktør: Philip Awadalla, University of Montreal, Canada

Modtaget: 2. marts, 2010; Accepteret: 8. december 2010; Udgivet: januar 17, 2011

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

finansiering:.. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

for nylig de første kræft genomer til at være fuldstændig sekventeret har afsløret en unanticiapted bredde og kompleksitet af somatiske ændringer [1], [2], [3]. Opdagelsen af ​​somatiske sekvensændringer, har fremskyndet undersøgelse af ir underliggende mekanismer i carcinogenese. Somatiske ændringer impliceret i kræft udvikling og vækst fordel kaldes

driver

mutationer. Men de fleste af somatiske ændringer i kræft genomer er en konsekvens af genomci ustabilitet og synes at være

passager

eller tilskuer mutationer, som sandsynligvis ikke vil være involveret i onkogenese [4], [5]. Storstilede sekventering undersøgelser har vist, at forekomsten og underskrift af somatiske mutationer i humane kræftformer er meget varierende [5], [6], [7], [8]. Baseret på disse undersøgelser, kan vi vurderer, at hovedparten af ​​somatiske mutationer i cancerceller sandsynligvis vil være passager mutationer, mens et mindretal skønnes at være driver mutationer [5], [7]. Den fulde landskab af forekomsten af ​​mutationer samt deres funktionelle konsekvenser vil ikke blive værdsat, før tusindvis af kræft genomer er blevet sekventeret.

Sequencing kræft genomer er en formidabel opgave, som kræver dyre teknologier og beregningsmæssige støtte til at samle store portioner af genomet. På grund af den intense interesse i at identificere de vigtigste somatiske ændringer, har undersøgelser fokuseret på teknikker til screening eller analyse områder af interesse. De fleste undersøgelser har koncentreret sig om kodende regioner og tilstødende regulatoriske regioner introniske eller formodede [9]. En af disse teknikker er den høje opløsning smeltning (HRM) kurveanalyse, en polymerasekædereaktion (PCR) baseret high throughput assay til påvisning variation DNA-sekvens ved at måle ændringer i smeltningen af ​​et DNA-duplex, der med held har været anvendt med DNA ekstraheret fra både frosset og paraffinindlejret væv [10], [11], [12].

HRM specifikke PCR-produkter genereres at forespørge konformationelle forskelle, også kendt som dissociationskurve analyse ved anvendelse af traditionelle realtid PCR-platforme. Det er udnyttet i kombination med et dobbeltstrenget DNA-bindende farvestof for at karakterisere primer-relaterede ikke-specifik amplificering (eller primer dimer) til påvisning af et specifikt mål. Single-baseændringer i PCR-produkter er opdaget af ændrede HRM egenskaber overvåges gennem frigivelse af fluorescerende dobbeltstrenget DNA bindende farvestof [13], [14]. Udviklingen af ​​nøjagtige og billige instrumenter, der tilbyder HRM kapaciteter og nye fluorescerende farvestoffer, gør denne metode attraktivt for målrettet mutation scanning og også kønsceller genotypebestemmelse. HRM-analyse anvendes til at pre-scan kandidatgener mistænkelige indslæbe mutationer, en markant reduktion af mængden af ​​DNA-sekventering, der skal udføres [15], [16], [17], [18], [19], [20].

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere følsomheden og specificiteten af ​​en billig HRM analyse platform for mutation scanning af enkelt-base-variation i en række tumorprøver: frosne pædiatriske små afrundede blå-celle tumorer og paraffinindstøbt tumorer fra bryst, endometrium og ovariecancer. Tovejs sekvensanalyse blev udført for at bestemme nøjagtigheden af ​​dette DNA HRM-teknologi.

Metoder

Etik Statement

Institutional Review Board for den polske Breast, æggestokkene, og endometriecancer Study blev godkendt af National Cancer Institute (NCI), i Bethesda, MD, M. Sklodowska Institut for Onkologi og Cancer center i Warszawa, og Institut for Arbejdsmedicin (IOM) i Lodz, både i Polen [21] . Skriftligt informeret samtykke til deltagelse på undersøgelser blev opnået ved de deltagende institutioner fra alle involverede deltagere

Alle frosne prøver fra pædiatriske små afrundede blå-celle tumorer og opnået fra Cooperative Menneskelig Tissue Network (http:. //Chtn. nci.nih.gov/), blev anonymiseret, og vores protokol blev revideret af Kontoret for human emner Forskning ved National Institutes of Health, Bethesda, MD, og ​​anses fritaget.

