PLoS ONE: Androgen regulerede gener i human Prostata Xenografter i mus: Relation til BPH og prostatakræft

Abstrakt

Benign prostatahyperplasi (BPH) og prostata carcinom (CaP) er knyttet til aldring og tilstedeværelsen af ​​androgener, hvilket antyder, at androgen regulerede gener spiller en stor rolle i disse almindelige sygdomme. Androgen regulering af prostata vækst og udvikling afhænger af tilstedeværelsen af ​​intakte epiteliale-stromale interaktioner. Endvidere er den prostatiske stroma impliceret i BPH. Dette antyder, at epitelial cellelinjer er utilstrækkelige til at identificere androgen regulerede gener, der kan bidrage til BPH og CaP, og som kunne tjene som potentielle kliniske biomarkører. I denne undersøgelse, brugte vi en menneskelig prostata xenograftmodel at definere en profil af gener reguleres

in vivo

af androgener, med vægt på at identificere kandidat biomarkører. Benign overgangszone (TZ) humant prostatavæv fra radikale prostatektomi blev podet til sub-renal kapsel site af intakte eller kastrerede immundefekte mus, efterfulgt af fjernelse eller tilsætning af androgener hhv. Microarray analyse af RNA fra disse væv blev anvendt til at identificere gener, der var; 1) stærkt udtrykt i prostata, 2) havde væsentlige udtryk ændringer som reaktion på androgener, og, 3) koder ekstracellulære proteiner. I alt 95 gener, der opfylder disse kriterier blev udvalgt til analyse og validering af udtryk i patientens prostata væv ved hjælp af kvantitativ real-time PCR. Expression niveauer af disse gener blev målt i poolede RNA fra humane prostata væv med varierende sværhedsgrad af BPH patologiske ændringer og CaP af varierende Gleason score. Et antal androgen regulerede gener blev identificeret. Derudover en delmængde af disse gener var overudtrykt i RNA fra kliniske BPH væv, og niveauerne af mange blev fundet at korrelere med sygdomsstatus. Vores resultater viser gennemførligheden, og nogle af de problemer, ved at anvende en mus xenotransplantationsmodel at karakterisere androgen reguleret ekspression profiler af intakte humane prostatavæv

Henvisning:. Kærlighed HD, Booton SE, Boone BE, Breyer JP , Koyama T, Revelo MP, et al. (2009) Androgen regulerede gener i human Prostata Xenografter i mus: Relation til BPH og prostatakræft. PLoS ONE 4 (12): e8384. doi: 10,1371 /journal.pone.0008384

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: August 18, 2009; Accepteret: November 18, 2009; Udgivet: December 21, 2009

Copyright: © 2009 Kærlighed et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde støttet af National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme (NIDDK) MPSA Consortium tilskud UO1-DK63587, National Institutes of Health (NIH) tilskud DK067049 og The Vanderbilt Microarray Shared Resource, støttet af Vanderbilt Ingram Cancer center, tilskud P30 CA68485, og Vanderbilt Digestive Disease center, give P30 DK58404, og Vanderbilt Vision center, give P30 EY08126. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Benign prostatahyperplasi (BPH) er yderst almindelig i aldrende mænd, der bidrager til mønstret for sygelighed kendt som nedre urinvejssymptomer (LUTS), og resulterer i betydelige årlige udgifter til sundhedsvæsenet [1]. På trods af tilgængeligheden af ​​medicinske og kirurgiske behandlinger for BPH er der stadig utilstrækkelig forståelse af de involverede i godartet patologisk vækst af den menneskelige prostata processer

in vivo

[2]. Sådanne oplysninger kunne tjene til bedre at forudsige, hvilke patienter kan have gavn af nuværende medicinsk behandling eller er mere tilbøjelige at gå videre til at kræve kirurgisk indgreb, samt informere valg af nye medicinske metoder rettet mod nye veje.

