PLoS ONE: Adenovira Brug af Cancer Marker EphA2 som receptor in vitro og in vivo ved genetiske Ligand Insertion i forskellige capsid Stilladser

Abstrakt

Adenoviral genterapi og onkolyse ville kritisk gavn af målrettet celle post ved genmodificerede capsider. Det kræver både ablation af indfødte adenovirus tropisme og identifikation af ligander, der forbliver funktionel i virus sammenhæng. Her, vi etablerer celletype-specifik optagelse af HAdV-5-baserede vektorer ved genetisk ligand indsættelse i et kimært fiber med aksel og knop domæner af den korte HAdV-41 fiber (Ad5T /41sSK). Denne fiber format blev rapporteret at ablatere transduktion

in vitro

og biofordeling til leveren

in vivo

. Vi viser, at YSA peptid, der binder til den pan-cancer markør EphA2, kan indsættes i tre positioner af det kimære fiber, hvilket resulterer i stærk transduktion af EphA2-positive, men ikke EphA2-negative celler af humant melanom biopsier og tumorxenoplantater efter intratumoral injektion. Transduktion blev blokeret af opløseligt YSA peptid og restaureret for EphA2-negative celler efter rekombinant EphA2-ekspression. Den YSA peptid kunne også indsættes i tre positioner af en CAR binding-ablerede HAdV-5 fiber muliggør specifik transduktion; dog Ad5T /41sSK format var overlegne

in vivo

. Afslutningsvis vi etablere en adenovirus kapsid letter funktionel indsættelse af målretning peptider og en roman adenovirus ved hjælp af tumormarkør EphA2 som receptor med stort potentiale for kræft genterapi og viral onkolyse

Henvisning:. Behr M, Kaufmann JK, Ketzer P, Engelhardt S, Mück-Häusl M, Okun PM, et al. (2014) adenovira Brug af Cancer Marker EphA2 som receptor in vitro og in vivo ved genetiske Ligand insertion i Different capsid Stilladser. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10,1371 /journal.pone.0095723

Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA

Modtaget: December 3, 2013; Accepteret: 30 Marts 2014; Udgivet 23. april, 2014

Copyright: © 2014 Behr et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Helmholtz-University Young Investigator Group tilskud VH NG 212 og Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid) giver 10-7946. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

rekombinante adenovirus (Ads) er i præklinisk og klinisk udvikling som onkolytiske midler og vektorer til vaccination og genterapi [1], [2] .uch Ad-baserede lægemidler kan betydeligt gavn af eller endda afhænge en celletype-specifik virkningsmekanisme for at begrænse bivirkninger, og samtidig bevare terapeutisk virkning. Celletype-specificitet af Ad-baserede vektorer og oncolytiske midler er blevet godt etableret på det post-entry level ved transkriptionel målretning og microRNA regulering [3], [4] .I modsætning målretning af Ad post cellen, som bedre ville undgå bivirkninger og virus beslaglæggelse, er fortsat en udfordring. Genetiske strategier for Ad post targeting lette simpel produktion klinisk bedømmelse (ingen kemiske modifikationer eller separate adaptere er påkrævet) og sikre, at afkom onkolytiske annoncer produceret i patienternes tumorer fastholde de forbedrede egenskaber. Dog er strategier for genetisk indgang målretning af annoncer hæmmet af den stive Ad kapsid struktur, manglende evne til antistofmolekyler, som foretrukne dele rettet mod, at folde korrekt efter fusion til cytosolisk udtrykt Ad kapsidproteiner, og de komplekse vekselvirkninger værtsfaktorer modulerende Ad celle post i patienter (se nedenfor)