DNA-prøver

frosne vævsprøver.

Snap frosne tumor prøver blev opnået fra Cooperative humant væv Network (https://chtn.nci.nih.gov/). Neuroblastom-cellelinier og deres dyrkningsbetingelserne er beskrevet andetsteds [22]. Genomisk DNA blev ekstraheret fra frosne primære tumorprøver (neuroblastom, n = 140; rabdomyosarkom, n = 63) og neuroblastom-cellelinier (n = 13) under anvendelse af en offentliggjort protokol [23]. DNA-koncentrationen blev kvantificeret ved hjælp NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE), og derefter indstillet til den samme koncentration, 10 ng /pi, for de 12 analyser. Matchet kontrol genomisk DNA var tilgængelig fra perifert blod i 43 kræftformer.

Paraffinindstøbte vævsprøver.

Den polske Breast, æggestokkene, og endometriecancer Study er en del af en ringanalyse mellem USA National cancer Institute (NCI), M. Sklodowska Institut for Onkologi og cancer center i Warszawa, og Institut for Arbejdsmedicin (IOM) i Lodz [21] beregnet til at studere risikofaktorer for brystkræft, endometriecancer og ovariecancer [24], [25], [26]. Paraffin blokke af tumorvæv fra deltagerne i denne undersøgelse, der blev opereret blev indsamlet. I alt vi medtaget væv fra 60 deltagere med brystkræft, 60 med endometriecancer og 60 med kræft i æggestokkene.

Single 0,6 mm væv kerner målrettet mod områder med tumor, der var blevet identificeret og mærket af en patolog (MES ) blev opnået fra hver tumor blok til DNA-ekstraktion, under anvendelse af et væv microarray udkerning nål til hver prøve. Mikrodissektion blev udført i en lille del af prøverne, hvilket gør det vanskeligt nøjagtigt at vurdere procentdelen af ​​tumor materiale. Nukleinsyre ekstraktion blev udført med Agencourt® FormaPure ™ kit (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA) ifølge producentens instruktioner. For at undgå interferens med PCR vi fjernet RNA fra renset total nukleinsyre under udvinding metode. Efter ekstraktion og oprensning, DNA-koncentration og renhed blev kvantificeret under anvendelse NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). Totalt genomisk DNA ekstraheret med denne fremgangsmåde gav et midlet af 2,07 ug (interval 0,03-7,69 ug). Renheden af ​​DNA for hver ekstraktion metode blev vurderet ved at måle intensiteten af ​​absorbansen af ​​DNA opløsning ved bølgelængder 260 nm (A260) og 280 nm (A280).

Udvælgelse af exoner til screening

sættet af exoner udvalgt til denne mutation scanning analyse blev trukket fra kræft gener ofte muteret (

PIK3CA

,

ERBB2

,

KRAS

,

TP53

,

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, og

FGFR3

) i offentliggjorte rapporter, med særlig vægt på bryst, ovarie og endometrium kræftformer [ ,,,0],5], [9], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Også, havde HRM analyse for disse særlige genomiske regioner allerede blevet optimeret.

Primere og præ-HRM PCR

Primere af exonerne samt størrelsen af ​​amplikoner, der anvendes til præ -HRM PCR er anført i tabel 1. i gennemsnit 40 bp af den proximale – blev eller 5′-intron-region, der flankerer mål-exon og 41 bp af 3 ‘intron region flankerer mål-exon dækket af amplikon. Den eneste undtagelse var exon 6 i

GATA3

, der måler 1462 bp, hvoraf 284 bp svarer til kodende nucleotider. I dette særlige tilfælde har amplikon ikke strække sig over 3 “side af intron (tabel 1 for detaljer)

Opmærksomhed på detaljer i pre-HRM PCR betingelser er afgørende for optimering:. 1) design af PCR-primere til at holde GC-indhold under eller så tæt som 60% som muligt, produktstørrelse omkring 200 bp og undgå kendte varianter inden primeren region; 2) udvælgelse af optimale annealing temperaturer med gradient PCR; 3) og design af PCR-eksperimenter i en ensartet måde:. Samme assay, med samme prøve parti og samme maskine køre

