PLoS ONE: MicroRNA-7 Hæmmer tumormetastaser og Fortryder Epithelial-Mesenchymale Overgang gennem AKT /ERK1 /2 Inaktivering ved målretning EGFR i Epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) overekspression og aktivering resultat i øget proliferation og migration af solide tumorer, herunder kræft i æggestokkene. I de seneste år, montering data viser, at EGFR er en direkte og funktionel mål for miR-7. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-7-ekspression blev signifikant nedreguleret i stærkt metastatiske epitelovariecancer (EOC) cellelinjer og metastatiske væv, hvorimod ekspressionen af, EGFR korrelerede positivt med metastase i både EOC patienter og cellelinier. Overekspression af miR-7 markant undertrykt kapacitet celle invasion og migration og resulterede i morfologiske ændringer fra en mesenkymale fænotype til en epitel-lignende fænotype i EOC. Desuden overekspression af MIR-7 opreguleret CK-18 og β-catenin-ekspression og nedreguleret vimentin ekspression, ledsaget med EGFR inhibering og AKT /ERK1 /2-inaktivering. Svarende til MIR-7 transfektion, nedregulering af EGFR med denne siRNA i EOC celler også opreguleres CK-18 og β-catenin-ekspression og nedreguleret Vimentin ekspression og nedsat phosphorylering af både Akt og ERK1 /2, hvilket bekræfter, at EGFR er et mål på miR -7 vende EMT. Den farmakologiske inhibering af PI3K-AKT og ERK1 /2 både signifikant forbedret CK-18 og β-catenin-ekspression og undertrykt vimentin udtryk, der angiver, at AKT og ERK1 /2-veje er påkrævet for MIR-7 mediering EMT. Endelig blev ekspressionen af ​​miR-7 og EGFR i primær EOC med matchede metastase væv udforsket. Det blev vist, at MIR-7 er omvendt korreleret med EGFR. Taget sammen foreslår vores resultater, at MIR-7 inhiberede tumormetastase og vendes EMT gennem AKT og ERK1 /2 pathway inaktivering ved at reducere EGFR i EOC cellelinier. Således kan miR-7 være en potentiel prognostisk markør og terapeutisk mål for kræft i æggestokkene metastaser indgriben

Henvisning:. Zhou X, Hu Y, Dai L, Wang Y, Zhou J, Wang W, et al. (2014) MicroRNA-7 Hæmmer tumormetastaser og Fortryder Epithelial-Mesenchymale Overgang gennem AKT /ERK1 /2 Inaktivering ved målretning EGFR i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (5): e96718. doi: 10,1371 /journal.pone.0096718

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republic Of

Modtaget: 8. december 2013; Accepteret: April 10, 2014; Udgivet: 9. maj 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.072.138), Medicinsk-engineering cross projekt af Shanghai Jiao Tong University (YG2010MS24). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den største årsag til dødsfald fra gynækologiske maligniteter og den 5. hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder i [1] verden. Ifølge National Cancer Institute (NCI) rapport, vil omkring 22280 nye tilfælde blive diagnosticeret med kræft i æggestokkene i Amerika i 2012, og 15500 patienter vil dø af denne sygdom, og 5-årige overlevelsesrate for dem er omkring 30%. Det er blevet spekuleret, at metastase forbliver den førende årsag til tilbagefald og død af kræft i æggestokkene, og alligevel er de molekylære mekanismer, der er forbundet med erhvervelse af metastatisk evne i human ovariecancer er dårligt forstået. Salg

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA på ca. 20-22 nukleotider lang, at funktionen som post-transkriptionelle regulatorer ved at målrette 3′-utranslaterede regioner (UTR) af mRNA’er og forårsager enten inhibering af translation eller nedbrydning af mRNA [2]. MiRNA bidrager til diverse cellulære processer, herunder proliferation, apoptose, invasion og morfogenese [3], [4], [5]. Desuden har en række miRNA blevet identificeret som funktion som klassiske onkogener eller tumorsuppressorgener [6], [7], [8]. MIR-7 er blevet karakteriseret som en tumorsuppressor i adskillige humane cancere. Sig mod en række proto-onkogener, herunder insulin-lignende vækstfaktor-1-receptor (IGF1R) [9] epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) [10], p21-aktiveret kinase 1 (Pak1) og tilhørende cdc42 kinase 1 (ACK1 ) [11]. Det er påvist, at overekspression af MIR-7 inhiberede schwannom cellevækst både i kultur og i xenograft tumormodeller in vivo, hvilket korrelerede med nedregulering af EGFR, Pak1 og ACK1 [11].

