PLoS ONE: Kombination Erlotinib-Cisplatin og Atg3-medieret Autophagy i Erlotinib Resistant Lung Cancer

Abstrakt

tyrosinkinaseinhibitorer såsom erlotinib er almindeligt anvendt som et terapeutisk middel mod kræft på grund af sin relativt lave bivirkning profil og til tider større effektivitet. Dog er erlotinib modstand (ER) i ikke-småcellet lungekræft at blive anerkendt som et stort problem. Derfor er der behov forståelsen af ​​mekanismen bag ER og udvikling af effektive regimer. Autophagy rolle i kræft har været kontroversiel og er fortsat uklart. I denne undersøgelse undersøgte vi effektiviteten af ​​lav dosis kombination erlotinib-cisplatin erlotinib resistent lunge adenocarcinom (ERPC9) celler og rolle autophagy i ER. ERPC9 celler blev etableret fra erlotinib følsomme PC9 celler. Passende behandlinger blev udført over to dage og celleoverlevelse blev kvantificeret med Alamar Blå assay. LC3II og regulatoriske proteiner af autofagi blev målt ved Western blot. Lille interfererende RNA (siRNA) blev anvendt til at inhibere translation af proteinet af interesse. I ERPC9 celler, kombinationsbehandlingen induceret synergistisk celledød og et signifikant fald i autofagi. Ved baseline, ERPC9 celler havde en signifikant højere LC3II og lavere p-mTOR-niveauer i forhold til PC9 celler. Tilføjelsen af ​​rapamycin øget modstand og 3-methyladenin sensibiliserede ERPC9 celler, hvilket indikerer autophagy kan fungere som en beskyttende mekanisme. Yderligere undersøgelse afslørede, at ERPC9 celler nærede høje baseline Atg3 niveauer. Den høje basale Atg3 var målrettet og markant sænket med kombinationsbehandling. siRNA transfektion af Atg3 resulterede i tilbageførsel af ER; 42,0% flere celler døde i erlotinib-alone behandling med transfektion sammenlignet med ikke-transficerede ERPC9 celler. Vi afslører en ny rolle for Atg3 i fremme af ER som hæmning af Atg3 oversættelse var i stand til at resultere i re-sensibilisering af ERPC9 celler til erlotinib-alone behandling. Vi demonstrerer også, at kombinationen erlotinib-cisplatin er en effektiv behandling mod erlotinib resistent cancer ved at målrette (nedregulering) Atg3 medieret autophagy og induktion af apoptotisk celledød

Henvisning:. Lee JG, Wu R (2012) Kombination Erlotinib-Cisplatin og Atg3-medieret Autophagy i Erlotinib Resistant Lung Cancer. PLoS ONE 7 (10): e48532. doi: 10,1371 /journal.pone.0048532

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Marts 8, 2012; Accepteret: 27. september 2012; Udgivet 31. oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Lee, Wu. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Jasmine G . Lee blev finansieret delvist af National Institutes of Health (NIH) T32 HL07013. Dette projekt blev finansieret delvist af NIH tilskud HL077902 og HL096373. Forfatterne rapporterer ingen økonomisk interessekonflikt vedrørende undersøgelsen herunder materialer eller metoder eller resultaterne er angivet i dette dokument. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft-dødsfald og har en af ​​de laveste overlevelsesrater blandt alle kræftformer, med en rapporteret fem års overlevelse på 13% [1]. Lungekræft kan groft inddeles i to hovedgrupper for prognostiske og behandling formål: småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Af alle lungekræft, 85% er NSCLC [2] og er yderligere underinddele i tre grupper baseret på deres histologiske karakteristika: pladecellekarcinom, storcellet carcinom og adenocarcinom [2] – [4]. NSCLC tendens til at være mindre følsom over for kemoterapi end SCLC, og selv med kirurgisk resektion af tidlige fase primære tumorer, op til 50% af patienterne viser en gentagelse af deres primære kræftformer [4], [5]. På grund af dette, er effektive kemoterapi behov og til tider, systemisk kemoterapi er den eneste mulighed for lokalt fremskreden tumorer og /eller metastatisk sygdom.