PCR-baserede analyser for de forskellige gener blev udført i 96-brønds format med 10 pi volumen og omfattede 10 ng genomisk DNA for frosne prøver, og 1 pi opløsning indeholdende genomisk DNA for paraffinindlejrede vævsprøver, med middelkoncentration på 25,8 ng /pl (SD = 21,7), og i området fra 2 til over 55 ng /pl ( første kvartil 8,4 ng /pi, og tredje kvartil 36,3 ng /uL). Master Mix, der indeholdt alle deoxynukleosidtriphosphater, Taq polymerase, og LCGreen® PLUS (Idaho Technology, Salt Lake City, UT) blev anvendt til præ-HRM PCR. PCR blev udført under anvendelse af et MJ Research PTC 225 Thermal Cycler (MJ Research, GMI Inc., Ramsey, MN) med en indledende denaturering ved 95 ° C i 2 minutter efterfulgt af 45 cykler af 2 trin temperaturcyklus på 95 ° C i 30 sekund, og 66 til 70 ° C i 30 sekunder (

PIK3CA

,

ERBB2

,

KRAS dele på 66 ° C;

TP53

,

EGFR

,

BRAF dele på 68 ° C;

GATA3

,

FGFR3

ved 70 ° C). Efter PCR blev prøverne opvarmet til 93 ° C i 30 sekunder og derefter afkølet til 25 ° C før HRM.

Sample håndtering

Frosne. HRM analyser blev udført i dobbeltbestemmelse på alle prøver der giver enten Frank (n = 59) eller minimale variationer (n = 99) i den normaliserede HRM kurve, og også i 20% tilfældigt udvalgt negative prøver (n = 45). En anden runde af HRM blev udført for at vurdere reproducerbarheden af ​​fremgangsmåden ved anvendelse af kendte negative kontroller og positive kontroller. Frank variationer blev defineret som de HRM kurver fortolket af softwaren til at være mistænksom indslæbe et nukleotid ændring eller en mutation /variant, og var repræsenteret i rødt i grafikken (Figur S1). Minimal variation på en prøve blev betragtet, når softwaren detekterede mindre varians i HRM kurve i forhold til det gennemsnitlige kurve vildtype uden at kalde det en mutation (3% af alle opkald) (figur S1). Disse prøver blev repræsenteret enten i grå eller grøn, afhængigt af deres grad af adskillelse med den midlede kurve vildtype. Alle prøver med frank eller minimal variation af kurven undergik en gentagen HRM analyse, og blev også sekventeret.

Paraffin-indlejret. Vi analyserede 60 brystkræft prøver, 60 endometriecancer prøver og 60 kræft i æggestokkene prøver. Kvaliteten af ​​det ekstraherede DNA blev målt ved tilstedeværelsen af ​​præ-HRM PCR-produkt i HRM analyse og ved tilstedeværelsen af ​​et enkelt bånd på en 1,5% agarosegel [33]. I dette sæt, alle prøver var bidirektionelt sekventeret.

HRM Curve Analyse

Prøver blev amplificeret i 96-brønds plader, og HRM kurver erhvervelse blev udført på en prototype version af HRM instrument , LightScanner ™, hjælp LCGreen® Plus + Dye (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Afhængigt af assayet kombination på pladen, blev HRM område bestemt til at rumme hvert assay individuelle profil med mindst 4 ° C før den første smelte overgang på pladen, med en hældning på 0,3 ° C /s, og mindst 3 grader efter den sidste fragment er helt smeltet.

da HRM blev udført i denne undersøgelse, da screeningen teknologi, blev kurverne analyseret ved hjælp af brugerdefinerede LightScanner ™ software (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Normalisering og baggrund subtraktion blev uropført ved at montere en eksponentiel til baggrunden omgiver HRM overgange af interesse. De normaliserede HRM kurver var temperatur-overlejret, at fjerne små temperatur fejl mellem brønde eller kører. Forskel plots af disse normaliserede og temperatur-overlejret kurver blev opnået ved at tage fluorescensen forskel på hver kurve fra gennemsnittet kurve vildtype på alle temperaturpunkter [13], [14]. HRM kurver med et plot fortolket af software til at være forskellig fra den gennemsnitlige vildtype kurve blev anset for at være mistænksomme over at huse en nukleotid ændring eller en mutation /variant (figur S1). Disse analysemetoder tidligere har været anvendt på mutation scanning [34], [35].