Ca. 70% af epitelial kræft i æggestokkene (EOC) udtrykkelig aktiveret EGFR [12]. EGFR overekspression og aktivering resultat i øget proliferation og migration af solide tumorer, herunder ovariecancer [13]. Aktivering af EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren resulterer i aktivering af et antal intracellulære signaler, der kulminerer i ikke bare celleproliferation, men også andre processer, der er afgørende for udviklingen af ​​kræft, herunder cellemigration, angiogenese, metastase, og epithelial-mesenchymal overgang (EMT). Disse begivenheder formidles gennem forskellige downstream mål for EGFR (fx proteinkinase (AKT) og ekstracellulær signal-reguleret kinase 1/2 (ERK1 /2)) [14], [15], [16]. Interessant er det vist, at MIR-7 direkte målrettet EGFR mRNA 3’UTR, og derefter inhiberer ekspression af dets mRNA og protein [17]. Selvom EGFR-signalering er vigtig og godt undersøgt med hensyn til EOC progression, vides der kun lidt om, hvordan MIR-7 mediere EGFR signalering at modulere EOC celle metastase.

I den foreliggende undersøgelse identificerer vi for første gang, at miR -7 spiller en vigtig rolle i EOC metastase. Desuden viser vi, at miR-7 vender EMT gennem AKT /ERK1 /2 inaktivering ved at målrette EGFR i EOC, som giver en ny indsigt i de mekanismer, der ligger metastaser af kræft i æggestokkene.

Materialer og Metoder

patienter og etik

Forbundne prøver af primære epitelial kræft i æggestokkene væv og metastatiske væv (omentum eller bughinde) blev opnået fra patienter med FIGO stadie III-IV avancerede EOC, der havde gennemgået tumor debulking på Renji Hospital, School of medicin, Shanghai Jiao Tong University mellem 2010 og 2012. Blandt disse 17 parrede prøver var snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til senere RNA-ekstraktion, 25 parrede prøver blev fikseret i formalin og paraffin indlejret. Prøver blev klinisk og patologisk vist skal mærkes korrekt. Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Alle kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Materialer

MIR-7 plasmid og negativ kontrol (NC) blev syntetiseret af Shanghai IBS Company. Sekvensen af ​​plasmid og NC er som følger: 5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3 ‘; Negativ kontrol: 5’-GAAATCTACTGCGCGTGGAGAC-3 ‘(IBS selskab). TaqMan kit (Applied Biosystems) specificeret til kvantificering af miRNA blev anvendt til at vurdere ekspressionen af ​​MIR-7 og U6. EGF-receptor Kanin mAb (# 4267), Phospho-EGF-receptor (Tyr992) Kanin mAb (# 2235), Phospho-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) Kanin mAb (# 4370), Phospho-Akt (Ser473 /Thr308), Kanin mAb (# 4060 /# 2965), Akt (pan) Kanin mAb (# 4691), LY294002 (PI3K Kinase Inhibitor) (# 9901), U0126 (MEK1 /2 Inhibitor) (# 9903), Vimentin Kanin mAb (# 5741 ), og β-catenin kanin mAb og E-cadherin kanin mAb (# 3195) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (CST). cytokeratin-18 (CK-18) mAb (T410) pAb (BS1204) blev købt hos Bioworld Technology. P44 /42 MAPK Kanin mAb blev opnået fra Santa Cruz ((sc-33.746)). GAPDH mus mAb blev købt fra ABmart (# M20006). 800CW konjugeret gede-anti-kanin IgG ((926-32.210), stærkt cross adsorberet og 800CW konjugeret gede-anti-muse-IgG (926 til 32.211), var stærkt indlæg adsorberede købt fra Li-Cor Biosciences. EGFR og styring lille interfererende RNA’er (siRNA ) var fra Sanong Biotech.Has-miR-7-LNA afsløring sonde blev købt fra Exiqon (38.485-15).