indtastning målretning af annoncer kræver to trin:. ablation af indfødte tropisme for raske celler og re-targeting af en receptor specifikt udtrykt på målceller ved indsættelse af en tilsvarende ligand ind i Ad capsid. Celleindtrængen af ​​indbyggede annoncer initieres ved binding af capsidprotein fiber til fastgørelse receptoren, som er Coxsackie-Ad receptor (CAR) for den mest anvendte serotype HAdV-5 [5] .Virus internalisering derefter udløses ved binding af penton basen til cellulære integriner [6] .Ved terapeutiske anvendelser af annoncer ikke beregnet til at målrette levervæv, lever de-targeting er af afgørende betydning for at undgå toksiske bivirkninger. Men ablation CAR binding ved at mutere fiber reducerede ikke lever transduktion efter systemisk virus injektion [7] .Additional sletning af integrin binding ved at mutere penton basen resulterede i nedsat lever- transduktion i nogle, men ikke alle undersøgelser [7] .Moreover, penton base-mutationer kan være kontraproduktiv i forbindelse med Ad målretning, som trin på re-målrettede vira virus indrejse og post-entry kan kompromitteres [8] .Liver transduktion af HAdV-5, uanset deres interaktion med CAR og integriner, blev tilskrevet blod koagulationsfaktorer bundet til hexon- og fiber [9] – [11] .der receptor medierer transduktion af hepatocytter ved HAdV-5

in vivo

drøftes fortsat [12], [13]

.

Vores tilgang til indtastning målretning af HAdV-5-afledte vira er at erstatte de fiber aksel og knop domæner med de tilsvarende domæner af HAdV-41 korte fibre (Ad5T /41sSK) og at indsætte peptidligander i dette kimære capsid. HAdV-41 binder CAR via en anden lange fibre, mens ingen cellebindende aktivitet er blevet tilskrevet den korte fibre. Tilsvarende stærkt reduceret transduktion

in vitro

og lever transduktion

in vivo

er blevet påvist af flere grupper for HAdV-5-baserede vektorer indeholdende korte fibre af HAdV-41 eller den nært beslægtede HAdV -40 [14] – [19] .Vi har tidligere påvist, at infektiviteten af ​​annoncer med kimære Ad5T /41sSK fiber (herefter betegnet F5 /41s) kan gendannes ved genetisk peptidligand insertion ved hjælp af integrin bindende RGD4C-peptid som model peptid [14] .I virkeligheden, vi identificeret en række funktionelle insertionssteder og dermed skaber den kimære Ad5T /41sSK fiber som en fleksibel fiber stillads for ligand indsættelse: HI og EG sløjfer på siden af ​​knappen og for IJ loop på toppen , hvilket resulterer i overlegen transduktionseffektivitet forhold til C-terminale fusioner. Men som integriner er allestedsnærværende udtrykt, at RGD4C peptid var ikke egnet til at demonstrere potentialet i den Ad5T /41sSK format til celletype-specifik indgang celle og transduktion. Derfor er formålet med den foreliggende undersøgelse var at etablere celleindtastning målretning af Ad5T /41sSK strategi under anvendelse af en celle-selektive peptidligand og til sammenligning af denne strategi med en HAdV-5 fiberbaserede målretning tilgang.

YSA peptid, et 12-mer identificeret ved fagvisning, binder selektivt til receptortyrosinkinase EphA2, men ikke til relaterede kinaser [20] .Vi fokuserede vores undersøgelse af dette peptidliganden fordi i modsætning til adskillige andre testede peptider det tilbageholdte celle- bindingsaktivitet i forbindelse med Ad fiber. Vigtigt er EphA2 stadig større opmærksomhed som mål for cancerterapi, fordi det er (i) opreguleres på de fleste solide tumorer og på tumorendotel, (ii) bedre tilgængelig på tumorer, der ofte mangler celleassocierede ligander, (iii) funktionelt associeret med tumor progression, og (iv) blev for nylig rapporteret at være en kræft stamcelle markør [21], [22] .Several EphA2 målrettet terapeutiske modaliteter har vist proof of concept i prækliniske studier, herunder kinase hæmmere, antistoffer, immunotoksiner, manipuleret T-celler, opløselige receptorer, og vacciner [22] – [24].