Tovejs Sekvensanalyse

Tovejs sekvens analyse blev udført med primere, der var designet ved at forlænge hver oligonucleotid anvendt i den før-HRM PCR med en universel sekventeringsprimer: M13 fremad (TGTAAAACGACGGCCAGT) eller M13 revers (CAGGAAACAGCTATGACC). PCR-betingelser for sekvensanalyse blev udført i 96-brønds format med 10 pi volumener og omfattede 1 pi amplificeret DNA fra præ-HRM PCR reaktion. Genomisk DNA blev anvendt, når sekvensen reaktionen mislykkedes med amplificeret DNA. PCR-produkter blev sekventeret ved anvendelse af en modificeret ABI Prism® BigDye Terminator protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ikke-inkorporerede farvestoffer terminatorer og salte blev fjernet ved anvendelse af en Sephadex G-50 (Sigma, St. Louis, MO) spin-søjler i en MultiScreen®-HV 96-brønds filterplade (Millipore, Billerica, MA). Reaktionerne blev kørt på en ABI 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sequence spor blev analyseret og sammenlignet ved hjælp af to softwarepakker (SeqScape ™ V2.5 og Variant Reporter ™ v1.0, både fra Applied Biosystems, Foster City, CA) og gennemgået af to uafhængige korrekturlæsere [9]. Når softwaren ikke var i stand til at tilpasse og samle den forreste og den reverse sekvenser prøven blev anset for at have bestået sekventering fremgangsmåde til Formålet med denne undersøgelse. For paraffinindstøbte analyser, der ikke udføres såvel som deres frosne modparter (specifikt exons fra gener

TP53

GATA3

), PCR forhold samt deres primere blev ændret for at forbedre sekventering . Dette omfattede generere primere, forlænget tværs flere af de genomiske regioner eller dias 20-30 bp op eller ned stream. Men vi bemærkede, at de nye, specifikke assays undladt at optimere mens teste forskellige regioner ville ændre formålet med undersøgelsen. Sammenfattende sekventering fejlprocent var 2,5% for frosne prøver og 20,0% for paraffin-indstøbt.

nukleotidændringer detekteres ved sekventering blev klassificeret som nye ændringer eller kendte SNP’er (eller Single-polymorfier), hvis der findes i dbSNP, Build 130, fra NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), ved hjælp af Genewindow (genewindow.nci.nih.gov) [36].

Statistisk analyse

foreningens mellem mængden af ​​DNA ekstraheret fra paraffinindstøbt væv (niveauer: ≤10 ng /uL, 11-20 ng /uL, 21-30 ng /pi, og 30 ng /pi) og en vellykket præ-HRM PCR-assay, målt enten ved tilstedeværelsen af ​​en enkelt amplikon i agarosegel eller tilstedeværelse af et DNA-produkt på HRM analyse blev udført ved logistisk regressionsanalyse. Aftale mellem 2 variabler (eller pålidelighed) blev bestemt ved en Kappa-test. Kappa værdier mindre end 0,40 indikerer lav forening, mellem 0,40 og 0,75 indikerer medium forening, og værdier over 0,75 indikerer høj association mellem to foranstaltninger. Screening kapaciteter HRM og sammenhængen i analysen var foranstaltning hjælp klassiske målinger, såsom følsomhed, specificitet, falsk negative og positive satser, overvejer sekventering analyse som standard måling for både frosne og paraffin-embedded ekstraherede prøver.

statistiske analyser blev udført ved hjælp af Microsoft® Excel (Redmond, WA) og R statistisk pakke (www.r-project.org/).

Resultater

Frosne prøver

mutation screening blev udført på 12 amplikoner for hver af 216 frosne prøver under den indledende HRM analyse (2.592 forskellige bestemmelser). Vi observerede 59 HRM positive prøver, 2510 HRM negative, og kun 23 af disse målinger var ikke evalueres (mindre end 1%). For gentagne HRM eksperimenter, 47 var positive, 156 negativ, og kun 1 ud af 204 var ikke evaluerbare. I alt 2772 ud af 2796 (2592 i første HRM runde, og 204 i den anden HRM runde), eller 99,1%, eksperimenter var evaluerbare for screening af mutationer /varianter af HRM-analyse.

I den indledende runde af analyse, 4 assays havde ingen mutation påvises:

ERBB2

exon 25, distale område

TP53

exon 5,

GATA3

exon 5, og det proximale område af

GATA3

exon 6. For testet resten exons, mellem blev påvist 1 til 9 formodede nukleotidsubstitutioner; især exon 13 af

FGFR3

havde det højeste antal, 30. Resultaterne af mutation screening ved HRM-teknologi i begge forsøg, initial og gentag, samt validering med sekventering for frosne prøver er vist i tabel 2.

