PLoS ONE: Multiplex Real-Time PCR assays, der måler den Overflod af ekstremt sjældne mutationer associeret med Cancer

Abstrakt

Vi beskriver brugen af ​​”superselektiv” primere, der muliggør påvisning og kvantificering af somatiske mutationer, hvis tilstedeværelse angår cancer diagnose, prognose, og terapi, i real-time PCR assays, der potentielt kan analysere sjældne DNA-fragmenter til stede i blodprøver (flydende biopsier). Udformningen af ​​disse deoxyribonucleotid primere omfatter både et forholdsvis lang “5 ‘anker-sekvens”, der hybridiserer kraftigt til at målrette DNA-fragmenter, og en meget kort, fysisk og funktionelt adskilt, “3’ fod sekvens”, der er perfekt komplementær til den mutante målsekvensen , men fejlparringer vildtype-sekvensen. kan pålideligt detekteres så få som ti mutante fragmenter i nærvær af 1.000.000 vildtypefragmenter, selv når forskellen mellem mutanten og vildtype er kun en enkelt-nukleotid polymorfisme. Multiplex PCR-assays, der anvender et sæt superselektiv primere, og et tilsvarende sæt forskelligt farvede molekylære beaconprober, kan anvendes i situationer, hvor de forskellige mutationer, selvom der forekommer i forskellige celler, er beliggende i samme kodon. Disse ikke-symmetriske realtid multiplex PCR-assays indeholder begrænsede koncentrationer af hvert superselektiv primer, hvilket muliggør samtidig bestemmelse af hver mutation overflod ved at sammenligne dens tærskelværdi til tærskelværdien af ​​en reference-gen til stede i prøven.

Henvisning: Vargas DY, Kramer FR, Tyagi S, Marras SAE (2016) Multiplex Real-Time PCR assays, der måler den overflod af ekstremt sjældne mutationer associeret med kræft. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10,1371 /journal.pone.0156546

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 23. marts 2016 Accepteret: 16 maj 2016; Udgivet: 31. maj 2016

Copyright: © 2016 Vargas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. denne forskning blev den åbne adgang gebyr for offentliggørelse af dette papir, og lønninger til alle forfatterne af dette manuskript understøttes af laboratoriets (Public Health Research Institute, Rutgers University) andel af indkomst fra ikke-eksklusiv licens på molekylær beacons teknologi ved PHRI Properties, Inc., som er en nonprofit selskab ejet af Rutgers University. Hverken PHRI Properties, Inc., eller nogen af ​​sine cirka 75 molekylære beacons licenstagere, havde nogen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. FRK , ST, og SAEM modtager royalties fra den ikke-eksklusive licenser til molekylær beacons teknologi ved PHRI Properties, Inc. de relevante licens amerikanske patenter: “påviseligt mærket Dual Kropsbygningsklasse oligonucleotidprober, assays og Kits” 5,925,517; og “Nucleic Acid Detection prober med ikke-FRET Fluorescens Quenching og Kits og Analyser Herunder Sådanne Probes” 6.150.097. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Det har været et længe ønsket medicinsk mål at være i stand til at opdage på et meget tidlige fase yderst sjældne mutationer, hvis tilstedeværelse i en klinisk prøve er nyttig til diagnosticering af kræft, bestemme prognose, og angiver valg af effektiv behandling [1]. påvisning og kvantitativ vurdering af relevante somatiske mutationer det har flere anvendelser, herunder: (i) påvisning af cancer i en behandlelige stadium hos patienter, der arver gener, der gør kræft mere sandsynligt; (Ii) påvisning af mutationer i godartede kræftceller, der angiver, at de nu kan metastasere; (Iii) måling af den overflod af cancerceller under behandling; og (iv) fastlæggelse af, om narkotika-resistente kræftceller er opstået under behandlingen, så behandlingen kan justeres. En yderligere mål er at udvikle metoder, der muliggør multiplex analyser, der på samme tid kan måle den overflod af forskellige sjældne mutationer. Hvis sådanne analyser skulle blive tilgængelige, kunne kræft potentielt konverteres fra en ofte dødelig sygdom til en kronisk tilstand, som kan styres af hyppig testning kombineret med individualiserede terapeutiske justeringer.