BPH optræder som mænd alder og androgener er nødvendige for udviklingen af ​​tilstanden [3], [4]. BPH er kendetegnet patologisk ved glandulær og stromal hyperplasi i prostata overgangszonen (TZ) [5]. Den reaktivering af embryonale induktive potentiale i prostata stroma er blevet foreslået som en årsag til BPH [3], [5], [6], [7]. Dette er baseret på den idé, at prostata udvikling skyldes den lokale samspil af vækstfaktorer mellem epitel og stroma elementer af organet under indflydelse af testikulære androgener, hvilket antyder, at androgen regulerede gener spiller en vigtig rolle i sygdommen. Denne hypotese understøttes af betydelig eksperimentel evidens især fra væv rekombinations modeller [8], [9], [10].

prostatahyperplasi inflammation har også været impliceret i patogenesen af ​​BPH [11], [12] [13], [14]. Inflammation er associeret med sværhedsgraden af ​​BPH, og Mtops (medicinsk terapi af prostata symptomer) undersøgelse antyder, at risikoen for BPH progression og akut urinretention er større hos mænd med prostata inflammation [13], [15]. Øget prostatabetændelse kan også resultere i forstyrrelse af epitelial struktur og arkitektur, hvilket resulterer i øgede serumniveauer af prostataspecifikt antigen (PSA).

prostatavækst, differentiering og voksen funktion er afhængig af tilstedeværelsen af ​​androgener. Det er velkendt, at androgener kontrol vækst og differentiering via mesenchymale-epitel interaktioner. I den voksne prostata, er androgener menes at virke gennem det stromale androgen receptor (AR) for at opretholde en vækst-hvilende kirtel [16], [17] og gennem epitel AR at fremkalde den sekretoriske differentieret funktion af prostata epitel [18] . I modsætning til normal vækst-ubevægelighed, hyperplastisk vækst af kirtelepitel og stroma i overgangszonen i BPH repræsenterer ændringer i balancen mellem celledeling og død. BPH kan således uhensigtsmæssigt rekapitulere de vigtigste begivenheder i prostata udviklingsmæssige biologi. De mesenkymale og epitel gener reguleret af androgener, der er vigtige i unormal prostata vækst i BPH endnu ikke helt fastlagt. Studier med højt gennemløb cDNA microarrays med androgen stimuleret karcinom cellelinjer er usandsynligt, at være relevante for enten prostata udvikling eller BPH. Transformerede epitelceller i kultur har en markant anderledes fænotype, og tilhørende proteomet, fra deres

in vivo

modstykker. Desuden sådanne fremgangsmåder giver ikke mulighed for samtidig påvisning af centrale stromale celle-gener eller til gener, der kan moduleres som en konsekvens af afgørende epitel-stromale interaktioner.

Mere biologisk relevante forsøg med cDNA microarray analyse af BPH væv har blevet rapporteret. Luo et al. analyseret ekspressionen af ​​6.500 humane gener i prostatakræft og BPH væv fra patienter, der undergår radikal prostatektomi eller transuretral resektion af prostata (TURP) [19], [20]. Der blev fundet en række gener, der skal konsekvent opreguleret i BPH sammenlignet med normal prostata. Disse omfattede

IGF1

,

IGF2

,

TGFB3

,

BMP5

,

MMP2

,

COX2

, og

GSTM5

. Men disse undersøgelser benyttede væv beriget med epitelceller. Som følge heraf kunne analyserne er gået glip af potentielt afgørende gener overvejende udtrykt i stromaceller. Disse undersøgelser behandlede ikke om nogen af ​​patienterne havde undergået forudgående androgen-ablation terapi. Metoder baseret på RNA udvundet fra væv heller ikke mulighed for direkte manipulation af hormonal stimulation, hvilket begrænser muligheden for at mere direkte detektere gener reguleres af androgener, som kan tjene som om respons på behandlinger rettet mod androgen stimulation eller nye mål for alternativ medicinsk behandling i dette androgen drevet sygdomsprocessen.