Her undersøgte vi Ad post målretning

in vitro

in vivo

ved genetisk indsætte EphA2-bindende YSA peptid i forskellige receptor-blind Ad fiber stilladser. Specifikt vi undersøgt sites for funktionel YSA peptid indsættelse i knop domæner af den korte HAdV-41 fiber og HAdV-5 fiber. Ud over virus produktion ved kombineret fiber transfektion /virus superinfektion som vi har gjort før [14] undersøgte vi direkte manipulation af fiber gener i virus genomer, hvilket er en fordel eller kræves for at lette virus produktion og for viral onkolyse henholdsvis . Selektivitet og effektivitet af Ad indgangscellen medieret af YSA peptid blev undersøgt i cellekultur, humane metastaser biopsier, og animalske xenograftmodeller sammenligner tre fiber formater: (i) det kimære Ad5T /41sSK fiber, (ii) en længe shafted kimære fiber indeholder HAdV-5 fiber hale den og akslen domæner, og den korte HAdV-41 fiber knop, og (iii) en længe snydt, men CAR-bindende poleres HAdV-5 fiber.

Resultater

specifik transduktion af EphA2-positive celler ved annoncer med YSA peptid indsat i kimære fibre, der indeholder knappen for HAdV-41 kort fiber

Vi undersøgte post målretning af annoncer ved genetisk indsættelse af en målrettet peptid i kimære fibre med HAdV -41 knop som en de-målrettet stillads. Til dette formål har vi indsat 12-mer EphA2-bindende peptid YSA [20] flankeret af korte linkere i HI, IJ eller EG loops af denne knop domæne. At udforske relevansen af ​​akslen længde på YSA-medieret Ad transduktion, vi kombineret disse YSA-holdige drejeknapper med den korte HAdV-41 fiber aksel (Ad5T /41sSK virus, fig. 1A) eller den lange HAdV-5 fiber aksel (Ad5TS /41sK vira, fig. 1B). I et tredje sæt af fibre, vi indarbejdet en lang HAdV-5 fiber aksel med et muteret heparinsulfatproteoglycan (HSPG) -bindende motiv (Ad5TS * /41sK virus, Fig. 1C). Denne mutation blev rapporteret at give forbedret de-targeting [17], [25], [26] .Efter plasmidtransfektion blev alle konstruktioner udtrykt og besad trimerisation kapacitet, men trimerisation var tydeligvis mindre effektiv til de lange-shafted konstruktioner, især dem indeholdende peptidet i HI sløjfe (fig. 2A). Ved hjælp af en kombineret transfektion /superinfektion protokollen (se materialer og metoder), var vi i stand til at producere høj titer pseudotype LacZ reporter Ad vektorer med alle fibre formater. Inkorporering af fiber molekyler i viruspartikler var effektiv på kort-shafted fiber og trods reduceret trimerisering kapacitet, til de lange-shafted IJ-Ysa fibre (Fig. 2B). Lange-shafted EG-Ysa og HI-Ysa fibre viste reduceret eller manglede inkorporering fiber i viruspartikler, henholdsvis.

(A) Short-shafted kimære fibre med HAdV-5 hale fusioneret til skaftet og grebet af den HAdV-41 korte fibre. (B, C) Lange-shafted kimære fibre indeholdende HAdV-5 hale og vildtype (B) eller mutant (C) aksel fusioneret til HAdV-41 kort fiber knop. (D) CAR binding-ablateret HAdV-5 fibre. Ysa peptid insertionssteder er angivet med løkker. Insertion af linkersekvensen i forskellige positioner af HAdV-5 fiber knop IJ loop resulterede i tab af trimerisering kapacitet (data ikke vist) og vira blev ikke produceret til denne insertion site.

(A) immunblot af ukogte cellelysater efter transient transfektion af fiber ekspressionsplasmider ind 293T-celler. (B) Immunoblot af oprensede viruspartikler af pseudotype LacZ reporter vira genereret af transfektion /superinfektion protokol. (C) transduktion af EphA2-positive og EphA2-negative celler med pseudotype LacZ reporter vira. SK-MEL-28-celler blev transduceret i firdobbelte, alle andre cellelinier transduceres i triplikater. Kolonner og fejllinjer viser middelværdier og standardafvigelser af β-Gal-aktivitet, hhv. RLU, relative luminescensenheder; * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 versus 5T41sSK i den respektive cellelinje