ansporet disse bestræbelser er erkendelsen af, at cancerceller, uanset hvor i kroppen de er placeret, opdele hyppigt, undergår apoptose og nekrose, og som en konsekvens, genomiske DNA-fragmenter fra disse cancerceller er til stede i hver patients blodplasma [2]. Denne erkendelse har åbnet mulighed for, at der kan påvises tilstedeværelsen af ​​sjældne mutationer indikative for kræft diagnose, prognose, og behandling og kvantificeres på et meget tidligt tidspunkt, ved at udføre “flydende biopsier,” udnytte DNA isoleret fra plasma [3-5] . Udfordringen assay designere er at finde et middel til selektivt at påvise og kvantificere disse sjældne mutante sekvensfragmenter i plasma-DNA, på trods af tilstedeværelsen af ​​rigelige vildtypesekvensen fragmenter stammer fra normale celler i hele kroppen, og trods det faktum, at forskellige relevante mutationer , skønt oprindelse i forskellige celler, opstår ofte i samme eller tilstødende kodoner. Succesen med “næste generation” sekventering til påvisning af sjældne mutant sekvens fragmenter i plasma-DNA [6-8], selv om komplekse og kostbare, har illustreret værdien af ​​denne tilgang.

Molekylære diagnostiske analyser baseret på den eksponentielle amplificering af nukleinsyre-målsekvenser, såsom polymerasekædereaktioner, er billige og tilstrækkelig følsom til at frembringe signaler fra så lidt som en enkelt template-molekyle. Udfordringen er at designe disse assays at være overordentlig selektiv, således at de muliggør eksponentiel amplifikation af muterede DNA-fragmenter, samtidig undertrykke genereringen af ​​ampliconer fra langt mere rigelige vildtype-DNA-fragmenter, selv når den eneste forskel mellem mutantsekvensen og vildtype-sekvens er en enkeltnukleotidpolymorfi.

lovende fremgangsmåder udnytter amplifikationsprimere, der er designet til at være meget selektiv. For eksempel Nukleotidsekvenserne af amplifikation ildfast mutation (ARMS) primere [9] er perfekt komplementær til mutante målsekvenser, men indeholder en “udspørgende nukleotid” på deres 3′-ende, som ikke er komplementært til det tilsvarende nucleotid i vildtype målsekvenser. De resulterende fejlparrede vildtype-hybrider er langt mindre tilbøjelige til at muliggøre syntesen af ​​amplikoner, fordi DNA-polymeraser kræver en 3′-terminal basepar at initiere syntese. Her, den selektive mekanisme er enzymatisk. På den anden side, dobbelt priming oligonucleotid (DPO) primere [10], MYT primere [11], hårnål primere [12, 13], og videregive primere [14], udnytte en anden mekanisme. De også besidder en primende sekvens, som er perfekt komplementær til en mutant mål, men indeholder en intern Interrogating nukleotid, der ikke stemmer overens det tilsvarende vildtype-sekvens. Længden af ​​deres primingsekvens er valgt således at de under hærdningsbetingelser, perfekt komplementære mutante hybrider sandsynligvis dannelse, og derfor sandsynligvis vil føre til dannelse af amplikoner, mens fejlparrede vildtype-hybrider er langt mindre tilbøjelige til at danne, og er derfor meget mindre sandsynligt at føre til dannelse af ampliconer. Alternative fremgangsmåder, som involverer PCR-fastspænding [15] eller anvendelse af hårnålen oligonucleotid blokkere [16], anvender en blanding, som indeholder både konventionelle DNA-primere, som binder til mutant sekvenser og “anti-primere”, der er designet til at binde selektivt til vild -type sekvenser, og forhindrer derved initieringen af ​​vildtype amplicon-syntese. Men alle disse metoder, men generelt anvendelig til påvisning af mutante sekvenser, enten ikke tilstrækkeligt følsomme til at påvise yderst sjældne mutanter [12-15], ikke er kompatible med realtids-PCR på grund af tilstedeværelsen af ​​unaturlige nukleotider i deres sekvens [10], eller ikke er blevet vist at aktivere kvantitative bestemmelser i multiplex real-time PCR-analyser, når forskellige mål mutationer forekommer i samme codon [9, 11, 16].

