PLoS ONE: Kræft Inhibitor af protein fosfatase 2A formidler Bortezomib-induceret Autophagy i leverkræft Uafhængigt af Proteasome

Abstrakt

Tidligere vi rapporterede, at kræft inhibitor af protein fosfatase 2A (CIP2A) formidler apoptotiske effekt af bortezomib i hepatocellulært carcinom (HCC). Her rapporterer vi en proteasom-uafhængig mekanisme, hvormed bortezomib inducerer autophagy i HCC. Vores data indikerer, at bortezomib aktiveret autofagi på en dosis- og tidsafhængig måde i HCC cellelinjer, herunder Huh-7, SK-HEP1, og Hep3B. Bortezomib nedreguleret CIP2A, phospho-Akt (P-Akt) og phospho-4EBP1 (P-4EBP1) på en dosis- og tidsafhængig måde i alle testede HCC-celler. Ektopisk udtryk for CIP2A afskaffet effekten af ​​bortezomib på autofagi. Co-behandling af bortezomib og calyculin A, en PP2A inhibitor, reducerede effekten af ​​bortezomib på P-Akt, P-4EBP1, og autofagi. Forøget phosphorylering af enten Akt eller 4EBP1 af ektopiske overekspression beskyttede celler fra bortezomib-induceret autofagi. Derudover undersøgte vi effekten af ​​ΔBtz, en bortezomib derivat, der ligner bortezomib strukturelt men har ingen proteasom aktivitet i HCC. Interessant ΔBtz demonstrerede lignende virkninger for bortezomib på autophagy, CIP2A, P-Akt og P-4EBP1, hvilket antyder, at virkningen af ​​bortezomib på autofagi er uafhængig af proteasomhæmning. Desuden viste vores

in vivo

data, som både bortezomib og ΔBtz hæmmede tumorvækst, nedreguleret CIP2A, P-Akt og induceret autophagy i Huh-7 tumorer. Afslutningsvis bortezomib inducerer autophagy i HCC gennem en CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 pathway

Henvisning:. Yu H-C, Hou D-R, Liu C-Y, Lin C-S, Shiau C-W, Cheng A-L, et al. (2013) Kræft Inhibitor af protein fosfatase 2A formidler Bortezomib-induceret Autophagy i leverkræft Uafhængigt af Proteasome. PLoS ONE 8 (2): e55705. doi: 10,1371 /journal.pone.0055705

Redaktør: Peter Starkel, St. Luc Universitetshospital, Belgien

Modtaget: 25 oktober, 2012; Accepteret: December 28, 2012; Publiceret: 1 februar 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af tilskud, NTUH 101P01 (KFC) fra National Taiwan University Hospital; NSC99-2314-B-002-017-MY2 (KFC), og NSC100-2325-B-002-036 (KFC) fra National Science Rådet, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige solid tumor verdensplan [1]. Advanced HCC er karakteriseret ved hyppige modstand mod konventionelle kemoterapeutiske midler og stråling. Der er således et klart behov for at udvikle nye terapeutiske mål og strategier for HCC terapi. For nylig er autophagy pathway dukket op som et lovende nyt mål inden for kræftbehandling. Autophagy er kendt som en homøostatisk mekanisme til opretholdelse cellulær integritet og er en katabolisk proces, der involverer nedbrydning af cytoplasmatiske komponenter via den lysosomale [2] maskineri. Autophagy spiller flere roller i kræft: det kan fremme kræft celledød eller overlevelse afhængig af et kompliceret samspil mellem metabolisk stress, veje for apoptose og autofagi [3], [4], [5]; og forstyrrelse af autofagi kan også bidrage til tumorigenese [3], [6]. En bedre forståelse af autophagy regulering kan lette opdagelsen af ​​nye potentielle terapeutiske mål i HCC.