Platinum baseret kemoterapeutiske stoffer såsom

Cis

-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) traditionelt blevet de vigtigste midler anvendt til behandling NSCLC og har vist sig at forbedre patientoverlevelse [6]. Men cisplatin bærer signifikante toksiske bivirkninger, især ved høje doser, såsom: kvalme, opkastning, nyresvigt, ototoksicitet og neurotoksicitet på grund af sine ikke-specifikke cytotoksiske virkninger på både kræft og normale celler [7], [8].

for nylig er der en løbende interesse i forskning, udvikling og produktion af anti-cancer, der er målrettet specifikke patologiske veje, tillader, at sådanne midler til at have mindre giftige profiler og lavere risiko for bivirkninger. En sådan Food and Drug Administration (FDA) godkendt middel, der anvendes i lunge adenocarcinom er erlotinib. Erlotinib er en tyrosinkinaseinhibitor (TKI), der inhiberer den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) gennem kompetitiv inhibering af ATP-bindingsstedet i tyrosinkinasedomænet [9], og efterfølgende reduktion nedstrøms proliferativ signalering pathways [10]. EGFR er overdrevent udtrykkes i mange cancere, herunder 40-80% af NSCLC [11], [12]. Mutationer forbundet med EGFR, som mutationer, der fører til overekspression af EGFR, betragtes kritisk mekanisme for tumorigenese som EGFR er involveret i mange regulatoriske vækstprocesser herunder proliferation, apoptose, adhæsion, invasion og migration [2], [10], [13 ]. Erlotinib har vist sig at være en effektiv behandling for NSCLC huser EGFR mutationer [14]. Men omkring 10 til 14 måneder efter behandlingsstart, nogle lungekræft udvikler, erlotinib modstand (ER), der fører til tilbagefald [15], [16]. Der har været få undersøgelser af mekanismer og involverede veje for erhvervet resistens til TKI’er, men dette emne er stadig kontroversiel og forholdsvis uklart berettiger yderligere belysning af de mulige molekylære resistensmekanismer [17].

Autophagy har været klassisk forstås som en mekanisme til celle protein homeostase og nedbrydning af tilskadekomne cellulære komponenter og /eller organeller [18], [19]. Dens rolle er kritisk, da forringet autofagi er forbundet med forskellige humane sygdomme herunder kræft [19], [20]. Autophagy er også blevet beskrevet at virke som en “anden” vej af programmeret celledød (den anden er apoptose) og omvendt en beskyttende mekanisme for celle integritet [20], [21]. Men dens rolle i kræft og kræft modstand fortsat uklart,: gør autophagy fungerer som en mekanisme til at fremme kræft modstand eller fremmer kræft celledød [22], [23]? Fastlæggelsen og forståelse rolle autophagy i ER er vigtig.

For at forbedre behandlingen af ​​NSCLC, er det vigtigt at forstå den molekylære mekanisme bag ER og finde et regime, som er effektive til behandling erlotinib resistente cancere . Således i denne undersøgelse undersøgte vi effektiviteten af ​​lav-dosis erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling i erlotinib resistente lungeadenocarcinom og fastlægge den rolle autophagy i ER. Vi identificerer også en vigtig regulatorisk protein i autophagy vej, der er i stand til at modulere ER.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Culture

En erlotinib følsom PC9 cellelinje et humant lunge-adenocarcinom med overekspression af EGFR, blev venligst begavet fra Dr. Halmos (Columbia University) [24]. Den blev opretholdt i RPMI 1640-medier indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) med Antibiotikum-antimycotisk (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den ERPC9 cellelinjen blev etableret ved at dyrke PC9 celler i 5% FBS dyrkningsmedier indeholdende erlotinib. Celler blev indledningsvis holdt ved en erlotinib koncentration på 33 nM (IC50), og dosis blev gradvist forøget over en periode på 12 uger, indtil den endelige koncentration af erlotinib var 10 uM. Derefter, ved brug af enkelt-celle kloningsteknikker, hvor kun aktivt delende celler blev valgt (hvilket indikerer resistens) blev ERPC9 celler etableret. Derefter blev ERPC9 celler holdt i 10% FBS i RPMI 1640 indeholdende den endelige etablerede erlotinib koncentration på 10 uM.

* Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved anvendelse af Alamar Blue-assay. Kontrolgruppen fungerede som standarden for cellelevedygtigheden og celledød. (A) I ERPC9 celler, kombinationsbehandlingen inducerede markant mere celledød end enlige medicinsk behandling (p 0,0001). Erlotinib-alone resulterede i 96,6% overlevelse, cisplatin 89,3%, og kombinationen 61,1%; denne virkning var synergistisk (CI på 0,12). (B) I forældrenes PC9 celler, kombinationsbehandlingen inducerede markant mere celledød end enlige medicinsk behandling (p 0,0001) erlotinib-alone resulterede i 79,6% overlevelse, cisplatin 76,1%, og kombinationen 49,6%; denne virkning var synergistisk (CI på 0,45). (C) I NHBE celler, erlotinib alene, cisplatin alene og kombinationsbehandling viste minimal celledød eller ændring levedygtighed blandt de fire grupper (p = 0,958), hvilket indikerer minimal toksicitet med kombinationsbehandlingen.

Normalt humane bronchieepithelceller væv blev opnået fra National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA) [25] – [27]. Væv blev ikke indsamlet fra patienter diagnosticeret med lunge sygdomme. Protease-dissocierede bronkiale epitelceller blev udpladet på transwell kamre (Corning; 24 mm) ved 5 × 10

4 celler /cm

2 i bronchieepithelceller vækstmedium (Lonza). Efter 4-7 dage i en nedsænket kultur tilstand eller når kulturerne nåede sammenflydning, blev cellerne overført til en luft-væske-grænsefladen (ALI) kultur tilstand i et Hams F12 /DMEM (01:01) med tilsætning af følgende otte faktorer: transferrin (5 ug /ml), insulin (4 ug /ml), choleratoxin (20 ng /ml), epidermal vækstfaktor (10 ng /ml), dexamethason (0,1 uM), bovint hypothalamusekstrakt (15 ug /ml) , BSA (0,5 mg /ml), og alle-

trans

retinoinsyre (30 nM), som gjorde det lettere polarisering og mucociliær differentiering. NHBE-celler blev dyrket i 7 dage efter overførsel til ALI. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.

* (A) autofagi niveauer blev vurderet ved Western blot for LC3II og P62. (B) ERPC9 celler havde signifikant højere niveauer af LC3II end i PC9 celler (p = 0,030) og signifikant lavere niveauer af P62 end i PC9 celler (p 0,0001); indikerer højere baseline autofagi niveauer i erlotinib modstand celler. Samstemmende, kan det ses, at der var signifikant lavere niveauer af LC3I i ERPC9 celler i forhold til PC9 celler (p = 0,008)

Narkotika:. IC50 værdier og behandlingsgrupper

Cisplatin , rapamycin og 3-methyladenin (3-MA) ​​blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), og erlotinib blev indkøbt fra Selleck Chemicals (Huston, TX, USA). 3-MA blev opløst i vand og alle andre lægemidler blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til dannelse stock koncentrationer af cisplatin 10 mM, erlotinib 10 uM, rapamycin 27,4 mM, og 3-MA 100 mM. 3-MA blev fremstillet frisk hver gang og andre lægemidler blev holdt ved -20 ° C, og alle blev fortyndet til passende koncentration før anvendelse. Længden af ​​behandling af alle eksperimenter bestod af to dage. Celler blev først udpladet og dyrket med 10% FBS i RPMI 1640 medier i 24 timer før påbegyndelse af behandlingen for at tillade celler at vedhæfte til pladen. Den næste dag blev mediet udskiftet med 0,1% FBS i RPMI 1640 indeholdende passende medikamentkoncentrationer i to dage. Ved bestemmelsen af ​​IC-værdier, blev 96-brønds plader anvendes, og dosisreaktioner blev udført ved anvendelse af følsomme PC9 celler ved behandling celler i en seriel række lægemiddelkoncentrationer for hvert lægemiddel (erlotinib eller cisplatin). Officielle behandlingsgrupper bestod af en 2 × 2 faktorielt eksperimentelt design [28]: kontrol (0,1% DMSO), erlotinib (10 nM), cisplatin (3 uM), og kombinationen af ​​erlotinib og cisplatin (10 nM + 3 uM). Officielle lægemiddelbehandlinger blev udført i 6-brønds plader. Både PC9 og ERPC9 cellelinier undergik lægemiddelbehandlinger. Eksperimenter, der kræver anvendelse af rapamycin og 3-MA undergik den samme protokol.