Denne rapport beskriver forsøg, der udforsker design og funktion af “superselektiv” PCR-primere, som muliggør kvantificering af sjældne mutante mål. Betydeligt, når disse primere initiere syntese på mutant DNA-fragmenter, de resulterende amplikoner eksponentielt forstærkes med høj effektivitet i efterfølgende termiske cyklusser, og real-time data giver et konventionelle midler til vurdering af overflod af mutant skabeloner i den oprindelige prøve. Derudover denne rapport beskriver særlige design for de superselektiv primere og modifikationer af PCR-format, der muliggør multiplex real-time PCR-assays, der skal udføres, at måle mængden af ​​forskellige mutant målsekvenser forhold til overflod af en reference vildtype typen sekvens til stede i hver prøve.

Materialer og metoder

Primere og molekylære beacons

superselektiv primersekvenser blev undersøgt ved hjælp af Mfold webserver [17] og OligoAnalyzer computerprogram (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) for at sikre, at under assaybetingelser de sandsynligvis ikke til at danne indre hårnålestrukturer, og det er usandsynligt at danne selvstændige dimerer eller heterodimerer med de konventionelle reverse primere. Primerne blev indkøbt fra Integrated DNA Technologies; og de forskelligt farvede molekylære beacon prober til påvisning af ampliconer blev købt fra Biosearch Technologies (Petaluma, Californien).

DNA-templates

plasmider indeholder

EGFR

sekvenser (enten L858 mutant sekvens eller vildtype-sekvens) blev fremstillet ved at indsætte et 115-basepar-gen-fragment i en pGEM

®-11Zf (+) vektoren (Promega, Madison, WI). Sekvenserne af disse plasmider blev bekræftet ved sekvensanalyse. Humant genomisk DNA kodende for

EGFR

L858R mutation blev isoleret fra cellelinie H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) og humant genomisk DNA indeholdende det tilsvarende vildtype-sekvens blev indkøbt fra Coriell Cell Arkiver (Camden, NJ). Mutanten og vildtype

EGFR

plasmider, og de humane genomiske DNA’er blev spaltet ved inkubering med restriktionsendonuklease IMsel (New England Biolabs, Ipswich, MA). De 20-pi fordøjelse blandinger indeholdt 4 pg DNA, 10 enheder IMsel, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 100 ug /ml bovint serumalbumin og 10 mM Tris-HCI (pH 7,9). Disse reaktioner blev inkuberet i 120 minutter ved 37 ° C efterfulgt af inkubering i 20 minutter ved 65 ° C for at inaktivere endonukleasen. Salg

plasmider indeholdende

BRAF

sekvenser (enten V600E mutantsekvens, den V600R mutant sekvens eller vildtype-sekvens) blev købt hos Integrated DNA Technologies, og blev fremstillet ved at indsætte et 200-basepar-genfragmentet i pIDTSmart Amp vektorer.

BRAF

plasmider blev fordøjet ved inkubation med restriktionsendonucleasen Sca I (New England Biolabs). De 20-pi fordøjelse blandinger indeholdt 4 pg DNA, 10 enheder Scal, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl, 1 mM dithiothreitol og 50 mM Tris-HCI (pH 7,9)

2. Disse reaktioner blev inkuberet i 120 minutter ved 37 ° C efterfulgt af inkubering i 20 minutter ved 80 ° C for at inaktivere endonukleasen.