Næste, vi analyserede EphA2-ekspression i et panel af bugspytkirtelkræftceller, melanom celler , endothelceller og en hepatisk cellelinie. Vi har registreret stærk EphA2-ekspression for bugspytkirtelkræftceller, endotelceller, og i 4 ud af 6 melanoma cellekulturer (fig. S1). EphA2 blev ikke påvist for de to melanomcellelinier SK-MEL-28 og Mel624 og den hepatiske HepG2. Transduktion eksperimenter med EphA2-positive cellelinier Panc-1, MIA PaCa-2, Capan-1 (kræft i bugspytkirtlen) og C8161 (melanom) gav resultater, der var ens for de respektive cellelinier: Alle tre vira pseudotypet med kort snydt YSA fibre viste transduktion, som var væsentligt stærkere end for kontrol- vira uden YSA peptid (figur 2C;. 10 gange til 35 gange stigning i β-Gal-aktivitet). For vira med umodificeret HAdV-5 skaft, indsætning af YSA i HI, IJ og EG løkker viste svag, stærk, og mellemliggende transduktionseffektivitet hhv. Den længe snydt IJ-YSA virus var endda bedre end de korte-shafted virus (p 0,05 for alle cellelinjer.). For alle vira med det muterede langt skaft, observerede vi ineffektiv transduktion (vist i Panc-1 og C8161 celler). I EphA2-negative SK-MEL-28 celler, EG-YSA virus og især IJ-YSA virus med umodificeret langt skaft viste transduktion signifikant højere end kontrol virus. Vi konkluderer, at korte-shafted Ad5T /41sSK vira med YSA peptid indsat i EG, HI eller IJ løkke selektivt transducere EphA2-positive tumorceller, mens de lange shafted Ad5TS /41sK-IJ-YSA virus viste endnu stærkere, men mindre selektiv transduktion .

Dernæst undersøgte vi, hvordan transduktionseffektiviteten af ​​pseudotype Ysa vira sammenligner med vira indeholdende den etablerede, integrin-binding RGD peptid i tumor og endotelceller. De fleste tidligere undersøgelser om genetisk peptidliganddomæne indsættelse brugte RGD-holdige peptider og demonstrerede forbedret, men ikke målrettet celleindtastning [27] – [29] .Indeed, HAdV-5 virus med RGD peptid i HI sløjfen bliver undersøgt i kliniske studier, på grund af deres forbedrede indgangscellen effektivitet [30] .Vi fandt, at i forbindelse med Ad5T /41sSK kimære fiber YSA peptid-medieret transduktion af EphA2-positive celler var den samme eller bedre end transduktion formidlet af RGD4C peptid indsat i HI løkke (fig. 3A og B), den mest effektive insertionssted for dette peptid [14] .I EphA2-negative SK-MEL-28-celler, kun RGD virus resulterede i transduktion signifikant højere end kontrollen virus uden peptid. Endelig kunne vi vise, at transduktion af EphA2-positive celler ved Ad5T /41sSK-HI-YSA og Ad5T /41sSK-IJ-YSA men ikke Ad5T /41sSK-HI-RGD effektivt blokeret af opløseligt YSA peptid, mens en kontrolgruppe peptid med randomiseret sekvens blokerede ikke transduktion (fig. 3B). Samlet viser disse resultater potent YSA-medieret transduktion specifikt for EphA2-positive celler ved annoncer med YSA peptid indsat i det kimære Ad5T /41sSK fiber.

(A) transduktion af EphA2-positive og EphA2-negative celler ved pseudotype Ad-vektorer indeholdende korte-shafted kimære fibre med genetisk indsætning af YSA peptid i sammenligning med matchende vektorer med genetisk indsætning af RGD4C peptid. Celler blev transduceret i firdobbelte. (B) transduktion af EphA2-positive PANC-1-celler efter konkurrence med opløseligt YSA peptid eller med kontrol peptid med randomiseret sekvens. Cellerne blev transduceret med pseudotype annoncer tredobbelt. Kolonner og fejllinjer viser middelværdier og standardafvigelser af β-Gal-aktivitet, hhv. RLU, relative luminescensenheder; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01 *** p. 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5T /41sSK-HI-RGD (