i en anden relevant undersøgelse blev genekspressionsprofiler i prostatiske stromale celler fra forskellige prostata zoner analyseret, sammenligner normale og sygdomsramte væv [21]. Der blev fundet en række gener, der skal udtrykkes differentielt mellem BPH stroma og normal overgangszone (TZ) stroma. Mens mange potentielt vigtige stromale gener blev identificeret, som kan spille en rolle i BPH, disse undersøgelser anvendes isolerede stromale celler dyrket

in vitro

, hvilket sandsynligvis ville resultere i ændret genekspression mønstre fra dem, der ville ses

in vivo

.

i den foreliggende undersøgelse anvendte vi oligonukleotid mikroanalyse til at undersøge ekspressionen af ​​androgen regulerede gener i godartet humant prostatavæv vokser som xenografter i alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus [22]. Denne tilgang fastholder biologisk relevante interaktioner af epitel og stroma som det sker

in vivo

og giver mulighed for direkte manipulation af androgener, enten ved kastration eller hormonelle tilskud af værten. Den resulterende datasæt blev derefter analyseret for at identificere relativt højt udtrykte gener, som blev androgen regulerede. I et forsøg på at identificere potentielle biomarkører som kan underkastes fremtidig blod-baserede test, blev der lagt vægt på gener, hvis produkter er blevet kendt eller forventet at være ekstracellulær. Ekspression af disse gener blev derefter analyseret ved hjælp af QRT-PCR med cDNA pools afledt af væv fra patienter med minimale, mild, moderat og svær BPH patologi ændringer, eller med CaP, for at afgøre, om ekspression korreleret med sygdomsstatus.

Materialer og metoder

Etik Statement

de-identificerede menneskelige prostata vævsprøver blev opnået fra Vanderbilt Tissue Acquisition Core via Patologisk Institut i overensstemmelse med Vanderbilt IRB-protokoller. Alle patienter underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til uspecificerede forskningsformål. Alle forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven og godkendt af Vanderbilt Institutional Animal Care og brug Udvalg. Animal pleje /velfærd og veterinære tilsyn blev leveret af Vanderbilt Divison of Animal Care.

Histopatologisk Analyse og Sample Selection

For at bestemme sværhedsgraden af ​​BPH patologi ændringer for sager, anvendes til RNA ekstraktion, TZ områder, der berøres af kirtel og stromal hyperplasi blev skitseret i hele mount sektioner fra radikal prostatektomi (RP) prøver opnået via Patologisk Institut i overensstemmelse med Vanderbilt IRB-protokoller. TZ volumener blev bestemt ved planimetri med et digitaliseret tegneplade, på en måde identisk med vores rutine bestemmelse af det totale tumorvolumen i RP’er [23], [24], [25]. Blev foretrukket tilfælde med lille volumen perifere zone (PZ) tumorer, således at en samlet forstørret prostata vil skyldes TZ udvidelsen og reducere sandsynligheden for, at hormonelle metabolisme potentielt relevante for BPH ville ændres ved stort volumen prostatacancer [26] . BPH blev kategoriseret fra 37 tilfælde som minimal (min), mild, moderat eller svær, baseret på følgende kriterier. Min /kontrol: TZ volumen 4,5 cm

3, prostata vægt 34 g, Ingen BPH knuder; Mild BPH: TZ volumen 4.5-8.99 cm

3 eller prostata vægt 34-44.99 g eller BPH knuder; Moderat BPH: TZ volumen 9-16,99 cm

3 eller prostata vægt 45-59.99 g og BPH knuder; Svær BPH: TZ volumen ≥17 cm

3 eller prostata vægt- ≥60 g og BPH knuder. Prostata cancer væv blev klassificeret som moderat differentierede (Gleason score 5-6) eller dårligt differentierede (Gleason score 8-9). Snap frosne frisk væv kerner indkøbes som beskrevet nedenfor blev behandlet for RNA og histologi [27].