PCR-assays

Monoplex realtid polymerasekædereaktioner blev udført i 30-pi volumener indeholdende 50 mM KCI, 3 mM MgCb

2, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 pM dGTP, 250 pM dTTP, 1,5 enheder AmpliTaq Gold DNA polymerase (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 120 nM af hver primer og 1 x SYBR

® Green (ThermoFisher Scientific) til overvågning amplicon overflod under kædeforlængelse fase af hver termisk cyklus.

Duplex real -Tiden polymerasekædereaktioner blev udført i 30-pi volumener indeholdende 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl

2, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 pM dGTP, 250 pM dTTP , 1,5 enheder Platinum Taq DNA-polymerase (ThermoFisher Scientific), enten 500 nM (symmetrisk PCR) eller 60 nM (ikke-symmetrisk PCR) af hver

BRAF

superselektiv primer, 1.000 nM af den traditionelle

BRAF

fælles revers primer og 300 nM af hver molekylærbeacon til overvågning af overflod af hver type amplikon under annealing fase af hver termisk cyklus.

Triplex realtid polymerasekædereaktioner indeholdt de samme reagenser som duplex reaktioner, bortset fra at de indeholdt 60 nM af hver

BRAF

superselektiv primer, 60 nM af

EGFR

superselektiv primer, 1000 nM af den traditionelle

BRAF

fælles omvendt primer og 500 nM af den konventionelle

EGFR

revers primer. Vi udnyttet

EGFR

vildtypeplasmider som reference gen mål i disse model triplex analyser, da de var tilgængelige i vores laboratorium.

Alle amplifikationer blev udført i 200-pi hvid polypropylen PCR rør (USA Scientific, Ocala, FL) i en IQ5 spektrofluorometrisk termisk cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaktionsblandingerne blev inkuberet i 10 minutter ved 95 ° C for at aktivere AmpliTaq Gold DNA-polymerase (monoplex reaktioner) eller blev inkuberet i 2 minutter ved 95 ° C for at aktivere Platinum Taq DNA-polymerase (multipleksreaktioner), efterfulgt af 55 eller 60 cykler bestående af 95 ° C denaturering i 20 sekunder, 60 ° C annealing i 20 sekunder og 72 ° C kædeforlængelse i 20 sekunder.

Resultater Salg

superselektiv primere er oligodeoxyribonukleotider hvis funktion i en PCR assay er blevet opdelt i to dele [10, 14, 18]. Funktionen af ​​effektivt at binde til et gen af ​​interesse er tildelt en relativt lang 5′-sekvens segment (som vi kalder “anker”), og funktionen til selektivt at binde til en nærliggende undersekvens inden dette gen, som indeholder mutationen af ​​interesse, og derefter initiere syntese af et amplikon, der er tildelt et separat, kort 3′-sekvensen segment (som vi kalder “fod”). Foden indeholder en “udspørgende nukleotid”, der er komplementært til det tilsvarende nucleotid i mutanten målsekvens, men ikke stemmer overens det tilsvarende nucleotid i vildtype-målsekvens. I superselektiv primere, er ankeret adskilt fra foden af ​​en yderligere, forholdsvis langt, deoxyribonukleotidsekvens segment (som vi kalder “bro”). Broen er valgt, så det sikres, at det ikke danner sekundære strukturer og ikke er komplementær til den “mellemliggende sekvens” i skabelonen molekyle, der forbinder anker målsekvensen til foden målsekvensen. Følgelig når primeren hybridiseres til en template-molekyle, brosekvensen i primeren og mellemliggende sekvens i skabelonen danne et enkeltstrenget “boble”, der funktionelt adskiller effektiv dannelse af ankeret hybrid fra dannelsen af ​​foden hybrid . De resulterende primere er bifunktionelle: under hærdningsbetingelser, den lange 5’anker sekvens muliggør primeren til at binde effektivt og selektivt til den genomiske region af interesse til stede i mål-DNA-fragmenter, mens den korte 3’fod sekvens (som besidder den udspørgende nukleotid ), fordi det er bundet til ankeret sekvensen af ​​brosekvensen, er i stand til at danne en svag (perfekt komplementære) hybrid med mutant målsekvens; endnu på grund af sin korte længde, foden er usandsynligt at danne en væsentligt svagere (uoverensstemmende) hybrid med det tilsvarende vildtype-sekvens.