* autofagi niveauer blev målt gennem Western blot for LC3II. (A 0,0001). I ERPC9 celler der undergik kombinationsbehandling, blev et signifikant fald i grøn fluorescens ses sammenlignet med alle andre grupper (p lt; 0,0001). Grøn = LC3 og blå = DAPI.

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved hjælp af Alamar Blå Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Efter afslutningen af ​​lægemiddelbehandling, blev det oprindelige medie erstattet med medier indeholdende 10% Alamar Blue-farvestof og inkuberet i 1 time i et 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2. Cellernes levedygtighed og død blev derefter målt ved 530 nm excitation bølgelængde og 590 nm emission ved hjælp Packard fluorocount. Forholdet mellem cellelevedygtighed blev beregnet med formlen som følger:. (Absorbans af behandlingsgruppen) /(absorbans af kontrolgruppen) x 100

* Rapamycin og 3-MA blev anvendt til at vurdere, hvilken rolle autophagy og dens association med erlotinib modstand. Passende grupper blev behandlet med enten (A) 10 nM af rapamycin eller (B) 5 uM 3-MA med kombination lægemiddelbehandling. I ERPC9 celler, celleoverlevelse steg 16,5%, når rapamycin blev tilsat til kombinationsbehandling (p = 0,004). Sammenlignet med 3-MA behandlede ERPC9 celler, var der et fald på 10,5% i celleoverlevelse i kombination behandlingsgruppe og 9,1% fald i 3-MA med kombinationsbehandlingen (p = 0,032 og p = 0,037, henholdsvis). (C) Når 3-MA blev tilsat til erlotinib-alene (p 0,0001) og cisplatin-alene (p 0,0001) behandling var der en 39,2% og 31,0% større celledød, sammenlignet med behandling med enkelt lægemiddelbehandling alene .

Western blot analyse

Celler blev lyseret i iskold RIPA puffer (Millipore, Billerica, MA) indeholdende en kombination af proteasehæmmer og phosphataseinhibitor cocktails (Sigma-Aldrich) . Lyseredes proteiner blev centrifugeret i 10 minutter ved 14.000 rpm ved 4 ° C, og supernatanter blev kvantificeret for proteinindhold ved anvendelse af Bio-Rad DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) og et spektrofotometer målt ved 650 nm. Proteiner blev derefter separeret ved en 4~20% gradient SDS /PAGE-gel (Thermo Fisher Scientific, Newington, NH) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Bio-Rad). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 0,05% Tween 20 (TBST) i 1 time ved stuetemperatur (RT), og efterfølgende undersøgt med anti-P62 (1:1000, Millipore) , -LC3, -Beclin 1, -P-Akt, -Akt, p-mTOR, -mTOR, -Atg3, -Atg7, -Atg5-12 kompleks (1:1000, cellesignalering, Boston, MA), un-spaltet og -cleaved caspase 3, un-spaltet og -cleaved PARP (1:500, cellesignalering), i 2,5% fedtfri mælk i TBST natten over ved 4 ° C. Derefter blev membraner vasket 30 minutter (x3) med TBST og blev probet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:2000, cellesignalering) i 2,5% fedtfri mælk i TBST i 1 time ved stuetemperatur. For at bestemme lige lastning og standardisere mængden af ​​protein indlæst, blev blots derefter strippet og re-blottet med monoklonalt muse-anti-β-actin (Sigma-Aldrich), og forholdet af bandet intensitet (størrelse × massefylde) af interesse med dens tilhørende β-actin blev taget. Bånd blev filmede med Fuji 4000 software eller via film.