Bortezomib er den første i klassen dipeptid borat proteasominhibitoren specifikt udpeget til at målrette 26S proteasomet [7], [8]. Bortezomib er godkendt til behandling af myelomatose og mantle-celle non-Hodgkins lymfom (NHL) og er under klinisk undersøgelse til brug i andre kræftformer [9], [10]. Ud over dets virkninger på apoptose induktion, celle-cyklus inhibering (G2-M fasen) og mange andre cellulære mekanismer associeret med proteasomhæmning [10], [11], [12], bortezomib er for nylig blevet vist at inducere autofagi i hypoxisk HeLa cervikal karcinom celler som reaktion på aktiveret endoplasmatiske reticulum (ER) stress [13], i humane prostata kræftceller gennem EIF-2α phosphorylering [14], og i menneskelige hoved og hals pladecellekræft celler i association med proteasom-afhængige JNK aktivering og Bcl-2-phosphorylering [15]. Selv om disse undersøgelser almindeligvis tyder bortezomib-induceret autofagi korrelerer med sin proteasomhæmning [13], [14], [15], den nøjagtige mekanisme af bortezomib-induceret autofagi er ikke fuldt forstået.

Det er velkendt, at pattedyr mål for rapamycin (mTOR) er en vigtig regulator af cellevækst og autofagi [16]. Endvidere aktiveret mTOR kompleks 1 (mTORC1), en af ​​de to store mTOR komponenter, aktiverer S6K og phosphorylerer 4EBP-1 (derved frigør 4EBP-1 fra eIF4E) fremme mRNA translation [17]. Desuden mTORC1 direkte interagerer med og hæmmer ULK1 komplekse, en afgørende komponent i autophagy initiering [18]. Mediering af vækstfaktor signalering ved mTOR primært som reaktion på phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt pathway [19]. Akt har en afgørende rolle i cancer celleoverlevelse og apoptose regulering, og de seneste undersøgelser har vist, at inhibering af Akt fremmer også autofagi [20], [21], [22]. I HCC har Akt pathway vist sig at blive konstitutivt aktiveres og korreleret med en dårligere prognose [23]. Vores tidligere undersøgelse viste også, at nedregulering af p-Akt er en væsentlig molekylær determinant for bortezomib-induceret apoptose i HCC-celler [24]. Det er bemærkelsesværdigt, at negativ regulering af Akt signalering kan opnås ved phosphataser, såsom phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) og proteinphosphatase 2A (PP2A). PTEN er en dual protein /lipid phosphatase, der modvirker PI3K /Akt signalering ved dephosphorylere phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PIP3) ved 3-stillingen [20]. I modsætning hertil PP2A er en serin /threonin proteinphosphatase der direkte kan dephosphorylere p-Akt og p-ERK [25]. PP2A er sammensat af katalytisk C underenhed (PP2Ac), stilladser A-underenhed (PR65) og regulatoriske B-underenheder [26]. PP2A er blevet foreslået at være en tumor suppressor [27]. For eksempel kan forøget PP2A-aktivitet inducere apoptose gennem inaktivering af Bcl-2 eller aktivering af Bad [28]. PP2A regulerer også cellecyklus, celle overlevelse og spredning af enten direkte eller indirekte hæmmer cdc2, MAPK og AKT kinaser [28]. Vores seneste data viste også, at bortezomib øger PP2A aktivitet og derved nedregulere p-Akt og inducere apoptose i HCC celler [29]. Desuden har flere cellulære hæmmere af PP2A, såsom SET [30] og CIP2A blevet identificeret [31]. CIP2A har vist sig som en roman oncoprotein og et stigende antal rapporter viser, at den er overudtrykt i mange humane maligniteter, herunder HCC [32], [33], [34], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39]. CIP2A har vist sig at stabilisere c-myc oncoprotein ved inhibering PP2A aktivitet over c-myc og således fremme forankringsuafhængig cellevækst og

in vivo

tumordannelse [31]. For nylig har vi endvidere dokumenteret, CIP2A, gennem hæmning af PP2A-afhængig p-Akt inaktivering, medierer den apoptotiske virkning af bortezomib i HCC-celler [40].

I denne undersøgelse rapporterer vi en proteasom-uafhængig mekanisme som bortezomib inducerer autophagy i HCC. Vores nuværende arbejde tyder på, at bortezomib inducerer autophagy i HCC gennem en CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 vej.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Bortezomib (Velcade®) er venligst leveret af Millennium Pharmaceuticals. For

in vitro

undersøgelser bortezomib ved forskellige koncentrationer blev opløst i DMSO og derefter tilsat til celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 5% føtalt bovint serum (FBS). Den endelige DMSO-koncentration var 0,1% efter tilsætning til medium. Calyculin A og 3-methyladenin (3-MA) ​​blev indkøbt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Antistoffer til immunoblotting såsom anti-Akt1, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (San Diego, CA). Andre antistoffer, såsom anti-LC3, -P-Akt (Ser473), -4EBP1, -P-4EBP1, -P-mTOR, -mTOR, -P-S6K, -S6K, anti-S6, -P-S6, – NF-KB, -IκB-α, -ATG3, -ATG5, -ATG7, og -Beclin 1 var fra Cell Signaling (Danvers, MA).