Fig 1A viser et eksempel på et superselektiv primer bundet til dens mutant målsekvens. Denne særlige primer designet til selektivt at amplificere DNA-fragmenter indeholdende den

BRAF

V600E enkeltnukleotidpolymorfi, hvis tilstedeværelse i celler prædisponerer patienter for HNPCC [19, 20]. Vi henviser til denne primer som “

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1″, hvilket indikerer, at ankeret sekvensen er 24 nukleotider lang, brosekvensen er 14 nukleotider lang (på tværs fra en mellemliggende sekvens i skabelonen, der også er 14 nukleotider lang), og foden sekvensen er 7 nukleotider lang, med forespørgselsorganerne nukleotid placeret ved den næstsidste position fra primerens 3′-ende.

(A) superselektiv primer

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 indeholder en lang 5′-anker-sekvens, der binder kraftigt til skabelonstrenge, en kort 3′-fods sekvens, der indbefatter et Interrogating nukleotid, der er perfekt komplementær til den tilsvarende nucleotid i en mutant template (men ikke stemmer overens det tilsvarende nucleotid i en vildtype skabelon), og en bro sekvens, der forbinder anker sekvens til foden sekvens og som er valgt til at ikke være komplementær til den tilsvarende mellemliggende sekvens i templatestreng, hvorved der dannes en enkeltstrenget boble, der adskiller funktionen af ​​ankeret fra funktionen af ​​foden. (B) Real-time PCR-analyser, der anvender superselektiv primer

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1. Seks reaktioner indledt med 10

6

BRAF

vildtype skabeloner plus forskellige mængder af mutant skabeloner (10

1, 10

2, 10

3, 10

4 , 10

5 og 10

6) er plottet i blåt; en reaktion initieret med kun 10

6 vildtype-skabeloner afbildes med en stiplet orange linje; og en kontrolreaktion indeholdt nogen skabelon-DNA er afbildet i rødt. (C) Tærsklen cyklus målt for hver reaktion, som indeholdt mutante skabeloner er plottet som en funktion af logaritmen af ​​antallet af mutante skabeloner oprindeligt er til stede i hver reaktion. Den stiplede orange linje angiver tærsklen cyklus af reaktionen, der kun indeholder vildtype-skabeloner.

Real-time PCR-analyser, der indeholder superselektiv primere

Real-time PCR-analyser blev udført, hvis eneste forskel fra en konventionel real-time PCR-analyse var udskiftningen af ​​den konventionelle fremadrettede primer med

BRAF

V600E superselektiv fremadrettet primer vist i fig 1A. Disse monoplex assays indeholdt en konventionel revers primer, der var til stede i samme koncentration som den superselektiv primeren. Otte 30-pi PCR-assays blev fremstillet. Syv af reaktionerne indeholdt DNA-fragmenter fra 10

6 plasmider besidder den

BRAF

vildtypesekvensen og DNA-fragmenter fra enten 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1 eller 0 plasmider besidder den enkeltnukleotidpolymorfi i

BRAF

V600E mutant sekvens. Et ottende reaktion, som ikke indeholdt nogen DNA-fragmenter tjente som kontrol. Alle reaktionerne indeholdt det interkalerende DNA-farvestof, SYBR

® Green, hvis fluorescensintensitet under kædeforlængelse fase af hver termisk cyklus afspejler antallet af amplikoner syntetiserede.