* (A) Western blot af p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12, Atg7, og Atg3 vises . (B) Der var signifikant højere Atg3 niveauer i ERPC9 celler sammenligne med PC9 celler (p = 0,018) og (C) signifikant lavere p-mTOR-niveau (p = 0,021), yderligere validering at autofagi er højere i ERPC9 celler.

Knock Down af Atg3 af siRNA transfektion

Små interfererende RNA (siRNA) specifikt rettet human Atg3 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, Californien, USA). ERPC9 og PC9 celler blev udpladet i 12 brønds plader (6 × 10

4 celler per brønd) og transficeret med Atg3 siRNA i 24 timer i antibiotikafrit vækstmedier; hjælp siRNA Lipofectamin RNAiMAX og OPTI-MEM I-reduceret serummedium (Invitrogen). Procedurerne blev udført efter producentens protokol.

* (A) p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, Atg5-12, Atg7, og Atg3 blev målt gennem Western blot analyse. (B) Med erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling, der var en væsentlig ændring kun i Atg3; Atg3 niveau blev signifikant reduceret sammenlignet med alle andre grupper (p = 0,028). Dette antyder, at kombinationsbehandling kan målrette baseline overekspression af Atg3 i ERPC9 celler.

Immuncytokemi

Celler blev vasket med PBS to gange, og fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter vaskes igen med PBS to gange, inkuberet i PBS indeholdende 0,2% Trinol X i 5 minutter ved stuetemperatur, og blokeret med blokerende buffer (PBS med 3% BSA) i 5 minutter ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med primært antistof, anti-LC3 (1:200, cellesignalering) natten over i et 4 ° C mørkt rum, vasket 3 gange den næste dag, og inkuberet med gede anti-kanin IgG Alexa Flour 488-antistof (1:1000 , Invitrogen) i 1 time ved stuetemperatur i et mørkt rum. Celler blev derefter vasket med PBS og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI Vector Laboratories, Burlingame, CA) blev tilsat til farvning af kerner. Zeiss LSM700 konfokal (Carl Zeiss, Tyskland) blev anvendt til at tage billeder, og alle billeder blev taget på den samme indstilling til at tillade konsistens. Billedanalyse blev udført i en blindet måde.

* (A) Blokering Atg3 oversættelse og autofagi med Atg3 siRNA transfektion i ERPC9 celler blev bekræftet ved Western blot analyse. (B) Efter ERPC9 celler blev transficeret med Atg3 siRNA, celler blev signifikant mere følsomme over for erlotinib (p = 0,043) og kombination (p = 0,002) medicinsk behandling sammenlignet med ERPC9 celler med ikke-specifik siRNA transfektion. Der var ingen signifikant forskel i cisplatin-behandlede prøver imidlertid (p = 0,924). (C) Atg3 siRNA transfektion var i stand til at producere en betydelig stigning i følsomheden over for en enkelt medicinsk behandling i forældrenes PC9 cellelinie så godt.

farmakologiske og Statistical Analysis

Statistisk analyse og bestemmelse af signifikante forskelle mellem grupper blev udført ved anvendelse af to-halet t-test og variansanalyse (ANOVA) efter behov. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af prisme software (La Jolla, CA). En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant i denne undersøgelse. Alle forsøg blev udført mindst tre gange uafhængigt af hinanden.