#)

specifik transduktion af EphA2-positive celler ved annoncer med YSA peptid indsat i CAR binding-poleres HAdV-5 fiber

for specifikke anvendelser, f.eks dem, der kræver tumor-specifikke genoverførsel, men ikke lever de-targeting (se diskussionen), Annoncer med en HAdV-5-baseret fiber kan være tilstrækkelig eller fordelagtig i forhold til mere udførligt modificerede kimære fiberholdige virus. Af denne grund og for at sammenligne vores kimære fiber-format med den indfødte ene, undersøgt, hvilke vi insertionssteder muliggøre genetiske inkorporering af YSA peptid ind i bilen binding-poleres HAdV-5 fiber knop KO1 (S408E og P409A mutationer, Ref [31], fig. 1D). Vi fandt, at YSA peptidet kan indsættes i CD, EG og HI løkker af fiberen holde- trimerisation kapacitet (noget mindre effektiv for cd sløjfe) og inkorporering funktionalitet i viruspartikler genereret af transfektion /superinfektion Protocol (fig. 4A og B). Vi udforskede også IJ loop som en mulig position for peptidligand insertion overvejer den gunstige placering på toppen af ​​knappen domæne. Men vi observeret tab af fiber trimerisation efter indsættelse af en linker på positioner G560 /H561 eller I564 /N565 (ikke vist). Pseudotype annoncer med YSA peptid indsat i EG, HI eller CD løkke af KO1 knop medierede effektiv transduktion af EphA2-positive celler, som var 8 gange til 230 gange bedre end kontrollen virus Ad5KO1 uden peptid insertion (Fig. 4C ). Den Ad5KO-HI-YSA virus var mere effektive end de Ad5KO-EG-Ysa og Ad5KO-CD-Ysa vira i alle testede samt overlegen til Ad5T /41sSK-EG-YSA cellelinier. Endvidere Ad5KO-HI-YSA virus udviste tilsvarende eller overlegne transduktionseffektivitet forhold til Ad5WT virus, der indeholdt vildtype-HAdV-5 fiber. I EphA2-negative celler, ingen af ​​virus med YSA peptid indsat i KO1 fiber forøget transduktionseffektivitet sammenlignet med den parentale virus (fig. 4C), hvilket viser en mangel på off-target transduktion. Afslutningsvis transduktionseffektiviteten af ​​annoncer med YSA peptid indsættelse i HAdV-5 fiber afhænger indsættelsesstedet med HI insertion viser den bedste transduktion effektivitet og specificitet.

(A) Immunoblot af ukogte cellelysater efter transient transfektion af fiber ekspressionsplasmider ind 293T-celler. (B) Immunoblot af oprensede viruspartikler af pseudotype LacZ reporter vira. (C) transduktion af EphA2-positive og EphA2-negative celler med pseudotype LacZ reporter vira. Celler blev transduceret i firdobbelte, søjler og fejlsøjler viser middelværdier og standardafvigelser af β-Gal-aktivitet, hhv. RLU, relative luminescensenheder; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (

#) .

EphA2-medieret transduktion af tumor og endotelceller ved genomisk fiber-modificerede annoncer