Fig 1B viser resultaterne af dette eksperiment . Kontrolreaktionen der ikke indeholdt nogen skabelon DNA ikke producerede nogen falske ampliconer, såsom primer-dimerer, trods den større længde af de superselektiv primere. Reaktionen indeholdende 1.000.000 vildtype skabeloner og ingen mutant skabeloner blev undertrykt i en sådan grad, at det ikke producere et betydeligt antal amplikoner indtil omkring 50 amplifikationscykler var blevet udført. Men de seks reaktioner initieret med 1.000.000 vildtype skabeloner og forskellige antal mutante skabeloner tog signifikant færre amplifikationscykler til at generere et stort antal amplikoner. Når tærsklen cyklus (Ct) af hver af disse seks reaktioner blev plottet mod logaritmen af ​​antallet af mutante skabeloner i hver reaktion, var resultatet en lige linje (figur 1C). Denne omvendte lineær sammenhæng mellem logaritmen til antallet af mutant mål oprindeligt var til stede i en prøve, og Ct-værdi observeret for at prøve er kendetegnende for kvantitative eksponentielle amplifikationsanalyser [21, 22]. Betydeligt, Ct-værdi fra prøven indeholdende 10 mutant templates i tilstedeværelse af 1.000.000 vildtype skabeloner var let skelnes fra Ct-værdi genereres af prøven, der kun indeholder 1.000.000 vildtype skabeloner (vist i figuren som en stiplet orange linje) .

i disse assays det selektive trin forekommer, når en superselektiv primer er bundet til en DNA (-) streng skabelon, der er til stede i den oprindelige prøve, der analyseres. Når foden sekvensen af ​​et superselektiv primer initierer syntese af et amplikon, er hele sekvensen for superselektiv primer (herunder “kunstig” bro sekvens) inkorporeret i at (+) amplicon. I efterfølgende termiske cyklusser, de resulterende amplikoner amplificeret effektivt på den normale måde, med hele superselektiv primersekvens tjener som en lang konventionel primer, som er fuldstændig komplementær til (-) amplikoner, som omfatter komplementet af primeren bro sekvens på plads af den mellemliggende sekvens, der var til stede i det oprindelige skabelon (fig 2)

den selektive trin forekommer kun, når en superselektiv primer hybridiserer til en DNA. (-) templatefragmentet stede i prøven. På grund af den lille størrelse af foden sekvens, er sandsynligheden for indledning af en (+) amplicon er betydeligt større, hvis målsekvensen af ​​foden i (-) templatefragmentet er en helt komplementær mutant sekvens, end hvis målsekvensen af foden i (-) templatefragmentet er en fejlparret vildtypesekvensen. Hvis (+) amplicon syntese sker, hvorefter den resulterende (+) amplikon tjener som en skabelon for en konventionel revers primer og effektivt kopieret under den næste termiske cyklus, generering af et (-) amplicon, hvor komplementet af unikke bro sekvens, der var til stede i superselektiv primer i stedet for den mellemliggende sekvens, der var til stede i den oprindelige (-) templatefragmentet. Som et resultat, i efterfølgende varmecykler hele superselektiv primersekvens er komplementær til (-) amplikonstrenge, og eksponentiel amplifikation forekommer effektivt, og kan følges i realtid