* Apoptose blev målt ved Western blot for spaltet caspase 3 og spaltes PARP. (A C) Ved baseline var der signifikante lavere niveauer i både kløvet caspase 3 og kløvet PARP i ERPC9 forhold til PC9 celler (p 0,0001 og p = 0,0004, henholdsvis)

Ud. Chou-Talalay metode [29] blev anvendt til opnåelse af kombinationen (Cl) at vurdere ved synergisme, additive virkninger eller antagonisme af kombinationsbehandling af erlotinib og cisplatin (meget stærk synergisme, stærk synergisme, moderat synergisme, let synergisme, additiv, og antagonisme blev defineret som CI 0,3, 0,3 CI 0,7, 0,7 CI 0,85, 0,85 CI 1, CI = 1, og CI . 1, henholdsvis)

Resultater

IC50 værdier i PC9 og ERPC9 celler

hæmmende koncentration (IC) 50 værdier af erlotinib og cisplatin blev først etableret i PC9 celler, før at undersøge virkningerne af at kombinere de to agenter som en kombinationsbehandling i erlotinib resistent PC9 (ERPC9) celler. Den bestemte IC50 for erlotinib var 33 nM i PC9 celler og 878 nM i ERPC9 celler (ca. 26 gange højere end i PC9 celler) (data ikke vist); dette bekræfter, at ERPC9 celler blev etableret på en måde, gjorde det muligt at blive resistente og muligvis efterligne hvad der ses klinisk. Den cisplatin IC50 var 18 pM i PC9 celler og 40 pM i ERPC9 celler (data ikke vist). I betragtning af den cisplatin IC50 ikke stige væsentligt, dette yderligere understøtter, at ERPC9 celler viste specifikke modstand at erlotinib.

Erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling i ERPC9, PC9, og Normal humane bronchieepithelceller

Figur 1A og figur 1B viser procentdelen af ​​ERPC9 og PC9 celleoverlevelse efter undergår to dages lægemiddelbehandlinger. Når celler blev behandlet med erlotinib-cisplatin kombination, 61,1% af ERPC9 celler overlevede; dette var signifikant lavere sammenlignet med celler behandlet med erlotinib-alone (96,6%) og cisplatin-alene (89,3%). Med andre ord kombinationsbehandling dræbte en signifikant større antal celler (38,9%) sammenlignet med erlotinib-alone (0,4%, p = 0,001), cisplatin-alene (10,7%, p = 0,0002) og kontrol-ikke-behandlede celler (0,0 %, p 0,0001). Desuden kombinationsbehandlingen inducerede stærk synergistisk celledød trods ERPC9 cellernes resistens mod erlotinib (CI = 0,12 som beregnet gennem Chou-Talalay metode [29]). En lignende tendens i synergistisk celledød blev observeret i de parentale PC9 celler med kombination erlotinib-cisplatin behandling; celle overlevelse efter erlotinib-alone behandling var 79,6%, cisplatin var 76,1%, og kombinationen var 49,6% (p 0,0001) (CI = 0,45). Disse resultater tyder på, at tilsætningen af ​​cisplatin for erlotinib kan være en effektiv behandling til at dræbe erlotinib-resistent lungecancerceller selv ved lave doser ved anvendelse i kombination.

normale humane bronchiale epithelceller (NHBE) celler blev anvendt til at evaluere toksiciteten af ​​erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling. To-dages behandling med erlotinib-alone, cisplatin-alone, og erlotinib-cisplatin kombination demonstrerede minimal celledød og ingen signifikante forskelle i celledød og levedygtighed blandt de fire grupper (p = 0,958), hvilket indikerer en sikker terapeutisk indeks ved den aktuelle dosering for ikke-cancerceller (figur 1C).

Baseline autofagi Niveauer i ERPC9 celler

autophagy rolle i kræft har været kontroversiel, og er ikke blevet undersøgt i detaljer [30]. For at undersøge autophagy rolle i ER, blev en sammenligning af baseline niveauer af autophagy mellem ERPC9 og PC9 celler målt gennem Western blot analyse for LC3II [31] og P62. Som vist i figur 2, LC3II niveauer signifikant højere i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p = 0,030). Desuden P62 niveauer signifikant lavere i ERPC9 celler end PC9 celler (p 0,0001). Begge disse resultater antyder, at ERPC9 celler havnen højere baseline autofagi niveauer end erlotinib sensitive PC9 celler.