Cell kultur

HO-8910pm, blev opnået HO-8910 cellelinjer fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), CAOV-3, SKOV3, A2780, A2780 /DDP, og ES-2 celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI-1640) medium (Hyclone) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin (1:100, Sigma) i en fugtig atmosfære inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. Medmindre andet angivet, blev cellerne dyrket til 70-80% konfluens, derpå serum-udsultet natten over i serumfrit RPMI-1640 medium før behandling.

miRNA og siRNA transfektion

80-90% sammenflydende celler blev transficeret med humant mIR-7 plasmid (mIR-7) eller negativ kontrol (NC) og 30-40% konfluente celler blev transficeret med EGFR siRNA eller siRNA-NC ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Totalt RNA blev ekstraheret 24 timer efter transfektion, og totalt celleprotein blev ekstraheret 48 eller 72 timer efter transfektion.

Reverse transcription kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev isoleret ved TRIzol Reagent (Invitrogen ). Modne miR-7 blev omvendt transskriberet med specifikke RT primere, kvantificeres med et TaqMan sonde, og normaliseret ved U6 små nukleare RNA ved hjælp af TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems). mRNA-ekspression analyse blev udført ved kvantitativ PCR under anvendelse af SYBR green farvestof, med relative ændringer beregnet af ΔΔCt metoden. Anvendte primere var som følger: GAPDH-F, 5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3; GAPDH-R, 5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3; EGFR-F, 5-AGCCATGCCCGCATTAGCTC-3; EGFR-R, 5-AAAGGAATGCAACTTCCCAA-3.

Western blotting

Hele celleekstrakter blev fremstillet som tidligere beskrevet [18], og lige store mængder af protein blev separeret med en 8% eller 10% SDS PAGE og elctrotransferred til en PVDF-membran (Millipore). Membranerne blev derefter blokeret i 1 time ved stuetemperatur med Li-Cor blokerende middel (Li-Cor). Med konstant omrystning blev membranerne inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering i 1 time med de passende sekundære antistoffer mærket med 800IRdye. Immunreaktivitet blev detekteret og kvantificeret med den infrarøde Odyssey imaging system (Li-Cor).

Migration assays

Celler (8 × 10

4) blev høstet og resuspenderes i serum- frit RPMI-1640 medium og sættes i de øvre brønde i Boyden kammer (Corning). Mediet indeholdende 10% føtalt bovint serum blev tilsat til det nederste kammer. Efter 8h inkubation blev celler, der forbliver på den øvre overflade af membranerne fjernet, celler, der havde invaderet gennem 8 um porestørrelse membran blev fikseret, farvet og talt under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultaterne blev midlet blandt tre uafhængige forsøg.

Invasion assays

Celler (3 x 10

4) blev anbragt i de øvre kamre belagt med 50 pi Matrigel (1:05 ​​fortynding i serum-frit medium). Medium suppleret med 10% serum blev tilsat til det ydre bæger. Efter 24 timers inkubation blev celler, der forbliver på den øvre overflade af membranerne fjernet, celler, der havde invaderet gennem Matrigel og 8 um porestørrelse membran blev fikseret, farvet og talt under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultaterne blev midlet blandt tre uafhængige forsøg.

Immunhistokemi (IHC) og kromogen in situ hybridisering (CISH)

Immunhistokemi (IHC) blev udført under anvendelse af peberrodsperoxidase (HRP) -polymer anti-muse IHC DAB (diami-nobenzidine) -baseret kit (MaxVision, Fuzhou, Kina), ifølge producentens protokol. Antigen genfinding blev udført under anvendelse boratbuffer (pH = 8), efterfulgt af inkubation i hydrogenperoxid og yderligere blokerende trin. Antistoffer blev anvendt ved 1:50. Den IHC blev undersøgt og filmede med et OLYMPUS BX51 mikroskop (Tokyo, Japan) ved 1:200. Positive signaler blev identificeret ved den intense brune mærkning af deres cellemembraner.