Cell kultur og western blot analyse

SK-HEP1 og Hep3B cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Den Huh-7 HCC-cellelinje blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan, JCRB0403). Celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml, penicillin G, 100 ug /ml streptomycinsulfat og 25 ug /mL amphotericin B i en 37 ° C befugtet inkubator, og en atmosfære af 5% CO

2 i luft. Western blot analyse blev udført som tidligere rapporteret

Autophagy analyse

Drug-induceret autofagi blev vurderet ved adskillige assays, herunder:. (1) Western blot-analyse af mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 ( LC3-II) som beskrevet tidligere; (2) Immunofluorescens af LC3-II. Kort fortalt blev Huh7 celler podet i en 6 cm skål. Efter at være blevet vasket med PBS blev celler behandlet med 800 nM bortezomib i 16 timer, og fikseret med iskold 4% paraformaldehyd. De fikserede celler blev efterfølgende inkuberet med det primære antistof kanin-anti-LC3II (1:200, # 3868, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), i blokerende opløsning (1% bovint serumalbumin i TBST) i 1 time ved stuetemperatur og derefter farvet med anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluor® 488 konjugat, # 4412, Cell Signaling) og DAPI. Celler blev undersøgt under et LEICA DM2500 fluorescens mikroskop; (3) Flowcytometrianalyse af LC3-II. Kort fortalt blev Huh7 og Hep3B podet i en 6 cm skål. Efter at være blevet vasket med PBS blev celler behandlet med 800 nM bortezomib i 16 og 24 timer, fikseret med iskold 4% paraformaldehyd, og derefter behandlet med iskold 100% methanol. De fikserede celler blev efterfølgende inkuberet med det primære antistof kanin-anti-LC3II (1:100, # 3868, Cell Signaling) i blokeringsopløsning (1% bovint serumalbumin i TBST) i 1 time ved stuetemperatur, og derefter farvet med anti- kanin-IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluor® 488 konjugat, # 4412). Salg

immunofluorescens af LC3-GFP og acridinorange Salg

Huh7-celler, dyrket på dækglas, blev transficeret med EGFP-LC3 plasmid, efterfulgt af 400 nM bortezomib behandling i 24 timer. Cellerne blev derefter hurtigt vasket med PBS og fikseret ved stuetemperatur i 15 minutter med 4% paraformaldehyd. Efter at være blevet vasket med PBS to gange, blev cellerne blokeret med 1% bovint serumalbumin i TTBS og derefter monteret. Den subcellulære fordeling af EGFP-LC3 blev observeret under et fluorescensmikroskop (LEICA DM2500). For acridinorange-farvning, blev SK HEP1 celler podet i en 6 cm skål. Efter at være blevet vasket med PBS blev celler behandlet med 800 nM bortezomib i 16 timer, fikseret med iskold 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter farvet med acridinorange (5 ug /ml) i 5 minutter ved stuetemperatur. Celler blev undersøgt under et LEICA DM2500 fluorescens mikroskop

HCC celler med konstitutivt aktiv CIP2A

CIP2A cDNA (KIAA1524) blev købt fra Origene (RC219918, Rockville, MD).. Kort fortalt, efter transfektion blev celler inkuberet i nærvær af G418 (0,78 mg /ml). Efter 8 ugers selektion, overlevende kolonier, dvs. dem, der opstår fra stabilt transficerede celler, blev selekteret og individuelt amplificeret. HCC-celler med stabil ekspression af CIP2A-myc blev derefter behandlet med lægemidler, høstet, og bearbejdet til western blot-analyse.