Sub-Renal Xenografting af Fresh Menneskelig TZ Prøver og Hormonelle Ablation Strategies

De-identificerede menneskelige prostata væv prøver blev opnået fra Vanderbilt Tissue Acquisition Core via Patologisk Institut i overensstemmelse med Vanderbilt IRB protokoller. 6 mm diameter kerner opnået intraoperativt fra friske RP prøver blev indkøbt fra højre og venstre TZ og PZ fra midten til base og fra midten til spids, som beskrevet [27] og histologisk analyse blev udført på frosne snit af fuld tykkelse tværsnit. Kerner bestemmes til at indeholde den normale TZ væv blev skåret i stykker på ca. 2-3 mm i tykkelse og 4-6 stykker blev derefter xenotransplanteret under de renale kapsler af voksne mandlige alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus [CB-17 /IcrHsd-SCID-mus ( Harlan, Indianapolis, IN)]. TZ væv fra hver af seks patienter blev xenotransplanteret i sæt af 10 kastrerede SCID-mus med visse grupper af mus, der modtager væv fra to forskellige patienter, når de foreligger, podet på kontralaterale nyrer. Fem mus fra hver gruppe blev givet subkutane implantater, der består af en 2,5 cm længde silastic-rør (ID 1.98 mm x OD 3,18 mm, Dow Corning, Midland, MI), der indeholdt 25 mg testosteron (PCCA, Houston, TX). Enderne af silastic-rør blev forseglet med silikone type A medicinsk klæbemiddel (Dow Corning). En lille mængde af majsolie blev tilsat inden forsegling af slangen for at lette opløsningen af ​​testosteron. Efter at have ladet de xenotransplantater at fastslå i en måned, blev implantaterne fjernet fra testosteron suppleret mus, og 25 mg testosteron-pellets (produceret med en Parr Pellet Press, model 2816 med 4,5 mm dø, Parr Instrument Company, Moline, IL) blev implanteret subkutant i mus, der ikke havde modtaget testosteron. Kontrolmus blev aflivet ved androgen tilsætning eller fjernelse, og de resterende mus fra hver gruppe blev aflivet efter 1, 3, 7 og 14 dage efter androgen tilsætning eller fjernelse. Høstede xenotransplantater blev hurtigt dissekeret under forstørrelse og lynfrosset i flydende nitrogen. Frosne væv blev opbevaret ved -80 ° C.

RNA-ekstraktion og cDNA microarrays

RNA ekstraktion af lynfrosset TZ væv og høstet xenotransplantater blev udført under anvendelse af en modifikation af tidligere beskrevne fremgangsmåder [27] , [28]. Kort beskrevet RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), efterfulgt af en anden RNA-isolering under anvendelse af RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) med DNAse behandling. RNA-prøver blev opbevaret ved -80 ° C. RNA kvalitet blev analyseret ved Vanderbilt Microarray delte ressource (VMSR) under anvendelse spektrofotometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) og bioanalyse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA-prøver af xenografter blev forelagt VMSR for forstærkning (NuGen Systems, Inc., Traverse City, MI) og mærkning, efterfulgt af hybridisering til microarrays udskrives fra Human Version 2.0 OligoLibrary, (Compugen, San Jose, CA), som indeholder 28.830 unikke gener fra i alt 29,134 oligoer. Henvisningen RNA blev skabt ved at samle RNA-prøver fra både kastrationsniveauer og androgen behandlede væv fra dag nul kontrol mus.

Statistisk Analyse af Microarray data

På grund af den betydelige variation iboende i individuelle patienter, er tid 0 for hver vævsprøve blev anvendt som kontrol eller referenceprøven snarere end en standard referenceprøve tværs af hele eksperimentet. Data blev normaliseret ved Lowess hjælp GeneTraffic software (Iobion Informatik, La Hoya, CA) og importeres til GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) til efterfølgende analyse. Indledningsvis blev kun dag 0 og dag 14 tidspunkter betragtes, med gener, der havde mindst en 1,5-fold opregulering i dag 14 prøven vs. dag 0 valgt, hvilket gav 5.679 gener /prober. En ANOVA-analyse blev anvendt til at identificere gener med betydelige forskelle i udtryk, med et

P

-værdien cut-off på 0,05, hvilket indikerer 284 forventede falsk positive gener. En Welch t-test blev derefter anvendt til at identificere gener med signifikante forskelle (