HRM forsøg blev gentaget på alle prøver med tegn på en formodet mutation på HRM-kurven, og også i en delmængde af negative prøver. Aftalen mellem den oprindelige og gentag skærm af HRM eksperimenter var 91%, med en kappa test værdi på 0,77, eller høj overensstemmelse mellem begge. Generelt HRM kurver præsenteret lignende figurer i både uafhængige analyser (Figur S2). De fleste uenigheder boet i prøver kaldes unormal i den indledende skærm og normal, eller uden mutation, i repeat HRM forsøget (n = 12), der blev bekræftet normal ved sekventering. Kun 1 gentagne HRM analyse undladt at registrere et nukleotid substitution i en prøve i forhold til det første skærmbillede. Senere sekventering af denne prøve opdaget en substitution af henvisning GG alleler, ved position 7518234 af kromosom 17 (exon 7 i genet

TP53

), ved AA.

sensitivitet og specificitet for mutation /variant screening var 97% og 87%, når sammenlignet med tovejs sekventering, med et falsk negativt på 3%. Den samlede nøjagtighed af testen var 89% (tabel 3). Når den anden, gentagne HRM analyse blev sammenlignet med sekventeringsresultaterne, specificitet steg til 94%, såvel som nøjagtigheden, 94% (kappa på 0,82); men den falske negative steg også til 5%. Nærmere oplysninger om sekventering resultater for mutationer er beskrevet i tabel 4. En falsk negativ blev opdaget, når man sammenligner HRM eksperimenter med sekventering, ikke at opdage en nukleotid forandring, fra AA til AG, i både de indledende og gentagne skærme. Denne variant viste sig at være et kendt SNP i exon 13 af

FGFR3

, rs7688609 (tabel 4). Især omfattende offentlige databaser (dbSNP og Ensembl) angivet G som den fædrene, henvisningen allel i DNA-sekvensen for dette locus, men størstedelen af ​​sekventerede prøver i vores undersøgelse, 63 ud af 67 (eller 94%), var homozygote for AA , og kun 6% var heterozygote for G (GA). I betragtning af denne forskel på allelfrekvenserne med tilgængelige offentlige data, besluttede vi at sekventere alle 3 populationer af HapMap samt SNP500 befolkning for denne særlige amplikon (n = 366) [37], [38]. Samlet set allel En frekvens var 94%, og allel G frekvens var 6%. Yoruba befolkning præsenterede den højeste G frekvens med 17%. Samtidig, vi sekventeret denne region for 43 tilgængelige kønsceller DNA fra patienter, der lider disse pædiatriske tumorer; alle af dem var homozygote for AA. Efter sekventering alle paraffinindlejrede prøver, fandt vi lignende allelfrekvenserne.

Paraffinindstøbte prøver

A260 /A280-forholdet, et mål for renheden af ​​paraffin -embedded ekstraheret DNA, havde et gennemsnit på 1,92 (SD = 0,45) for alle brystkræftpatienter prøver blev gennemsnitligt 1,82 (SD = 0,12) for endometriecancer prøver, og en middelværdi på 2,0 (SD = 0,27) for kræft i æggestokkene prøver. Der var en direkte sammenhæng mellem koncentrationen af ​​DNA (i ng /pi) ekstraheret fra paraffinindlejrede prøver, DNA er anvendt for den før-HRM PCR, og tilstedeværelsen af ​​et enkelt bånd i agarosegelen (p 0,001 ). Der var også en sammenhæng mellem ekstraherede DNA-koncentration og tilstedeværelsen af ​​en passende HRM kurve til analyse (p 0,001). HRM lykkedes 96% af tiden, når mængden af ​​paraffin-indstøbt ekstraherede DNA bruges til denne teknik var mere end 30 ng i sammenligning med 92%, når mængden var ≤30 ng (tabel 5).

Samlet set 93% (2008 ud af 2153) af målingerne af paraffinindlejrede prøver ved HRM-analyse var evaluerbare. Denne teknik var mere vellykket, når frosne DNA prøver blev analyseret, end når DNA ekstraheret fra paraffinindlejrede prøver blev anvendt, 99,1% versus 93,3% (p 0,001).