kromogent in situ hybridisering (CISH)

blev udført ved hjælp af Has-miR-7 sonde fra Exiqon (kviksølv LNA afsløring sonde 5′- og 3′-DIG (digoxigenin) -mærkede). Proben blev påvist under anvendelse digoxigenin antistof (Abcam), LSAB2 System-HRP (Dako Danmark A /S, Glostrup, Danmark) og flydende DAB + Substrat kromogen System (Dako) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Den CISH blev undersøgt og filmede med et OLYMPUS BX51 mikroskop (Tokyo, Japan) ved 1:200. Positive hybridiseringssignaler blev identificeret ved den intense brune mærkning af deres celle cytoplasmaer.

Resultatet af IHC og CISH blev uafhængigt scoret af to patologer i en blind måde. Den scoring var baseret på intensiteten og omfanget af farvning og blev vurderet ifølge den følgende histologiske scoring metode. Farvning intensitet blev gradueret som følger: 0, negativ farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; 3, stærk farvning. Den gennemsnitlige andel af farvning celler pr prøve blev bestemt semi-kvantitativt og scorede som følger: 0 til farvning 1%, 1 for 1-25%, 2 for 26-50%, 3 for 51-75%, og 4 for 75% af de undersøgte celler. Den histologiske score (H-score) for hver prøve blev beregnet ved formlen: H-score = andel score × intensitet score. En samlet score på 0-12 blev beregnet og klassificeret som negativ (-, score: 0), svag (+, score: 1-4), moderat (++, score: 5-8) eller stærk (+++, score: 9-12)

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført med SPSS 12.0 statistiske softwarepakke.. I hver in vitro forsøg blev mindst tre brønde /tallerkener anvendes og lignende resultater blev opnået. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange, blev middelværdien af ​​gentagelserne beregnes og denne værdi blev anvendt i den statistiske analyse. Eksperimentelle data er udtrykt som middelværdier med standardafvigelse (SD). Forskellene mellem grupperne blev vurderet ved anvendelse af Students t-test ved sammenligning kun to grupper eller analyseret ved envejs ANOVA med post hoc test, når mere end to grupper blev sammenlignet. Korrelationen mellem EGFR og MIR-7 blev analyseret ved anvendelse Spearmans rank test. Resultaterne af IHC og CISH blev analyseret under anvendelse af Wilcoxon-testen. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved P 0,05, * P 0,05 og ** P. 0,01

Resultater

miR-7-ekspression er omvendt korreleret med EOC metastaser

at udforske udtryk og betydning af miR-7 i EOC metastase, opdaget vi miR-7-ekspression i 17-parrede metastatiske EOC væv og primære EOC væv. Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) viste, at væv fra omentum eller bughinde metastaser udtrykte lavere niveauer af MIR-7 sammenlignet med primære EOC væv, hvilket indikerer et omvendt forhold mellem ekspressionen af ​​MIR-7 og den metastatiske status EOC væv ( Figur 1A). Desuden valgte vi HO-8910 og dens meget metastatiske klon HO-8910pm. HO-8910pm blev etableret, og kendetegnet ved Cell Bank, Chinese Academy of Sciences [19], [20], [21]. Vi fandt, at MIR-7-ekspression blev signifikant reduceret i meget metastatiske klon HO-8910pm sammenlignet med HO-8910 (figur 1B). Tilsammen tyder vore resultater, at nedregulering af MIR-7 er korreleret med øget EOC metastase og at MIR-7 kan undertrykke EOC progression. For at bestemme de optimale cellelinier til yderligere undersøgelse, målt vi ekspressionen af ​​MIR-7 i syv EOC cellelinier (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV-3, CAOV-3 og ES-2) . Vores data viste, at ekspressionen af ​​MIR-7 var lavest i ES-2-cellelinje (P 0,05) (figur 1C), som er en anden EOC celle med højt metastatisk potentiale. Derfor vælger vi HO-8910PM og ES-2 for at studere mekanismerne i miR-7 hæmme metastaser i EOC i de følgende eksperimenter.