xenograft tumorvækst

Male NCR athymiske nøgne mus (5-7 uger alder) blev opnået fra National Laboratory Animal center (Taipei, Taiwan). Musene blev holdt i grupper og opretholdt under standard laboratoriebetingelser på en 12-timers lys-mørke cyklus. De fik adgang til steriliseret mad og vand

ad libitum

. Alle eksperimentelle procedurer ved hjælp af disse mus blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Laboratory Animal Care og brug Udvalg for National Taiwan University (Permit Nummer: 20.080.205). Hver mus blev inokuleret s.c. i den dorsale flanke med 1 × 10

6 Huh-7 celler suspenderet i 0,1 ml serumfrit medium indeholdende 50% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Når tumorerne nåede 200-300 mm

3, modtog musene en intraperitoneal injektion af bortezomib (1 mg /kg legemsvægt) eller ΔBtz (1 mg /kg legemsvægt) to gange ugentligt under hele behandlingen. Controls modtaget køretøj.

Statistisk analyse

Tumor vækst datapunkter rapporteres som gennemsnitlige tumor volumen ± SE. Sammenligninger af middelværdier blev udført under anvendelse af de uafhængige stikprøver

t

test i SPSS til Windows 11,5 software (SPSS, Inc., Chicago, IL). Salg

Resultater

bortezomib inducerer autophagy i HCC

for at undersøge effekten af ​​bortezomib på autophagy i HCC, vi først undersøgt ekspressionen af ​​mikrotubuli-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3-II), et LC3-phosphatidylethanolamin konjugat, der er et kendetegn for autofagi. Som vist i fig. 1A, bortezomib induceret autophagy i en koncentrationsafhængig måde allerede ved en koncentration på 200 nM i Huh-7, SK-HEP1 og Hep3B celler, som påvist ved stigningen i LC3-II. Derudover har vi udført en tidsafhængig analyse af bortezomib-induceret autofagi. Vore data viser, at bortezomib opreguleres ekspressionen af ​​LC3-II i en tidsafhængig måde (fig. 1B). Dernæst detekteres vi ekspressionen af ​​LC3-II ved flowcytometri. Som vist i fig. 1C

venstre

, bortezomib forøgede niveauerne af LC3-II signifikant efter bortezomib behandling på 24 timer. Desuden blev bortezomib-induceret autophagy bekræftes også af LC3-II immunfluorescensfarvning (Fig. 1C

rigtige

). Den stimulerende virkning af bortezomib på autofagi blev bekræftet af en stigning i GFP-LC3 prikker i cellerne behandlet med stoffet, som undersøgt af GFP-LC3 assay (fig. 1D

top

), og også af en stigning i acridinorange farvning for sure vesikuløse organeller (fig. 1D

bund

). Disse data indikerer, at bortezomib betydeligt aktiverer autofagi i HCC.

A, dosisafhængige virkninger af bortezomib-induceret autofagi. HCC-celler blev behandlet med bortezomib i de angivne koncentrationer i 24 timer. Cellelysater blev fremstillet til immunoblotting af mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3). B, tidsafhængige effekter af bortezomib-induceret autofagi. Celler blev udsat for bortezomib i de angivne koncentrationer i 24 eller 48 timer. C, effekter af bortezomib på LC3-II.

Venstre,

analyse af LC3-II farvning ved flowcytometri. Celler blev behandlet med bortezomib ved 800 nM i 16 eller 24 timer.

Right,

analyse af LC3-II immunfluorescens. Hep3B celler blev behandlet med bortezomib ved 800 nM i 24 timer. D,

top,

LC3-GFP farvning.

Bund,

acridinorange pletten.

Hæmning af CIP2A-Akt-4EBP1 signalvejen er forbundet med bortezomib-induceret autophagy i HCC

Vores tidligere arbejde, der er, at hæmning af CIP2A er den afgørende faktor for bortezomib-induceret apoptose i HCC celler. For yderligere at udforske den mekanisme, hvormed bortezomib induceret autophagy i HCC, vi næste undersøgt, om CIP2A spiller en rolle i bortezomib-induceret autophagy i HCC. Som vist i fig. 2A og B, bortezomib nedreguleret protein niveauer af CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og induceret autophagy i alle HCC-cellelinier, herunder Huh-7, SK-HEP1 og Hep3B, i en koncentrations- og tidsafhængig måde. Desuden har bortezomib ikke signifikant ændrer ekspressionsniveauerne af andre Autophagy-relaterede proteiner, herunder ATG7, ATG5, Beclin 1, ATG3, P-S6K, og S6K (fig. 2C). Disse resultater antyder, at inhibering af CIP2A-Akt-4EBP1 er forbundet med bortezomib-induceret autofagi i HCC-celler.