Vi næste udviklede EphA2-målrettede vira med modificerede fibre kodet af deres genom i stedet pseudotypet ved transfektion . Genomisk modificerede virus ville forenkle fremstillingsprocesser og lette skala produktion af virus store. Også, genomisk fiberoplægget kræves i forbindelse med viral onkolyse. Det er imidlertid ikke klart, hvordan genomisk fiber udskiftning påvirker produktionen af ​​infektiøse vira. Faktisk er en tidligere undersøgelse rapporteret vækstdefekter og /eller defekte partikler til Ad-vektorer med det native fiber genet erstattet med et gen der koder for hele korte HAdV-41 fiber med peptid insertioner [32] .Using BAC recombineering teknologi, vi klonet seks genomer af første generation GFP /Luc reporter vira. I tre genomer den HAdV-5 fiber blev erstattet af en YSA-holdige fiber repræsenterer hver af de fiber-formater (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-Ysa og Ad5KO1-HI-Ysa). De andre tre genomer repræsenterede kontrol- virus Ad5T /41sSK, Ad5wt, og Ad5KO1. Alle vira kunne produceres ved høj titer og viste effektiv fiber inkorporering (fig. 5A). Resultater af transduktion eksperimenter med disse genetisk modificerede vira reproduceres dem opnået med pseudotype vira produceret af transfektion /superinfektion protokol, hvilket viser, at genomisk fiberoplægget lykkedes (Fig 5B-D.): I EphA2-positive bugspytkirtelkræftceller, melanomceller og endotel celler, vi igen observeret en dramatisk stigning i transduktionseffektivitet for YSA-holdige vira sammenlignet med receptor-blind kontrol vira (15-fold til 236-fold). Insertion af YSA peptidet i KO1 fiber resulterede i den største stigning i transduktionseffektivitet. IJ-YSA fiber kimære virus med langt skaft var igen noget stærkere end de matchende virus med en kort skaft. Af note, Ysa vira resulterede i stærkere transduktion selv sammenlignet med virus indeholdende vildtype HAdV-5 fiber i EphA2-positive celler. Dette var tilfældet, ikke kun for celler svagt transduceret med virus, der indeholder HAdV-5 fiber, dvs. C8161 celler (36 gange til 220 gange), men også i EphA2- og CAR-positive [33], [34] celler MIA PaCa-2, PANC-1 og HUVEC. I EphA2-negative SK-MEL-28 og HepG2-celler, Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA viste ingen signifikant stigning i transduktion effektivitet sammenlignet med de respektive kontroller uden peptid indsættelse, mens Ad5TS /41sK-IJ-YSA igen viste noget forøget transduktion. Visualisering af GFP-ekspression bekræftet, at annoncer med YSA peptid resulterede i transduktion af markant øgede procentdele af EphA2-positive celler sammenlignet med kontrol virus uden peptid og også sammenlignet med Ad5wt (fig. S2). I EphA2-negative celler, transduktion effektivitet som bestemt ved denne GFP-baserede udlæsning var stærkt reduceret til Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK og Ad5KO1 i forhold til Ad5wt, men i mindre grad for Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Disse resultater bekræfter, at Ad5T /41sSK-IJ-Ysa og Ad5KO1-HI-Ysa virus har det bedste bidrag kapacitet til EphA2-positive celler målretning. Af note, transduktion af SK-MEL-28-celler ved Ysa virus, men ikke af kontrol-vira uden peptid indsættelse kunne genoprettes ved overekspression af rekombinant EphA2 (fig. 6, fig. S3), hvilket viser, at EphA2 medierer celle optagelse af YSA peptid- indeholdende vira.

(A) Immunoblot af oprensede viruspartikler genereret af genomisk insertion af rekombinante fibre. (B-D) transduktion af EphA2-positive cancerceller (B), EphA2-negative celler (C) og EphA2-positive endotelceller (D) med genomisk fiber-modificeret Luc /GFP reporter vira. C8161-celler blev transduceret in triplo, blev alle andre cellelinier transduceres i firdobbelte. Kolonner og fejllinjer viser middelværdier og standardafvigelser af Luc udtryk, hhv. RLU, relative luminescensenheder; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (

#) .

SK-MEL-28 celler transficeret med EphA2-ekspression plasmid (pcDNA-EphA2) eller kontrol plasmid (pcDNA) blev transduceret med genomisk fiber-modificeret Luc /GFP reporter vira. Celler blev transduceret i firdobbelte, søjler og fejlsøjler viser middelværdier og standardafvigelser af Luc-ekspression hhv. RLU, relative luminescensenheder; ** P 0,01, *** p 0,001 for angivne sammenligninger. Til påvisning af EphA2-ekspression af transficerede celler se fig. S3.