(A) Den relative udtryk for miR-7 i 17-parrede EOC væv fra omentum eller bughinde metastaser og primære EOC væv blev påvist ved QRT-PCR. U6 lille nukleare RNA blev anvendt som en intern kontrol og folden ændring blev beregnet af ΔΔCt fremgangsmåden (B) Ekspressionsniveauet af MIR-7, på et par af lave og høje metastatiske EOC cellelinier. (C) Ekspressionsniveauet af MIR-7 i syv EOC cellelinier. (* P. 0,05 ** P 0,01).

miR-7 nedregulerer EGFR i EOC celler

For at opdage den underliggende mekanisme, hvormed miR-7 hæmmer EOC invasion og metastase, søgte vi efter miR-7 mål ved hjælp af f.eks Targetscan og Pictar. Det identificerede 181 kandidat målgener herunder EGFR. Det er påvist, at miR-7 nedregulerer EGFR ved direkte rettet mod EGFR mRNA 3′-UTR [17]. Vi var især interesseret i EGFR på grund af dens positive roller i kræftcellen migration og invasion og dets overekspression i EOC. Vi undersøgte endvidere udtryk og betydning af EGFR i EOC metastaser ved at påvise EGFR protein-ekspression i 17-parrede metastatiske EOC væv og primære EOC væv. Western blotting-analyse viste, at væv fra omentum eller bughinde metastaser udtrykte højere niveauer af EGFR sammenlignet med primær EOC væv, hvilket indikerer en positiv korrelation mellem ekspressionen af ​​EGFR og den metastatiske status EOC væv (figur 2A, fig S1A). I mellemtiden detekteret vi også EGFR-proteinekspression ved western blotting i både HO-8910 og HO-8910pm celler. Vi fandt, at EGFR blev øget betydeligt i meget metastatisk klon HO-8910pm sammenlignet med HO-8910 (figur 2B, figur S1B). Tilsammen vores resultater antyder, at EGFR positivt korreleret med EOC metastase og at EGFR kan fremme EOC progression.

(A) Proteinet ekspression af EGFR i 17-parrede EOC væv fra omentum eller bughinde metastaser og primære EOC væv blev undersøgt ved western blot. (B) Protein ekspression af EGFR i HO-8910 og HO-8910pm cellelinjer blev undersøgt ved Western blotting. (C) Ekspressionsniveauet af MIR-7 i HO-8910pm og ES-2-celler transficeret med MIR-7 eller NC blev analyseret ved QRT-PCR. (D) Ekspressionsniveauet af EGFR-mRNA i HO-8910pm og ES-2-celler transficeret med MIR-7 eller NC blev analyseret ved QRT-PCR. (E) Ekspressionen af ​​EGFR-protein blev analyseret ved Western blotting i HO-8910pm og ES-2-celler transficeret med MIR-7 eller NC, glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol. (* P. 0,05 ** P 0,01).

For at sikre roller miR-7 i regulering af EGFR i EOC-celler, både HO-8910pm og ES-2 celler transficeret med mIR-7 plasmid eller mIR-NC. QRT-PCR viste, at MIR-7-ekspression blev signifikant forøget (figur 2C) henviser EGFR-mRNA-ekspression blev signifikant reduceret (figur 2D) efter MIR-7 transfektion i begge cellelinier. Endvidere Western blotting-analyse viste, at EGFR-protein-ekspression blev signifikant reduceret efter MIR-7 transfektion i begge HO-8910pm og ES-2-celler (figur 2E, fig S1c). Vores resultater tyder på, at miR-7 nedregulerer EGFR i EOC.

miR-7 undertrykker EOC celleinvasion og migration in vitro

For at undersøge om miR-7 regulerer celle invasion og migration i EOC, både HO-8910pm og ES-2-celler blev transficeret med mIR-7 plasmid eller mIR-NC. Transwell migration og invasion assays blev derefter udført. Vi fandt, at transfektion med MIR-7 undertrykte signifikant invasionen af ​​både HO-8910pm celler (figur 3A) og ES-2-celler (figur 3B). Tilsvarende migration kapacitet var også signifikant nedreguleret i både HO-8910pm-MIR-7-celler og ES-2-MIR-7-celler versus HO-8910pm-NC-celler og ES-2-NC-celler (figur 3A, 3B) . Disse resultater indikerer, at MIR-7 deltager i reguleringen af ​​cellemigrering og invasion i EOC.