A, dosisafhængig analyse af CIP2A, Akt og 4EBP1 i HCC-celler. Celler blev udsat for bortezomib i de angivne koncentrationer i 24 timer. B, tidsafhængig analyse af CIP2A, Akt og 4EBP1 i HCC celler. Celler blev udsat for bortezomib i de angivne koncentrationer i 24 eller 48 timer. C, dosisafhængig analyse af autofagi-relaterede proteiner. Celler blev udsat for bortezomib ved de angivne koncentrationer i 24 timer.

Target validering af CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1

For at validere rolle CIP2A i mediere effekten af ​​bortezomib på autophagy i HCC, vi overudtrykt CIP2A i HCC. Vi fandt, at ektopisk ekspression af CIP2A beskyttede celler fra bortezomib-induceret autophagy i Huh-7 og Hep3B celler, hvilket indikerer, at CIP2A spiller en central rolle i mediering af autophagic effekt af bortezomib i HCC-celler (fig. 3A). Desuden, tilføjer calyculin A, en PP2A inhibitor, reducerede effekten af ​​bortezomib på CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og autofagi i Huh-7 (fig. 3B

venstre

). overekspression af Akt1 afskaffede bortezomib-induceret autophagy signifikant (fig. 3B

midterste

). Ektopisk udtryk for 4EBP1 reducerede også virkningen af ​​bortezomib på autofagi i Huh-7. Disse data indikerer, at CIP2A-PP2A-Akt-4EBP1 signalvejen spiller en central rolle ved mediering bortezomib effekt på autofagi i HCC. Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​en kombination af bortezomib og rapamycin, en mTOR-inhibitor, på autofagi. Vores data viste samtidig behandling med rapamycin og bortezomib øget autofagi signifikant (fig. 3C

venstre

). Desuden 3-MA, en autophagy inhibitor, vendt autophagic effekt af bortezomib i Huh-7 celler (Fig. 3C

rigtige

). Især har vi udført alle forsøgene ovenfor (figur 3) i hver HCC-cellelinjer og har fundet, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem disse cellelinjer med hensyn til effekten af ​​bortezomib på validerede targets. Kun nogle af de repræsentative data er blevet vist her.

A, ektopisk udtryk for CIP2A-myc afskaffer effekter af bortezomib på autophagy i Huh-7 og Hep3B celler. Celler blev transficeret med CIP2A-myc og blev udvalgt til 8 uger af G-418. Analyse af autophagy blev udført ved Western blot (WB) efter celler blev sekventielt eksponeret for DMSO eller bortezomib (200 nM eller 400 nM eller 800 nM) i 24 timer. B,

venstre,

co-behandling med calyculin A, et PP2A inhibitor, vender effekten af ​​bortezomib på CIP2A, P-Akt, P-4EBP1 og autofagi. Celler blev behandlet med calyculin A (1 mM) eller bortezomib (800 nM) i 24 timer.

Mellemøsten,

ektopisk udtryk for Akt1- reducerede effekten af ​​bortezomib på autophagy i Huh-7 celler.

Right,

ektopisk udtryk for 4EBP1 reducerede effekten af ​​bortezomib på autophagy i Huh-7 celler. C,

venstre,

co-behandling med rapamycin, en mTOR-inhibitor, forstærkede bortezomib-induceret autophagy i Huh-7-celler. Celler blev behandlet med rapamycin (100 nM) og /eller bortezomib (400 nM) i 24 timer.

Right,

Co-behandling med autophagy inhibitor 3-methyladenin (3-MA) ​​reducerede bortezomib-induceret autofagi. Huh7-celler blev behandlet med bortezomib (800 nM) og /eller 3-MA (1 mM) i 16 timer.