YSA peptid-medieret adenoviral transduktion af kræft i bugspytkirtlen og melanom implanteret

in vivo

Produktion af høj titer præparater af genomisk capsid-modificerede virus tilladt os at udføre dyreforsøg at udforske YSA peptid-medieret adenoviral transduktion

in vivo

. Til dette formål anvendte vi NOD-SCID-mus med subkutane xenograft tumorer af PANC-1 pankreatiske cancerceller eller C8161 melanomceller. EphA2-ekspression

in vivo

blev verificeret i begge tumormodeller (fig. S4). I et første eksperiment, vi injicerede dyr bærer PANC-1 eller C8161 tumorer intratumoralt (i.t.) med Ad5T /41sSK-IJ-YSA eller Ad5T /41sSK (fig. 7A). I begge tumormodeller observerede vi væsentligt stærkere transduktion med Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2,9-fold for PANC-1 og 5,9 gange for C8161), hvilket viser, at YSA-peptid-medieret transduktion er funktionel

in vivo

. I et andet forsøg injiceres vi C8161 tumorer i.t. med YSA-holdige annoncer, der repræsenterer hver af fiber-formater (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA) eller med kontrol-vira (fig. 7B). Øget transduktion til Ad5T /41sSK-IJ-YSA versus Ad5T /41sSK blev bekræftet. Ad5TS /41sK-IJ-YSA viste noget højere transduktion end Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Disse resultater er i overensstemmelse med de

in vitro

transduktion resultater. Men i modsætning til den

in vitro

data Ad5KO1 viste, lignende transduktion effektivitet end Ad5wt efter i.t. injektion i C8161 xenografter afslører tab af de-targeting. Følgelig stigningen i transduktion af YSA peptidinsertion var mindre (1,6 gange), men nåede signifikans. Derfor de- og re-målretning af annoncer til specifik indrejse via EphA2 efter i.t. injektion

in vivo

var bedst gennemføres med Ad5T /41sSK fiber-format. Samlet viser disse resultater, at peptid-medieret entry målretning ved hjælp af Ad5T /41sSK fiber format er funktionel

in vivo

efter i.t. virus injektion.

(A, B) 2 × 10

10 vp af genomisk fiber-modificeret, EphA2 målrettet Luc /GFP reporter og kontrol virus blev injiceret intratumoralt i NOD-SCID mus, der bærer tumorxenoplantater ( n = 6 til 9 tumorer per gruppe). Luciferasereportergen ekspression i tumorer blev kvantificeret 3 dage efter virus injektion. Kolonner og fejllinjer viser middelværdier og standardafvigelser hhv. RLU, relative luminescensenheder. * P 0,05 versus 5T /41sSK,

# p 0,05 og

### p. 0,001 versus 5KO1

YSA peptid-medieret adenoviral transduktion i biopsier af human melanom metastaser

Derefter undersøgte vi, om EphA2 annoncer resultere i øget transduktion ikke kun i monolag tumor cellekulturer og tumorcellelinier xenotransplantater, men også i frisk biopsi tumor materiale fra patienter. Disse repræsenterer klinisk mere relevante substrater med hensyn til tumorceller fysiologi og tilstedeværelse af tumor mikromiljø. Biopsier af melanoma-metastaser blev skåret i levende væv skiver umiddelbart efter operationen og blev efterfølgende transduceret med genomisk capsid-modificeret, YSA-holdige annoncer hver repræsenterer de fiber formater eller med kontrol-vira. EphA2-ekspression blev påvist i levende væv skiver af alle biopsier opnået fra 5 patienter. Men udtryk varierede mellem patienter og var svagere end for monolagskulturer (fig. S5A). Dette forventedes som biopsier indeholder en blanding af celler, hvoraf kun en brøkdel er tumorceller. Vi observerede stærkeste transduktionseffektivitet som bestemt ved GFP-ekspression for virus med YSA peptid og til kontrol virus med nativ HAdV-5 fiber, hvilket bekræfter YSA peptid-medieret transduktion (fig. S5B). Som GFP signaler i 2D fotografier ikke kvantitativt repræsenterer transduktionseffektivitet, delvis på grund af den rynkede form af skiverne efter 3 dage gammel kultur, kvantificeret vi luciferaseekspression for disse skiver (fig. 8A) og for biopsier fra fire yderligere patienter (fig. 8B-E, en biopsi gav kun nok skiver til transduktion med Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5T /41sSK). Bemærk, at luciferase aflæsningerne er høj, fordi vi udført med høj titer transduktioner at muliggøre overvågning af GFP-ekspression. Vi observerede en markant forøget transduktion til Ad5T /41sSK-IJ-YSA sammenlignet med Ad5T /41sSK i 5 af 5 biopsier (signifikans blev nået i 3 biopsier med 4.3- til 576-fold forskelle, ikke i de resterende biopsier på grund af begrænset materiale) . Den stærkeste stigning i transduktion blev observeret for biopsi, der viste stærkest EphA2-ekspression. Ad5TS /41sK-IJ-YSA udviste højere transduktion end Ad5T /41sSK i 4 af 4 biopsier, men var lavere end for Ad5T /41sSK-IJ-YSA i 3 af 4 biopsier, som var i modsætning til resultater i monolagskulturer. Endelig transduktion af melanom levende væv skiver af Ad5KO1-HI-YSA var stærkt steget i forhold til Ad5KO1 i 4 af 4 biopsier (2,1 gange til 17,1 gange, signifikante i 2 biopsier). Disse resultater bekræfter re-målrettede adenoviral transduktion medieret af det indsatte YSA peptid til Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA også i klinisk relevant tumor biopsi materiale.