P

-værdi mindre end 0,05) i ekspression mellem dag 0 og 14 på tværs af alle vævsprøver. Denne liste blev derefter filtreret ved signal ekspression værdi, bevarer den øverste 95% af signal dynamikområde, hvilket gav 784 gener /prober. Denne analysemetode blev uafhængigt udført for både kastreringsområdet og testosteron suppleret datasæt. Alle statistiske analyser af microarray data blev udført af VMSR

Identifikation af kandidatlandenes biomarkør Mål

Potentielle kandidatgener blev systematisk udvalgt med overlappende bioinformatik kriterier, beskæftiger WebGestalt:. 1) androgen-reguleret (1,5 fold eller

P

≤0.05 inden for vores microarray data), 2), udtrykt ved betydeligt højere niveauer i prostata i forhold til andre væv (

P

≤0.05 ved hypergeometriske test), og 3) ekstracellulære rum eller celleoverfladen (Gene ontogenese kategorier). Disse kriterier gav et sæt gener, der omfattede tidligere validerede biomarkører, herunder

KLK3

,

ACPP

, og

MSMB

. Adskillige yderligere gener kendt eller mistænkt for at være involveret i BPH baseret på tidligere undersøgelser var “manuelt” inkluderet for yderligere undersøgelse:

IGF1

,

IGF1R

,

TGFB1

,

TGFB3

,

TGFBR1

, og

TGFBR2

. I alt 84 gen mål (og

18S

rRNA housekeeping kontrol-gen) blev udvalgt til bekræftelse af ekspression i patientprøver, flere vurderes med redundante sonder.

Real-Time QRT-PCR Bekræftelse

en TaqMan lav densitet mikrofluid række kort, format 96a (Applied Biosystems, Foster City, CA) er designet til analyse kandidatgener fra microarray analyse og kontrol gener, for i alt 96 mål. 1 ug totalt RNA blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA ved anvendelse af High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems). Efter cDNA syntese blev RNA nedbrudt ved alkalisk hydrolyse, justeret til neutral pH, og cDNA renset ved adsorption til silicagel (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen Inc.) og elueret i 64 pi 10 mmol /l Tris-HCI (pH 8,5) . cDNA mængder blev målt spektrofotometrisk (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). cDNA blev fortyndet til 0,25 ng /pl i 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), indlæses i mikrofluid kort, forseglet og centrifugeret. Kort blev derefter cykliseret på en ABI Prism 7900HT Detektionssekvensen systemet, og data analyseres med SDS 2.1 software (Applied Biosystems). Efter normalisering til det endogene kontrol, 18S rRNA, niveauer blev udtrykt i forhold til kontrol-RNA pool kalibrator (fold ændring). RNA’er fremstillet fra hver kategori af BPH væv blev samlet fra 5-10 patienter. Kontrol RNA blev puljet fra patienter uden mærkbar TZ ekspansion. Analysen omfattede fire replikater for de milde og alvorlige BPH pools, samt moderat differentierede og dårligt differentierede prostatakræft puljer, og otte gentagelser til kontrol og moderate BPH puljer.