Kombination Erlotinib-cisplatin Behandling og LC3II

Yderligere undersøgelse af kombinationsbehandling i ERPC9 celler afsløret et betydeligt lavere niveau af LC3II sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper som vist i figur 3A og 3C (p = 0,011). Faldet i LC3II niveauer på western blot analyse var synergistisk, spejling samme synergistiske tendens ses i celledød med kombinationsbehandling. Dette antyder, at autophagy kan være en tilknyttet mekanisme af ER, og erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling kan arbejde ved at målrette autofagi. Interessant, men der var ingen væsentlige ændringer i LC3II i NHBE celler (figur 3B).

De samme ændringer i LC3II blev også visualiseret gennem immunfluorescens (figur 3D). Der var et signifikant fald i LC3II fluorescens i erlotinib-cisplatin kombination behandlede celler sammenlignet med de andre behandlingsgrupper (p 0,0001).

Modulation af Autophagy Alters Følsomhed til behandling

For at bestemme om autophagy er en vigtig overlevelsesmekanisme underliggende eR, autophagy fremkaldende middel, rapamycin, og hæmmende middel, 3-MA, blev anvendt. Hvis autophagy rolle er at fremme modstand og overlevelse mod behandling, forventes det, at der vil blive øget celle overlevelse med induktion af autofagi og en omvendt fald i celle overlevelse, når autofagi hæmmes efter undergår kombinationsbehandling. Som hypotese, som vist i figur 4A, rapamycin med erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling udviste signifikant større celleoverlevelse og levedygtighed (16,5%) sammenlignet med celler, som fik erlotinib-cisplatin kombination uden rapamycin (p = 0,0004). Omvendt, når 3-MA blev tilsat med erlotinib-cisplatin kombination, celleoverlevelse var signifikant lavere (9,1%) sammenlignet med celler kun behandlet med erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling alene (p = 0,037) (figur 4B). Derudover kombination af 3-MA, erlotinib og cisplatin var i stand til at dræbe betydeligt flere celler end 3-MA alene (44,6% og 34,1% celledød, henholdsvis) (p = 0,032). Som figur 4B har vist, at inhibering autofagi med 3-MA var i stand til at sensibilisere cellerne til kombinationsbehandling, figur 4C viser resultaterne af 3-MA behandlet ERPC9 celler med erlotinib-alene og cisplatin-alone. Når 3-MA blev tilsat til erlotinib-alene (p 0,0001) og cisplatin-alene (p 0,0001) behandling var der en 39,2% og 31,0% større celledød, sammenlignet med behandling med enkelt lægemiddelbehandling uden 3-MA . Disse tilknyttede fund støtter endvidere, at autophagy kan være en beskyttende mekanisme giver større overlevelse i ERPC9 celler.

Atg3 og p-mTOR i ERPC9 Celler

Figur 5 viser resultaterne fra western blot analyse af nøgle regulatoriske proteiner i autophagy vej: p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12 komplekse, Atg7 og Atg3. Der var ingen signifikante forskelle i p-Akt, Akt, mTOR, Beclin-1, Atg5-12 kompleks, og Atg7 mellem ERPC9 og PC9 celler (figur 5A). , Ved baseline, p-mTOR var imidlertid betydeligt lavere i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p = 0,021) (Figur 5C). Derudover var der en signifikant højere baseline niveau af Atg3 i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (p = 0,018) (figur 5B). En af de vigtigste roller Atg3 er at konvertere LC3I at LC3II at fremme autophagy [32], og derfor var der en signifikant lavere niveau af LC3I i ERPC9 celler end PC9 celler (mere LC3I blev konverteret) (p = 0,008) (figur 2A) . Det lavere niveau i p-mTOR støtter yderligere konstateringen af ​​højere basale niveauer af autophagy i ERPC9 celler. Mens kan de ekstraordinære høje Atg3 repræsentere en kritisk komponent i giver og bidrage til de højere basale niveauer af autophagy og fremme af ER.