Virkningen af ​​bortezomib på autofagi og CIP2A er uafhængig af proteasomet

for at undersøge, om virkningen af ​​bortezomib på autofagi og CIP2A er relateret til dets proteasomhæmning aktivitet syntetiserede vi en bortezomib derivat (ΔBtz), som ligner bortezomib strukturelt bortset fra at det mangler en boronsyre funktionel gruppe, en kritisk bidragyder til proteasom aktivitet (fig. 4A

venstre

). Sammenlignet med bortezomib, ΔBtz havde ringe effekt på proteasomhæmning (Fig. 4A

midterste

) eller på NF-KB-hæmning (fig. 4A

rigtige

). NF-KB er et kendt proteasominhibitor mål. Interessant, viste ΔBtz væsentlig indvirkning på CIP2A, P-Akt, og P-4EBP1 i en koncentrations- og tidsafhængig måde i HCC ligner bortezomib (Fig 4B

venstre

.

midterste

). Samtidig behandling med autofagi inhibitoren 3-MA reducerede autophagic virkning ΔBtz (fig. 4B

højre

). ΔBtz øgede ekspressionen af ​​LC3-II (fig. 4C

venstre

), og også øget acridinorange-farvning for sure vesikulære organeller (fig. 4C

midterste Salg). Ved anvendelse af en elektronmikroskopi teknik, blev antallet af autophagic vakuoler vist at den er markant forøget i Sk-HEP1 celler behandlet med 800 nM bortezomib eller ΔBtz, men ikke i kontrolgruppen (fig. 4C

højre

). Desuden har vi undersøgt virkningerne af andre proteasominhibitorer MG132 og lactacystin, om autophagy og CIP2A. Vores data viser, at hverken MG132 eller lactacystin havde væsentlig indvirkning på autofagi eller CIP2A (fig. 4D

venstre

). Som forventet, disse to proteasominhibitorer udviste signifikant proteasomhæmning aktivitet (fig. 4D

højre

). Disse data indikerer, at virkningen af ​​bortezomib på autofagi er uafhængig af proteasomet.

A,

venstre,

kemiske strukturer af bortezomib og ΔBtz.

Mellemøsten,

virkninger af bortezomib og ΔBtz på proteasomhæmning.

Right,

virkninger af bortezomib og ΔBtz på NF-KB. B,

venstre,

dosisafhængige virkninger af ΔBtz på CIP2A, Akt og LC-3.

Mellemøsten,

tidsafhængige effekter af ΔBtz på CIP2A, Akt og LC-3.

Right,

Co-behandling med autophagy inhibitor 3-MA reducerede ΔBtz-induceret autofagi. C,

venstre

, effekter af ΔBtz på LC3-II immunofluorescens.

Mellemøsten

, effekter af ΔBtz på acridinorange farvning.

Right,

Sk-HEP1 celler behandlet med bortezomib (800 nM) eller ΔBtz (800 nM) eller køretøj blev høstet, fikseret og indlejret i anspore harpiks. Seventy nanometer tynde snit blev skåret og undersøgt ved 120 Kv med en JEM-1400 transmission elektron mikroskop. Pile angiver autophagic vakuoler. D, gjorde Andre Proteasominhibitorerne fremprovokere autofagi i HCC.

Venstre

, effekter af MG-132 og lactacystin på CIP2A og LC-3.

Right

, effekter af bortezomib, MG-132 og lactacystin på proteasomhæmning.

Effekt af bortezomib og ΔBtz på HCC xenograft tumor

For at bekræfte, om effekten af bortezomib på autofagi har potentielt relevante kliniske implikationer, vurderede vi

in vivo

effekt af bortezomib på HCC xenotransplantattumorer. Tumorbærende mus blev behandlet med vehikel eller bortezomib eller ΔBtz. Begge lægemidler blev injiceret intraperitonealt ved 1,0 mg /kg to gange om ugen i 2 uger. Alle dyr tolererede behandlingerne godt uden observerbare tegn på toksicitet og havde stabile legemsvægt under hele undersøgelsen. Ingen brutto patologiske abnormaliteter blev bemærket ved obduktion. Vores data viser, at bortezomib og ΔBtz viste lignende effekter på Huh-7 tumorvækst. Størrelsen af ​​tumoren blev reduceret væsentligt efter to ugers behandling. For at korrelere biologisk respons med virkningsmekanismen identificeret

in vitro

, effekten af ​​bortezomib på autofagi i HCC tumorer blev undersøgt. Som vist i fig. 5B og 5C, behandling af ΔBtz reducerede proteinniveauer af CIP2A og P-Akt og signifikant induceret LC3 i Huh-7-celler ligner bortezomib. Disse data viser, at ΔBtz havde betydelige anti-tumor effekt

in vivo

og vigtigere, tyder på, at bortezomib inducerer autophagy i HCC via en proteasom-uafhængig mekanisme.