immunhistokemisk farvning

Humane prostata vævsprøver fra paraffinindlejret hele mount blokke fra de 43 patienter, der oprindeligt karakteriseret for BPH patologi sværhedsgrad og anvendt til tilsvarende TZ afledt RNA blev opnået fra Vanderbilt Tissue Acquisition Core via patologisk Institut og væv mikroarrays blev genereret ved en af forfatterne (MPR). De microarrays indeholdt tre 0,6 mm kerneprøver, to fra TZ og en fra PZ væk fra kræft pågældende område. Farvning af vævssnit blev udført under anvendelse af en tidligere beskrevet protokol [29]. Sektioner (5 um) blev skåret og monteret på ladede objektglas. Efter afparaffinering og rehydrering blev vævssnittene underkastes antigen-genvinding ved opvarmning i en mikrobølgeovn i 10 minutter i Vector H-3300 antigen demaskering opløsning (1:100; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Objektglas blev derefter inkuberet i 0,3% hydrogenperoxid i methanol i 30 minutter ved stuetemperatur (RT), efterfulgt af 1 times inkubation i 5% gedeserum i PBS ved stuetemperatur. Objektglas blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C i 5% gedeserum i PBS. Antistoffer bruges var en mus monoklonalt mod TIMP2 (1:300, sc-21735, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA), og kanin polyklonale mod FGF2 (1:500, sc-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og SMOC1 (1:100, Atlas Antistoffer, Stockholm, Sverige). Objektglassene blev derefter vasket og inkuberet i et biotinyleret sekundært antistof (kanin-anti-muse eller svin anti-kanin, 1:300, DAKO, Carpinteria, CA) ved stuetemperatur i 60 min, vasket i PBS grundigt, derefter inkuberet i ABC-HRP kompleks (Vector Laboratories) i 30 min. Bundne antistoffer blev derefter visualiseret ved inkubation med flydende 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAKO). Objektglas blev derefter skyllet grundigt i ledningsvand, modfarvet med hematoxylin, og monteret. Farvede vævssnit blev fotograferet og bearbejdet ved hjælp af en Zeiss AX10 Imager.M1 mikroskop og AxioVision Slip 4.6 software.

De immunofarvede slides blev gennemgået af en patolog (MPR) blindet til BPH patologi sværhedsgraden af ​​sagen og resultater udtrykt i en semi-kvantitativ måde. Procent farvning blev bedømt på en skala fra 0 til 4, hvor 0 = ingen farvning, 1 = mindre end 25%, 2 = 25% til 50%, 3 = 50% til 75%, og 4 = 75% til 100%. Intensiteten af ​​farvning blev bedømt på en skala fra 1 til 3, hvor 1 = mild, 2 = moderat og 3 = markant. For en prøve giver ingen farvning, intensiteten score var også 0. Når både stromale og epitelial farvning var til stede, blev scoring udført separat. For at beregne et protein udtryk indeks, blev den procentvise score summeres med intensiteten score. De kombinerede scoringer blev plottet for hver BPH patologi kategori (minimal, mild, moderat svære BPH ændringer), og Kruskal-Wallis test blev brugt til at sammenligne de samlede scores på tværs af forskellige sygdommens sværhedsgrad status.

Resultater

Androgen-genekspression Profiler i human prostata Transition Zone

Vi profileret genekspression mønstre fra humane prostata TZ xenografter, efter tilføjelse eller subtraktion af testosteron. Figur 1 illustrerer den generelle ordning, der anvendes til manipulation af androgen niveauer i SCID-mus huser sub-renal kapsel prostata implanteret. Totalt RNA blev fremstillet ud fra høstede xenotransplantater med eller uden udsættelse for testosteron i 0, 1, 3, 7 og 14 dage. En pulje fremstillet af lige store mængder af RNA fra dag 0 kastrationsniveau og intakte muse-xenotransplantater blev anvendt som en standard reference. I alt 58 hybridiseringer blev afsluttet, som omfattede prøver fra seks patienter. Første analyse viste en høj grad (op til 10 gange) af patient-til-patient variation i ekspressionsniveauer i kendte androgen regulerede gener, såsom

KLK3

(PSA). For at muliggøre dette forventede biologiske variabilitet mellem individuelle patientvæv, blev hver patients væv afledt RNA-prøver igen centreret i denne patientens tid 0 kontroller. For den primære analyse blev to tidspunkter betragtes, dag 0 og 14, hvilket gav 5.679 gener med en 1,5 gange eller større forøgelse i ekspression. En ANOVA-analyse blev udført på disse 5.679 gener, med en

P

-værdi afskæring på 0,05, hvilket forudsiger 284 falske positiver. Gener, der havde mindst en 1,5-fold stigning eller et fald i ekspression i dag 14 prøven vs. dag 0 blev derefter filtreret ved signal ekspression værdi, bevarer den øverste 95% af signal dynamikområde, hvilket gav 784 gener. De microarray data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus [30] og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE17862 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE17862) .