(A) Transwell migration og invasion-assays under anvendelse af HO-8910pm celler transficeret med MIR-7 eller negativ kontrol (NC). Repræsentative billeder vises til venstre, og kvantificering af 6 tilfældigt udvalgte felter er vist til højre. (B) Transwell migration og invasion-assays under anvendelse af ES-2-celler transficeret med MIR-7 eller NC. Repræsentative billeder vises til venstre, og kvantificering af 6 tilfældigt udvalgte felter er vist til højre. De viste værdier er udtrykt som middel ± SD. (* P. 0,05 ** P 0,01).

Overekspression af miR-7 vender EMT i EOC celle

I EOC-celler, vi observeret, at miR-7 transfektion resulterede i morfologiske ændringer fra en aflang, spindel-formet, mesenkymale fænotype til en mere afrundet, epitel-lignende fænotype, med celler sammenhobning i grupper (figur 4A). Disse ændringer repræsenterer de omvendte processer EMT, hvilket er en vigtig grund til epitelcancer at få mulighed for invasion og metastase. Endvidere undersøgte vi protein ekspression af de epiteliale markører E-cadherin, CK-18 og β-catenin, samt mesenkymale markør vimentin ved Western blotting. Selv om der var ingen E-cadherin-ekspression i begge cellelinier, selv efter MIR-7 transfektion, CK-18 og β-catenin-ekspression steget dramatisk, hvorimod vimentin ekspression faldt i både HO-8910pm og ES-2-celler efter MIR-7 transfektion ( Figur 4B, fig S2). Vores data tyder på, at overekspression af miR-7 vender EMT i EOC-cellelinjer.

(A) Fase kontrast billeder af ES-2-celler inficeret med miR-7 eller NC. (B) Protein ekspression af E-cadherin, CK-18, β-catenin og vimentin i HO-8910pm og ES-2-celler transficeret med MIR-7 eller NC blev undersøgt ved western blotting, blev GAPDH anvendt som en intern kontrol. (* P. 0,05 ** P 0,01).

Luciferase reporter analyser

For at forstå den molekylære mekanisme, hvormed miR-7 undertrykke EOC invasion og metastase, vi brugte forskellige beregningsmetoder for at søge efter miR-7 mål, såsom Targetsan og pictar. Disse fremgangsmåder fundet 181 mulige kandidatgener. Vi var især interesseret i EGFR på grund af dens positive roller i kræftcelle invasion. Analyse af 3′-UTR-sekvensen af ​​EGFR identificeret tre mulige bindingssteder for MIR-7. For at bestemme om EGFR er direkte mål for MIR-7, konstruerede vi dens 3′-UTR-fragmenter, hvori vildtype og mutant bindingssteder blev indsat i regionen immediatedly nedstrøms for reportergenet (figur 5A), viste luciferase reporter assays at mIR-7 transfektion forårsaget en bemærkelsesværdig nedgang i luciferaseaktivitet som indeholdt vildtype-3′-UTR-fragmenter bindingssteder (figur 5B).

(a) Diagram af EGFR 3’UTR reporter konstrukt. (B) Den vildtype eller mutant reporter plasmider blev cotransficeret med MIR-7 eller NC i ES-2. (* P. 0,05 ** P 0,01).

miR-7 undertrykker AKT og ERK1 /2-aktivering afhængig af sin EGFR hæmning i EOC celler