Optimering af. design af superselektiv primere

de tre dele af en superselektiv primer tjener forskellige funktioner. 5’anker sekvens er udformet således, at den er lang nok og stærk nok, så ved annealing temperaturen af ​​PCR-assay det binder til målsekvensen, uanset hvorvidt målsekvensen er mutant eller vildtype. Den korte 3’fod hinanden, på den anden side er udformet til at være i stand til at binde til komplet komplementære mutant målsekvens ved annealing temperaturen af ​​PCR-assay, men ikke at binde til uoverensstemmende vildtypesekvensen under de samme betingelser . Rollen af ​​boblen, der dannes af broen sekvens i primeren og mellemliggende sekvens i skabelonen, er dobbelt: (i) ved at adskille forankringssekvens fra foden sekvens, tilstedeværelsen af ​​det enkeltstrengede boble forårsager dannelse af den svage fod hybrid at forekomme uafhængigt fra dannelsen af ​​den stærke anker hybrid; og (ii) ved tethering foden sekvens i primeren til den potentielle målsekvens i skabelonen, sandsynligheden for, at den korte fod sekvens (6, 7 eller 8 nukleotider langt) faktisk vil danne en hybrid er markant forøget. En fritflydende sekvens størrelsen af ​​foden ville næsten aldrig danne et hybrid med en målsekvens under PCR annealingsbetingelser. For bedre at forstå den rolle, som de forskellige sekvenssegmenter af superselektiv primere spillede, og for at forstå, hvordan man bedst kan designe disse primere, således at de er meget selektive for en given målsekvens, udførte vi en række model assays, der undersøgte den optimale design af foden sekvensen, og den optimale udformning af boblen.

vildtypesekvensen ved hvilken

BRAF

V600E mutation opstår, er aT-rig (3′-TAAAGTG-5 ‘) og dermed sikre, at de svage uoverensstemmende hybrid, at det danner med foden af ​​

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 superselektiv primer er meget usandsynligt, at danne under annealingsbetingelser af PCR-assay [23], hvilket fører til signifikant undertrykkelse af vildtype-amplicon-syntese (figur 1). Men når vi foretaget lignende analyser med en superselektiv primer designet til at detektere den enkeltnukleotidpolymorfi i

EGFR

L858R mutant sekvens, hvis tilstedeværelse i ikke-småcellet lungekræft forudsiger modstand mod tyrosinkinasehæmmere [ ,,,0],24, 25], fandt vi, at dets tilstedeværelse i en GC rig vildtypesekvensen (3′-ACCCGAC-5 ‘) resulterede i mindre suppression af vildtype amplicon-syntese. Vi gennemførte derfor en række eksperimenter med forskellige

EGFR

L858R superselektiv primer design (Fig 3) for at optimere forskelsbehandling mellem mutant sekvens og dens næsten identisk vildtypesekvens.

Broen sekvens inden for hver superselektiv primer vises med blåt, og undersøgelsesområdet nukleotid i hver fod sekvens er vist i rødt.

EGFR

L858R primere er arrangeret i grupper, der afspejler deres anvendelse i sammenlignende forsøg.

BRAF

V600E target sekvens er 69 basepar lang;

EGFR

L858R målsekvenser er mellem 79 og 87 basepar lange, afhængigt af superselektiv primer, der anvendes; og

EGFR

T790M målsekvensen er 68 basepar lang.

Virkning af at variere længden af ​​foden sekvens

Vi udforskes virkningen af ​​afkortelse af superselektiv primer fod sekvens til at overvinde den højere sandsynlighed for, at foden vil danne en hybrid med GC rig sekvens til stede i

EGFR

vildtype mål. Vi udførte tre sæt af assays, hvert sæt udnytte en superselektiv primer, hvis fod sekvens var 6, 7 eller 8 nukleotider i længden. I alle andre henseender, udformningen af ​​primerne var den samme: (i) den forespørgende nukleotid var placeret på den næstsidste position ved 3 ‘enden af ​​hver fod; (Ii) ankeret sekvensen var 24 nukleotider lang; og (iii) brosekvensen og mellemliggende sekvens var hver 14 nukleotider lang. Sekvenserne af disse tre primere (

EGFR

L858R 24-14 /14-6: 1: 1;

EGFR

L858R 24-14 /14-5: 1: 1; og

EGFR

L858R 24-14 /14-4: 1: 1) er vist i figur 3. Hvert sæt PCR-assays blev indledt med forskellige mængder af mutant template (10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, og 10

1 kopier) i nærvær af 10

6 kopier af vildtype skabelon. De resulterende tærskelværdier er plottet som en funktion af logaritmen af ​​antallet af mutante skabeloner oprindeligt tilstedeværende (Fig 4A).