TZ-væv fra seks patienter var xenotransplanteret under de renale kapsler af kastrerede SCID-mus (10 mus per patient). Fem mus fra hver gruppe blev derefter givet subkutane implantater indeholdende 25 mg testosteron. Efter at have ladet de xenographs at fastslå i en måned, blev implantaterne fjernet fra testosteron suppleret mus, og 25 mg testosteron-pellets blev implanteret i mus, som ikke havde modtaget testosteron. Kontrolmus blev aflivet ved androgen tilsætning eller fjernelse, og de resterende mus fra hver gruppe blev aflivet efter 1, 3, 7 og 14 dage.

Genes opreguleret af androgener i Human TZ Xenografter

Tabel 1 viser de øverste 45 gener, der blev opreguleret i respons på androgen, sorteret efter fold ændring (i faldende rækkefølge). De tre bedste gener,

KLK3

(PSA),

MSMB

(beta-microseminoprotein), og

TMEPAI

(transmembrane prostata androgen-induceret protein) blev alle tidligere velkendt at være reguleret af androgener i human prostata [31], [32], [33]. Adskillige andre gener identificeret som opreguleret i humane TZ xenotransplantater af testosteron, har også tidligere vist at være reguleret af androgener. Disse omfatter

TRPM8

(transient receptor potentiel melastatin medlem 8), en formodet prognostisk markør og terapeutisk mål i prostatacancer [34], [35],

ACPP

(prostatasyrephosphatase) [36 ],

SCGB1A1

(uteroglobin) [37],

NDRG1

(N-myc nedstrøms reguleret gen 1) [38], og

CREB3L4

(cAMP responsive element bindende protein 3-like 4) [39].

RNASEL

er blevet rapporteret som en kandidat arvelig prostatakræft gen [40]. Andre gener identificeret der er blevet rapporteret som androgen-reguleres eller er involveret i BPH eller prostatacancer inkluderet

PTGDS

(prostaglandin D2 syntase),

FGFBP1

(fibroblast vækstfaktor bindende protein 1),

KLK11

(kallikrein 11),

CXCL5

(chemokin (CXC motiv) ligand 5),

FKBP11

(FK506-bindende protein 11) og

TIMP1

( væv hæmmer af metalloproteinase 1).

TMEPAI

(transmembrane prostata androgen-induceret protein) var den mest udtrykte androgen-reguleret gen identificeret. Yderligere højt udtrykte, androgen-regulerede gener inkluderet

KLK3

(PSA),

MSMB

(beta-microseminoprotein),

ACPP

(prostatasyrephosphatase) og

SCGB1A1 Hotel (uteroglobin).

Gener opreguleret i respons til androgen tilbagetrækning

tabel 2 lister top 45 gener, der var opreguleret som svar på tilbagetrækning af androgen i 14 dage , sorteret efter fold ændring (i faldende rækkefølge). Et af generne identificeret,

GLI1

opreguleres i muse prostata efter kastration [41]. En anden gen identificeret med forøget ekspression var

ANNAT1

(annexin 1), som er blevet rapporteret til at falde i androgen stimuleret prostatacancer sammenlignet med benign prostatahyperplasi epitel [42].

Kvantitativ RT -PCR analyse af human prostata-RNA pools

for yderligere at undersøge ekspressionsniveauerne af androgen regulerede gener identificeret ved microarray analyse blev kvantitativ RT-PCR-analyse udført på udvalgte mål ved hjælp af RNA-puljer afledt af humane prostata væv. En vigtig klinisk behov er at identificere biomarkører, der giver prognostiske information vedrørende BPH progression eller som kan forudsige respons på behandlinger, herunder 5-a-reduktaseinhibitorer. Secernerede proteiner, som let kan måles i blod er særligt attraktive kliniske mål. Fra genekspressionsprofilerne i hormon manipuleret TZ xenografter blev potentielle biomarkører systematisk udvalgt med overlappende bioinformatik kriterier, beskæftiger WebGestalt. Genmål udvalgte var 1) androgen-reguleret inden for vores microarray data, 2) udtrykt ved signifikant højere niveauer i prostata i forhold til andre væv, og 3) kendt eller forventet at udtrykke secernerede eller celleoverfladeproteiner. Disse kriterier gav et sæt kandidatgener (tabel 3), der omfattede nogle tidligere kendte biomarkører, herunder