A, tumor vækstkurver af Huh -7. Punkter, mean (n = 6); barer, SE. *

P

0,05; **

P

0,01. B, Western blot analyse af CIP2A, P-Akt, Akt1- og LC-3 i Huh-7 tumorer. C, immunoblots blev scannet ved en UVP BioSpectrum AC billedstabilisatorsystemet og kvantificeret ved anvendelse VisionWork LS software til at bestemme forholdet af niveauet for CIP2A til actin.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD (n = 3, *

P

0,05). D, resumé af tilstanden af ​​aktioner af bortezomib.

Diskussion

Denne undersøgelse afslører en ny mekanisme, ved hvilken bortezomib inducerer autofagi i HCC-celler (dvs. CIP2A-PP2A-Akt -4EBP1 pathway), og øger forståelsen af ​​onkogene proteiner, såsom Ras, Akt og ERK, der regulerer autofagi [6], [41]. Interessant, under anvendelse af forbindelsen ΔBtz der ligner bortezomib i kemisk struktur, men mangler signifikant proteasom hæmmende evne, viste vi, at denne CIP2A-afhængig regulering af bortezomib-induceret autofagi er ikke nødvendigvis afhængig af proteasomhæmning. Bortezomib formodes at inhibere proteasom 20S kernepartiklen ved dannelse af en stabil tetraedrisk boronsyre mellemprodukt med den N-terminale threoninrest af de aktive p-underenheder af 20S kernepartikel [7]. Baseret på vigtigheden af ​​boronsyre funktionel gruppe i blokade af proteasomet, udskiftede vi bortezomib med ΔBtz der adskiller sig fra bortezomib i sin boronat gruppe (figur 4A). ΔBtz faktisk viste lidt proteasomhæmning men alligevel fremkaldte CIP2A-afhængig autofagi på en måde svarende til bortezomib (figur 4). Denne proteasom-uafhængig CIP2A hæmning og autofagi medieret af bortezomib blev yderligere understøttet af den konstatering, at andre proteasominhibitorer (MG132 og lactacystin), påvirkede ikke signifikant autofagi og CIP2A (fig. 4D

venstre

) trods viser signifikant proteasom hæmning aktivitet (fig. 4D

rigtige

). Disse data viser klart, at virkningen af ​​bortezomib på autofagi kan være uafhængig af proteasomhæmning. Især respons hver cellelinie til induktion af LC3-I /LC3II ved bortezomib var forskellige (fig. 1A) og ikke var identiske med de ifølge ændringerne i CIP2A og P-Akt (fig. 2A). En mulig forklaring er, at disse forskelle kan være forbundet med særskilte genetiske baggrunde mellem cellelinier. Det er dog stadig muligt, at nye mål eller veje (bortset CIP2A /Akt pathway) også kan spille en rolle i formidling effekten af ​​bortezomib på autofagi.