Tidligere undersøgelser viste at EGFR regulerer AKT og ERK1 /2-aktivitet i ovariecancer [15], [22]. Fordi MIR-7 kan slå-transkriptionelt inhibere ekspressionen af ​​EGFR, vi hypotese, at MIR-7 regulerer AKT og ERK1 /2-aktivering. For at undersøge virkningen af ​​MIR-7 på AKT og ERK1 /2, transficerede vi HO-8910pm og ES-2-celler med MIR-7 plasmid eller MIR-NC, og derefter undersøgt phosphorylering af AKT og ERK1 /2 ved western blotting. Transfektion med MIR-7 undertrykt phosphorylering af AKT på Ser473 og ERK1 /2 ved Thr202 /Tyr204 imidlertid MIR-7 ændrede ikke signifikant AKT-phosphorylering ved Thr308 (figur 6A). Siden aktivering af EGFR spiller vigtig rolle i metastasen af ​​mange cancere, vi har registreret også sin phosphoryleringsstatus efter MIR-7 transfektion i HO-8910pm og ES-2-celler. Men i vores studier, var der ingen EGFR phosphorylering før og efter MIR-7 transfektion, hvorimod MIR-7 transfektion har forhindret total EGFR proteinekspression (figur 6A, Fig S3 (A-C)). Som bevis på, at MIR-7 har mange målgener, søgte vi at bestemme, om MIR-7 medieret AKT og ERK1 /2-aktivering er afhængig af dens EGFR inhibition. HO-8910pm og ES-2-celler blev transficeret med EGFR siRNA eller den negative kontrol. Vi viste, at silencing af EGFR med denne siRNA i ovariecancerceller faldt phosphorylering af AKT ved Ser473 og ERK1 /2 ved Thr202 /Tyr204 på Western blotting, men der var ingen signifikant ændring i phosphorylering af AKT på Thr308 (figur 6B, Fig S3 ( DE)).

(A) HO-8910pm og ES-2-celler blev transficeret med mIR-7 eller NC, EGFR, AKT og ERK1 /2 phosphorylering blev analyseret ved western blotting. (B) HO-8910pm og ES-2-celler blev transficeret med EGFR siRNA eller NC, EGFR, AKT og ERK1 /2 phosphorylering blev analyseret ved western blotting. (* P. 0,05 ** P 0,01).

miR-7 vender EMT gennem EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2 vej

For at afgøre, om EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2 signalveje var involveret i tilbageførslen af ​​EMT af miR-7, vi transficeret EGFR siRNA ind HO-8910pm og ES-2-celler og derefter undersøge protein ekspressionen af ​​E-cadherin, CK-18, β catenin og vimentin ved western blotting. Vi fandt, at der var ingen E-cadherin ekspression før og efter EGFR siRNA transfektion i begge cellelinier, men CK-18 og β-catenin-ekspression steget dramatisk, hvorimod vimentin ekspression faldt i både HO-8910pm og ES-2-celler efter EGFR siRNA transfektion (figur 7A, fig S4 (AC)). Derefter anvendte vi PI3K /AKT-inhibitor LY294002 og ERK1 /2-inhibitoren U0126 specifikt blokere Akt og ERK1 /2-veje hhv. Som forventet, PI3K /AKT-inhibitor LY294002 inhiberede AKT phosphorylering, mens ERK1 /2-inhibitor U 0126 inhiberede ERK1 /2 phosphorylering i HO-8910pm og ES-2 celler (figur 7B, FigureS4 (D-G)). Endvidere både AKT og ERK1 /2-inhibitorer forøget CK-18 og β-catenin-ekspression og undertrykt vimentin ekspression i HO-8910pm og ES-2 celler (figur 7C og fig S4 (H-M)). Vores data viste inddragelse af EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2-veje i miR-7 vendt EMT i æggestokkene cancerceller.

(A) HO-8910pm og ES-2-celler blev transficeret med EGFR siRNA eller NC proteinet ekspression af E-cadherin, CK-18, β-catenin og vimentin blev undersøgt ved western blotting. (B) HO-8910pm og ES-2 celler blev behandlet med LY294002 (20 pmol /l) eller U0126 (10 pmol /l), AKT og ERK1 /2 phosphorylering blev analyseret ved western blotting. (C) HO-8910pm og ES-2 celler blev behandlet med LY294002 (20 pmol /l) eller U0126 (10 pmol /l), proteinet ekspression af CK-18, blev β-catenin og vimentin udforskes ved western blotting. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol (* P. 0,05 ** P 0,01).

miR-7 og EGFR er omvendt udtrykt i EOC primære og metastase væv

Vi brugte CISH og IHC at detektere ekspressionen af ​​mIR-7 og EGFR i samme type væv. Vi afgjort, om miR-7-ekspression var forbundet med EGFR i EOC tissuses. Vævet indeholdt 25 par af primære EOC væv og deres matchede metastatiske væv. Den CISH analyse viste en åbenlys reduktion af MIR-7 i de metastatiske væv sammenlignet med deres tilsvarende primære EOC væv (figur 8A, tabel 1). Derimod IHC Resultaterne viste, at EGFR var højere i metastatiske væv end i primære EOC væv (figur 8B, tabel 2). Desuden viste statistisk analyse, at EGFR omvendt var korreleret med miR-7-ekspression (tabel 3).