Resultaterne af mutationen screening ved HRM teknologi og sin validering med tovejs-sekvensanalyse for paraffinindlejrede prøver er vist i tabel 6. også en repræsentation af disse resultater er skildret i fig S3. Den samlede sensitivitet og specificitet for prøverne mistænkelige for mutation i HRM analyse var 88% og 80% sammenlignet med sekventering, med et falsk negativt på 12% (tabel 7). Men en relativt lille procentdel af DNA ekstraheret fra paraffinindlejrede prøver var vanskeligt at sekvensen. Som vi nævnte, blev sekvensen reaktion foregå ved hjælp af amplificeret DNA fra den præ-HRM PCR. Når sekventering af et bestemt assay mislykkedes, blev genomisk DNA anvendes, og sekventering gentages. Med denne strategi kunne bekræftende sekvens i frosne prøver udføres over 97% af tiden. Dette var ikke tilfældet med DNA ekstraheret fra paraffinindlejret væv, hvor sekventering blev opnået 80% af tiden under anvendelse af samme strategi. Især succesraten for DNA-sekventering fra paraffinindstøbt væv var mindre end 50% for exons fra gener

TP53

(distale område af exon 5, og exon 7), og

GATA3

( proximale region af exon 6), påvirker sammenligningen mellem sekvensanalyse og HRM kurver. Sekventering af disse amplikoner mislykkedes i 341 ud af 397 reaktioner, som tegnede sig for 86% af alle mislykkedes sekventering. Når disse mislykkede analyser blev udelukket fra sammenligningen mellem HRM kurver og sekventering, følsomhed steg til 92%, med en nøjagtighed på 80%. Paraffinindstøbte sekventering detaljer er beskrevet i tabel S1. Alle nye nukleotider ændringer findes på undersøgelsens prøver blev forelagt dbSNP (bygge 131) og vises i tabel S2.

Diskussion

HRM-analyse ved hjælp af LightScanner ™ repræsenterer en moderat-throughput screening for mutationer blandt kandidat genomiske regioner. Sammenligningen med tovejs sekventering analyse giver stærke beviser for dets nøjagtighed trods den lave forekomst mutation /variant sats, især fordi udvalgte exoner nærede ingen mutationer. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter [28], [39]. Den observerede sats var 39 for 2569 (eller 1,5%) mutation /variant for alle analyserede exoner inden for de 216 frosne pædiatriske små afrundede blå-celle tumorer, og 67 for 1586 (eller 4,2%) mutation /variant for alle analyserede exons i 180 gynækologiske faste tumorer (tabel 4 og S1, henholdsvis).

følsomhed og specificitet af HRM analyse var højere i frosne prøver sammenlignet med paraffinindlejrede prøver, med en observeret følsomhed på 97% for DNA ekstraheret fra frosne prøver, hvorimod det er 88% for DNA ekstraheret fra paraffinindlejret væv. Lavere resultater i visse analyser, når man sammenligner DNA fra paraffinindlejrede prøver versus frosne prøver er også blevet beskrevet i tidligere undersøgelser for

KRAS

EGFR

[12]. Disse forskelle skyldes i det mindste til en vis grad, at sekventere ændringer i DNA relateret til tværbinding mellem proteiner og DNA, og omvendt korreleret med antallet af celler i prøverne [40], [41], [42]. Desuden kan tilstedeværelsen af ​​flere mutationer og sletning af punkter ændre effektiviteten af ​​analysen, muligvis årsagen til dårlige præstationer i

TP53

analyser [16], [43]. Størstedelen af ​​HRM undersøgelser udført til dato, har konkluderet, at, med visse begrænsninger, er dette en relativt enkel, hurtig og billig teknik til detektering genomisk variation i paraffinindlejrede vævsprøver [43]; med konsekvente rapporter om nogle af de gener, screenet på vores undersøgelse [11], [16], [40], [44]. Dens begrænsninger er relateret til en lavere effektivitet på områder med sletninger (eller indsættelser) til afsløring af homozygote variationer (sammenlignet med heterozigous), på specifikke analyser, og den manglende enighed om den optimale længde af PCR produkt eller smeltende domæner pr amplikon [ ,,,0],12], [13], [16].