Lineariteten af ​​forholdet mellem tærskelcyklus og logaritmen af ​​den oprindelige antal mutante skabeloner stede i reaktioner indeholdende 10

6 vildtype-skabeloner og forskellige mængder mutant template blev bestemt for PCR-assays initieret med forskellige superselektiv primer designs. (A) PCR-reaktioner indledt med

EGFR

L858R superselektiv primere besidder mund sekvenser af forskellig længde. (B) PCR-reaktioner indledt med

EGFR

L858R superselektiv primere, der danner symmetriske bobler af forskellig omkreds.

Ct-værdier opnået med primeren besidder den korteste fodlængde (seks nukleotider, 4: 1: 1) alle falde på en lige linje, der viser, at selv om

EGFR

målsekvens er GC rig, så få som 10 mutante skabeloner kunne kvantificeres uden indblanding fra 1.000.000 vildtype-skabeloner, var til stede. Primere besidder længere fods længder (syv nukleotider, 5: 1: 1, eller otte nukleotider, 6: 1: 1), førte imidlertid til en afvigelse fra linearitet når de mutante mål er mest sjældne på grund af utilstrækkelig undertrykkelse af amplicon syntese på de rigelige vildtype skabeloner. Disse resultater viser, at kortere fods længder, selvom sænke ligevægt overflod af mund hybrider, hvilket resulterer i længere forsinkelser før opnås tærskelcyklen, føre til øget selektivitet. Fra et termodynamisk synspunkt er forbedret selektivitet ved kortere fods længder skyldes det højere forhold af ligevægten overflod af perfekt komplementære mutante fod hybrider sammenlignet med ligevægt overflod af fejlparrede vildtype-foot hybrider.

Effekt af varierende placeringen af ​​Interrogating nukleotid

Vi undersøgte også virkningen af ​​at variere placeringen af ​​Interrogating nukleotid i foden sekvensen på primeren evne til at skelne mutant skabeloner fra vildtype-skabeloner. Vi gennemførte en række PCR-analyser, hvor seks forskellige superselektiv primere blev udnyttet, hver besidder en Interrogating nukleotid på en anden stilling i en 7-nukleotid-lang fod sekvens. Længderne af ankeret sekvens, bro sekvens og intervenerende sekvens blev holdt ved 24, 14 og 14 nucleotider. Sekvenserne af disse seks

EGFR

L858R primere er vist i figur 3. To reaktioner blev udført med hver primer, en initieret med 1.000.000 kopier af mutant template, og en indledt med 1.000.000 kopier af vildtype skabelon. De tærskelværdier cyklusser, der blev observeret, er anført i tabel 1. Resultaterne viser, at vinduet af diskrimination (ACt) mellem tærskelcyklus for mutanten og tærsklen cyklus for vildtype er størst, når placeringen af ​​Interrogating nukleotid er tættest på 3′-enden af ​​primeren. Fordi der kun er en lille forskel i ACt mellem primeren hvis udspørgende nukleotid blev placeret i 3′-enden af ​​foden (ACt = 18,8), og primeren hvis udspørgende nukleotid var placeret på den næstsidste position fra 3′-enden af ​​den fod (ACt = 18,2), konkluderer vi, at placering af Interrogating nukleotid enten position fungerer godt. Da den udspørgende nukleotid i den næstsidste position fra 3′-enden af ​​foden ikke danner et basepar med det tilsvarende nucleotid i vildtypesekvensen, under PCR udglødningsbetingelser, 3′-terminale nukleotid af foden er meget usandsynligt til dannelse af et basepar med dens tilsvarende komplementære nukleotid i vildtypesekvensen.

virkningen af ​​at variere omkredsen af ​​boblen

Vi undersøgte også virkningen af ​​at variere omkredsen af den enkeltstrengede boble, der funktionelt adskiller ankeret hybrid fra foden hybrid (se figur 1).