proteasom og autofagi-lysosom veje betragtes som den to vigtigste ruter for eukaryote intracellulært protein clearance og deres kobling og interaktioner har været de seneste emner af interesse [42], [43], [44]. Det vurderes, at disse to cellulære nedbrydning systemer funktionelt er koblet og undertrykkelse af proteasom vej aktiverer autophagy gennem induceret ER stress [43], [45]. I denne sammenhæng til aktivering af autofagi funktioner kompensere for nedsat nedbrydning af ubiquitineret protein induceret ved proteasominhibitorer og lindrer ER stress [14], [45]. Følgelig kan autofagi beskytte celler mod toksiciteten af ​​proteasominhibitorer. På den anden side kan hæmning af autofagi kompromittere nedbrydning af ubiquitinproteasomvejen substrater [46]. Beviser har vist, at en kombination af autofagi hæmmere og proteasominhibitorer fremmer celledød gennem både apoptose og nekrose [14]. Med vores HCC model, har vi vist, at bortezomib induceret autophagy gennem en proteasom-uafhængig mekanisme. Tidligere vi bekræftet, at bortezomib kan inducere apoptose gennem en CIP2A-PP2A-p-Akt mekanisme, som også adskilles fra proteasomhæmning ved bortezomib [40]. Vi viste, at bortezomib induceret autophagy i HCC-cellelinier (dvs. Sk-HEP1, Hep3B, og Huh-7) der er også følsomme over bortezomib-induceret apoptose. Ved hjælp af vores HCC model er det klart, at gennem hæmning af CIP2A bortezomib fremkalder både apoptose og autofagi, som begge er uafhængige af proteasomhæmning. Desuden beviser for, at CIP2A spiller en stor rolle i at mediere bortezomib induceret apoptose og autofagi i HCC celler antyder, at CIP2A kan være en potentiel nyt lægemiddel mål i HCC og at forbindelser /lægemidler, der virker som CIP2A hæmmere kan have terapeutisk potentiale i HCC. Hvorvidt øjeblikket kendte autofagi hæmmere såsom bafilomycin A1, 3-MA eller chloraquine kan virke synergistisk med disse CIP2A-hæmmende midler til at dræbe warrants kræftceller fremtidige studier.

Ud over konstateringen af, at onkogene CIP2A medierer bortezomib induceret autofagi, denne undersøgelse identificerede p-4EBP-1 som en deltager i bortezomib induceret autophagy nedstrøms af p-Akt. Rolle p-4EBP1 blev valideret af ektopisk udtryk for 4EBP1, hvilket resulterede i en stigning i p-4EBP1, og efterfølgende reduceres effekten af ​​bortezomib på autofagi (figur 3B). 4EBP-1 er kendt som nedstrøms effektor af PI3K /Akt /mTOR signalere, at i ikke-phosphorylerede form binder tæt til eIF4E og hæmmer et vigtigt skridt i translationsinitiering [47], [48]. EIF4E er en nøglefaktor i cap-afhængig translationsinitiering (herunder flere vigtige oncoproteiner såsom c-myc, cyklin D1, hypoxi-inducerbare faktor 1, og Mcl-1), der styrer tumorcellevækst og overlevelse. Vore data antyder, at bortezomib nedreguleret CIP2A-PP2A-p-Akt associeret p-4EBP1. Det er muligt, at nedregulering af p-4EBP1 undertrykt eIF4E-afhængig translation og derved fremme bortezomib-induceret autofagi. Denne antagelse støttes af en nylig undersøgelse viser, at suppression af 4EBP1 ekspression resulterede i re-sensibilisering myc-udtrykkende prostatacancerceller til rapamycin-induceret autofagi [49]. Faktisk bemærkede vi også, at bortezomib også undertrykt udtryk for 4EBP-1 i Sk-HEP1, og Hep3B celler (figur 2A), som også bidrager til at bortezomib-induceret autofagi. Alternativt kan PP2A direkte dephosphorylere eIF4E og bidrage til bortezomib-induceret autofagi [50]. Ikke desto mindre nøjagtige mekanisme, ved hvilken p-4EBP1 deltager i autofagi aktivering i HCC er endnu ikke klarlagt, og yderligere undersøgelse er nødvendig. På trods af de aktuelle resultater, den detaljerede mekanisme, hvormed bortezomib hæmmer CIP2A stadig er brug for ukendte og yderligere mekanistiske undersøgelser. De mulige mekanismer, hvorigennem bortezomib kan påvirke transskription af CIP2A omfatter direkte eller indirekte promotor regulering af CIP2A mRNA, epigenetisk regulering af

CIP2A

gen ved DNA methylering eller mikro-RNA-maskiner, eller påvirker andre endnu ukendte molekyler der kan regulere CIP2A udtryk

som konklusion, bortezomib inducerer autofagi i HCC celler gennem en roman proteasom-uafhængig mekanisme:. CIP2A-afhængige p-4EBP-1 nedregulering. Denne undersøgelse identificerer romanen onkoprotein CIP2A som en vigtig formidler af HCC celler til bortezomib-induceret autophagy og foreslår, at CIP2A kan være en potentiel nyt lægemiddel mål i HCC. Endvidere kan opdagelsen af ​​forbindelser /lægemidler, der virker som CIP2A inhibitorer har terapeutisk potentiale i HCC terapi.