KLK3

,

ACPP

, og

MSMB

, yderligere validering vores eksperimentelle tilgang . Andre gener af interesse tilføjet “manuelt” for RT-PCR-analyse var

IGF1

,

IGF1R

,

TGFB1

,

TGFB3

,

TGFBR1

, og

TGFBR2

. Ekspressionsniveauerne for disse målgener blev målt i RNA-pools fremstillet af TZ væv, der er udpeget som havende mild, moderat og svær BPH ændringer, samt moderat og dårligt differentieret prostatakræft. RNA for hver kategori af BPH eller prostata cancer væv blev samlet fra 5-10 patientprøver. Kontrol RNA blev puljet fra TZ prøver fra patienter uden mærkbar TZ udvidelse fra glandulær og stromal hyperplasi.

Resultaterne af QRT-PCR analyser er vist i tabel 4. RNA-ekspression blev bestemt for 86 kandidat biomarkør gener. Af disse 72 gener blev bestemt til at have en mere end 6 gange højere niveau end den normale kontrol pool i mindst én af BPH eller prostatacancer puljer. I forhold til kontrolgruppen prostata RNA pool, de gennemsnitlige niveauer i BPH eller prostata cancer RNA pools med ekspressionsniveauerne blev en fold, der er udpeget som “lav”, 1- til 6-fold blev betegnet som “moderat”, og 6 gange blev betegnet som “høj”. Baseret på disse kriterier blev hvert gen henføres til en af ​​seks kategorier (tabel 4). Femten gener var høje i både BPH og prostatacancer, 41 gener var høje i BPH og moderat i prostatacancer, to gener var høje i BPH og lav i prostatacancer, og fem gener var moderat i BPH og høj i prostatacancer. Ingen gener blev fundet, var klassificeres som “lav” i BPH.

Kandidat BPH biomarkør Gener

En række gener havde ekspressionsniveauerne i BPH puljer, der steg med sygdommens sværhedsgrad . Nogle af generne havde ekspressionsniveauer, der blev særligt forhøjet hos BPH, men relativt lavere i prostatacancer pools. Disse gener ville forventes at have den bedste potentiale som kandidat BPH biomarkører, herunder specificitet sammenlignet med prostatacarcinom. De udtrykte ekstracellulært og med en gennemsnitlig udtryk niveau mindst tre gange større i BPH RNA puljer end i prostatakræft RNA pools inkluderet:

CDH13

,

CHRNB1

,

COL4A5

,

EFEMP2

,

EMP3

,

F10 Hotel (16 gange),

FGF2

,

FGFBP1 Hotel (10 gange ),

IGF1

,

IGF2 Hotel (18 gange),

LIPG

,

RaRb

,

SGCA

,

SGCD

,

TGFB1

,

TGFB3 Hotel (14 gange),

TGFBR2

TIMP2

af “høj i BPH, moderat i prostatakræft “gruppe;

SMOC1

(26 gange) i “høj i BPH, lav i prostatakræft” gruppe; og

SCGB3A1 Hotel (15 gange) og

SCGB1A1 Hotel (14 gange) i “moderate i BPH, lav i prostatakræft” gruppe.

immunhistokemisk farvning for Select genmål i Patologi-Karakteriseret BPH væv Salg

for at bestemme om forskellene i RNA ekspressionsniveauer observeret i BPH væv var også til stede på proteinniveauet og for yderligere at karakterisere epitel- og /eller stromale lokalisering af potentielle forøget ekspression udførte vi immunhistokemi (IHC) på en BPH tissue microarray (TMA). Grupperingen indeholdt 129 vævssnit fra 43 unikke patienter, indeholdende BPH væv med patologier spænder fra minimal til svær som defineret i Materialer og Metoder.