kombinationsbehandling Mål Atg3

For yderligere at evaluere hvordan kombinationsbehandling nedregulerer autofagi specifikt i ERPC9 celler, blev udført western blot analyse for ændringer i regulatoriske autofagi proteiner. Som vist i figur 6A, var der ingen væsentlige ændringer i p-Akt, Akt, mTOR, p-mTOR, Beclin-1, Atg5-12 kompleks, og Atg7 blandt behandlingsgrupperne. Der var imidlertid et signifikant lavere niveau af Atg3 når de behandles med erlotinib-cisplatin kombination sammenlignet med udgangspunktet niveau kontrol (p = 0,005) (figur 6B). Dette fund kan antyde, at erlotinib-cisplatin kombinationsbehandling kan en eller anden måde målrette overekspression eller oversættelse af Atg3 set i ERPC9 celler. Derudover disse fund støtter, at Atg3 er et afgørende element i overdragelse ER og overlevelse.

siRNA Hæmning af Atg3 Vender Erlotinib Resistance

For yderligere at undersøge den rolle, som de høje baseline niveauer af Atg3 set i ERPC9 celler blev ERPC9 celler transficeret med Atg3 siRNA og behandles korrekt. siRNA transfektion lykkedes blokering Atg3 oversættelse og autofagi aktivitet (ved lav LC3II og høje P62 niveauer i relative celler uden Atg3 siRNA) som det ses i figur 7A. Der var ingen signifikant forskel i celleoverlevelse i kontrolgruppe af ERPC9 celler transficeret med ikke-specifik siRNA (NS siRNA) sammenlignet med ERPC9 celler uden transfektion (p = 0,445). Men med Atg3 siRNA transfektion, ERPC9 celler re-sensibiliseret til erlotinib-alone behandling og havde en tilknyttet betydelig stigning i celledød på 32,0% i forhold til erlotinib-alone behandlet ERPC9 celler med NS siRNA transfektion (p = 0,043). ERPC9 celler blev også signifikant mere følsomme over for kombinationsbehandling efter Atg3 siRNA transfektion sammenlignet med NS siRNA transficerede celler; 10,3% mere celledød blev observeret (p = 0,002) (figur 7B). Imidlertid blev dette fænomen ikke set i cisplatin behandlede ERPC9 celler transficeret med Atg3 siRNA; der var ingen signifikant forskel mellem cisplatin behandlede Atg3 siRNA og NS siRNA (70,2% versus 70,8%, henholdsvis) (p = 0,924). Disse data tyder på, og støtter, at baseline opregulering af Atg3 er tæt involveret i ER og celle overlevelse og blokere oversættelse af Atg3 i ERPC9 celler er i stand til at vende ER og giver re-følsomhed over for erlotinib behandlinger. Desuden blokerer Atg3 ikke giver stigning følsom for cisplatin lægemiddelbehandling, hvilket antyder, at inhibering af Atg3 er specifik for ER.

Atg3 siRNA transfektion var i stand til at producere en betydelig stigning i følsomhed over enkelt behandlinger i det parentale PC9 cellelinie. Erlotinib med Atg3 siRNA kunne inducere 11,5% mere celledød sammenlignet med NS siRNA erlotinib behandling (p 0,0001) og cisplatin med Atg3 siRNA kunne inducere 9,7% mere celledød sammenlignet med NS siRNA cisplatin behandling (p 0,0001). Forskellen i celledød mellem kombination behandlede celler med Atg3 siRNA sammenlignet med kombinationsbehandling med NS siRNA var små (4,5%); selv om denne forskel var signifikant (p = 0,002).

Apoptose

Apoptose blev målt gennem Western blot analyse af kløvet caspase 3 og kløvet PARP. Der var signifikant lavere niveauer af spaltet PARP (p = 0,004) og spaltes caspase 3 (p 0,0001) i ERPC9 celler sammenlignet med PC9 celler (figur 8B og 8C henholdsvis).