for at eliminere de subtile forskelle i reagens komponenter mellem de endelige elueringspuffere fra flere udvindingsplatforme og for at minimere variabilitet inden prøver vores tilgang var at udføre DNA ekstraktion ved hjælp af en fælles ekstraktion platform, betingelser og protokol. Med optimeret prøvehåndtering og standardiseret DNA-ekstraktion, er det muligt at screene paraffinindlejrede prøver med højere følsomhed [40], [41]. Trods den øgede fragmentering af DNA ekstraheret fra paraffinindlejret væv, er det muligt på pålidelig screene kortere amplifikationsprodukter på op til 250 bp i længde. Desuden er omfanget af DNA fragmentation korrelerer med vævstype [12], [45], [46]. Succes på begge, HRM kurve og sekventering analyser, er over 97%, når 10 ng DNA anvendes fra frosne prøver. Men disse resultater kunne ikke opnås med den samme mængde af paraffin-indstøbt ekstraherede DNA (vellykket HRM analyse i 84%). Ved at øge mængden af ​​renset DNA tilføjet til pre-HRM PCR ≤30 ng forbedredes, delvist overvinde den udfordring, som suboptimal dobbeltstrenget DNA. Optimering af præ-HRM PCR kan også afbøde nedsat følsomhed, især mens du bruger særlige farvestof kemi [46].

DNA ekstraheret fra paraffinindlejrede væv var også sværere at sekventere end DNA fra frosne væv [47], [48]. Men formålet med denne undersøgelse var ikke at etablere en optimeret protokol for sekventering af DNA ekstraheret fra paraffinindlejret væv, men at vurdere screening kapaciteter af HRM-analyse. Når optimale eksperimentelle betingelser for HRM og sekventering analyser på de frosne prøver blev bestemt, vi anvendte dem til paraffin-embedded sæt, for at opnå en rimelig sammenligning mellem begge sæt prøver. Protokol modifikationer af sekventering eksperimenter kunne beskedent forbedre ydeevnen, såsom brugen af ​​hele genomet amplifikation [49], [50], men dette kan indføre tab af heterozygoti. Skridt at optimere sekventering kan også omfatte alternative primere eller denaturering betingelser.

På baggrund af disse overvejelser, at vores anbefalinger vedligeholde og måske forbedre screening kapaciteter af HRM analysemetoder til paraffinindlejrede udtrukne prøver med en LightScanner ™ ville omfatter følgende:.

inddragelse af ≥30 ng total genomisk DNA kan øge HRM analyse succesrate på op til 96%

Pre-HRM PCR optimering bør omfatte omhyggelig primer udvælgelse for at reducere GC-indhold, tilstrækkelig amplikonstørrelse, og optimal annealingstemperatur.

Amplikoner der mislykkedes sekventering over 50% af de gange også udføres dårligt under HRM analyse. Så kan det være værd at teste de udvalgte amplikoner ved sekventering nogle få prøver ved begyndelsen af ​​forsøget.

falske positive for HRM analyse i paraffin indlejrede prøver var ca. 20%, hvilket indebærer, at yderligere sekventering er nødvendig for at forbedre nøjagtigheden i delmængde af prøver med et formodet mutation [12]. HRM analyse på frosne prøver kun betragtes 59 af dem unormalt, for 39 med ægte mutation /varianter. Det ville således være nødvendigt at sekventere færre prøver for hver mutation. , Ikke kun udførelsen er derfor bedre i frosne prøver med hensyn til paraffinindlejrede prøver, men også omkostningseffektivitet.

Som konklusion, HRM analyse med LightScanner ™ er et lovende screeningsværktøj til mutation /variant i somatisk DNA ekstraheret fra enten frosne eller paraffinindlejrede prøver, selv om den samlede nøjagtighed er bedre i frosne prøver, sandsynligvis relateret til DNA kvalitet. Denne metode er i stand til at påvise mutationer samt kendte SNP’er, selv i genomiske regioner med ringe mutation prævalens i størrelsesordenen 5% eller måske lavere.

Støtte oplysninger

figur S1.

Repræsentation HRM kurve af

BRAF

exon 15 fra genomisk DNA ekstraheret fra frosne prøver. Rød pil: HRM kurver med et plot fortolket af softwaren til at være mistænksom indslæbe et nukleotid ændring eller en mutation /variant. HRM blev gentaget for alle disse prøver, og alle af dem blev sekventeret. Grønne pile: HRM kurver med minimale udsving i forhold til det gennemsnitlige kurve vildtype. Alle disse prøver blev også sekventeret og HRM blev gentaget. Sort pil: Alle normaliserede HRM kurver vurderes at have en vildtype-sekvens.