(A-E) levende væv skiver af melanom metastaser fra 5 forskellige patienter blev transduceret med 10

10 vp /skive genomisk fiber-modificeret, EphA2 målrettet Luc /GFP reporter og kontrol virus. Antallet af transducerede skiver pr virus var afhængig af størrelsen af ​​biopsiinstrumentet og var n = 4 (A, B), n = 3 (C), n = 2 (D) og n = 5 (E). Luciferasereportergen ekspression blev kvantificeret 3 dage efter transduktion. Søjler (A-E) og fejlsøjler (A, B, C, E) viser middelværdier og standardafvigelser hhv. RLU, relative luminescensenheder. *

/# p 0,05 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (

#)

Diskussion

I denne undersøgelse vi etablere celletype-specifik. Ad celle post ved funktionel peptidliganddomæne indsættelse i en de-målrettet kimære fiber stillads indeholder den korte HAdV-41 fiber skaft og knop (Ad5T /41sSK). Desuden beskriver vi Ad-vektorer entry-målrettet mod yderst relevant pan-cancer overflademarkør EphA2 ved genomisk insertion af genet, der koder for det kimære fiber eller en bil binding-ablateret HAdV-5 fiber med YSA peptidliganden. Transduktion af EphA2-positive celler

in vitro

blev dramatisk forøget med peptidliganddomæne indsættelse for både fibre formater (op til 236 gange), hvilket understreger styrken af ​​den YSA peptid til re-targeting af viral celle binding og indgang . Vi har tidligere identificeret EG, HI og IJ loops af Ad5T /41sSK som sites for funktionel indføring af RGD4C peptid, som binder til bredt udtrykt integriner [14]. Her bekræftede vi gennemførligheden af ​​disse insertionssteder hjælp af EphA2-bindende YSA peptid. I modsætning til den RGD peptid, som udviste overlegne aktivitet i HI loop, vi observerede lignende aktivitet i hver af de tre sløjfer for YSA peptid (fig. 2), afslører, at insertionssteder påvirker peptid-receptor-interaktioner forskelligt afhængig af peptidet . Med YSA peptidet, kunne vi påvise for første gang, at det kimære Ad5T /41sSK fiber letter celletype-specifik Ad transduktion under anvendelse af et panel af EphA2-positive og EphA2-negative celler (fig. 2 og 5). Peptid konkurrence og rekombinante receptorekspression undersøgelser klart bevise, at transduktion er peptid-specifik og formidlet af EphA2 (fig. 3 og 6). Disse resultater etablere en begrundelse for fremtidige undersøgelser, der skulle undersøge, om yderligere ligand peptider er funktionelle i Ad5T /41sSK fiber stillads, så virus post målretning via andre overflademarkører.

Vi viser, at indførelsen af ​​de modificerede fibre i virusgenomet og erstatter det native fiber, er muligt (fig. 5) ud over pseudotypebestemmelse via totrins transfektion /superinfektion protokol, som også anvendes i vores tidligere undersøgelse ([14], fig. 2-4). Vi observerede effektiv fiber trimerisering, virusproduktion og fiber inkorporering i viruspartikler for genomisk modificerede vira med 5T /41sSK fibre (og KO1 fibre, se nedenfor).