(A) Ekspression af miR-7 i primær EOC og dens matchede metastatisk væv ved CISH. (B) Ekspression af EGFR i primær EOC og dens matchede metastatisk væv ved IHC. (* P. 0,05 ** P 0,01). Vejviser

Diskussion

miRNA er dukket op som kritiske regulatorer af carcinogenese og ondartet progression af kræft ved målretning onkogener og tumorsuppressorgener [23], [24]. Det er blevet impliceret som MIR-7 inhiberer tumorinvasion og metastase i glioblastom, schwannom, lungecancer, brystcancer og mange andre cancerformer [25], [26], [27]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi den biologiske rolle MIR-7 i human EOC metastase. Vi fandt, at MIR-7 blev nedreguleret i metastatisk epitelial ovariecancer (EOC) væv sammenlignet med primære EOC væv. MIR-7-ekspression blev også signifikant reduceret i meget metastatiske klon HO-8910pm sammenlignet med HO-8910. Desuden viste vi, at ekspressionen af ​​MIR-7 var lavest i ES-2-cellelinien, som er en anden EOC celle med højt metastatisk potentiale blandt syv EOC cellelinier (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV -3, CAOV-3 og ES-2). Derfor er vores resultater viste, at MIR-7-ekspression er omvendt korreleret med EOC metastase.

Interessant hver miRNA kan potentielt regulere hundredvis af gener på post-transkriptionelle niveau ved at binde til de specifikke sekvenser i target mRNA molekyler baseret på ‘ufuldkommen komplementaritet «. Det er blevet vist, at overekspression af MIR-7 inhiberede tumor invasion og metastase ved at målrette insulin-lignende vækstfaktor-1-receptor (IGF-1R) i gastrisk cancer [9]. MIR-7 er også blevet rapporteret at målrette FAK i brystcancerceller [28]. I de seneste år, montering data viser, at EGFR er en direkte og funktionel mål for miR-7 [10], [17]. Receptortyrosinkinase af EGFR familien regulerer essentielle cellefunktioner, herunder proliferation, overlevelse, migration og differentiering. Offentliggjorte data viser, at EGFR spiller en vigtig rolle i tumorudvikling [12], [27]. I denne undersøgelse fandt vi, at væv fra omentum eller bughinde metastaser udtrykte højere niveauer af EGFR sammenlignet med primære EOC væv. I mellemtiden fandt vi, at EGFR blev opreguleret i stærkt metastatisk klon HO-8910pm sammenlignet med HO-8910. Disse resultater tyder på, at EGFR er tæt forbundet med kræft i æggestokkene metastaser. Vores tidligere undersøgelser viste også, at EGFR overekspression og aktivering resultat i øget metastaser af humane ovariecancerceller [18], [29]. Imidlertid ingen undersøgelse udført for at bestemme, om MIR-7 målretter EGFR at modulere adfærd EOC metastase. Her viste vi, at både EGFR mRNA og EGFR proteinekspression blev signifikant reduceret efter miR-7 transfektion i EOC cellelinjer. Vi identificerede efterfølgende, at både invasion og migration kapacitet var signifikant nedreguleret efter miR-7 transfektion i EOC in vitro. Vores nuværende eksperimentelle resultater bekræftet for første gang, at miR-7 undertrykt EOC celle invasion og migration. Tilsammen vores resultater viser, at MIR-7 undertrykker celleinvasion og migration i det mindste delvis, ved direkte målretning af EGFR i EOC.

EMT henviser til en biologisk proces, som epitelcellerne transformeres til mesenchymalceller gennem