PLoS ONE: Overekspression af RNF146 i ikke-småcellet lungekræft Forbedrer spredning og invasion af tumorer gennem Wnt /β-catenin signalvej

Abstrakt

Undersøgelser har antydet en mulig sammenhæng mellem nyligt identificerede E3 ubiquitinligase ringfinger protein 146 (RNF146) og tumor udvikling. Men indtil nu, undersøgelser af RNF146 er blevet begrænset til poly (ADP-ribosyl) ation og ubiquitin ligation, hvorimod der sjældent rapporteret rolle RNF146 i tumor biologi. I den foreliggende undersøgelse blev den rolle RNF146 i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) undersøgt. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​RNF146 blev øget i kliniske prøver lungekræft og cellelinier. RNF146 ekspression korrelerede med tumorstørrelse, differentiering niveau, lymfe metastase, pTNM stadieinddeling og prognose af patienter i stadium I. RNF146 ekspression blev negativt korreleret med Axin ekspression men positivt korreleret med nukleare ekspression af β-catenin i NSCLC væv. RNF146 nedreguleret udtryk for Axin i lungekræft-cellelinjer og induceret udtrykket og nuklear fordeling af β-catenin. Overekspression af RNF146 i NSCLC cellelinjer forøgede niveauerne af cyclinD1, cyclin og CDK4, forfremmet cellecyklus G

0 /G

1-S-overgange, og reguleret celleproliferation. Overekspression af RNF146 førte til opreguleret niveauer af matrixmetalloproteinaser 2 og 7 og øget lungekræft celle invasivitet bivirkninger, der blev medieret af den klassiske Wnt /β-catenin-signalvejen. Sammenfattende data i den foreliggende undersøgelse viser, at RNF146 reguleret udviklingen og progressionen af ​​NSCLC ved at forbedre cellevækst, invasion, og overlevelse, hvilket tyder på, at RNF146 kan være et potentielt mål behandling NSCLC

Henvisning:. Gao Y, Song C, Hui L, Li CY, Wang J, Tian Y, et al. (2014) Overekspression af

RNF146

i ikke-småcellet lungekræft Forbedrer spredning og invasion af tumorer gennem Wnt /β-catenin signalvejen. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10,1371 /journal.pone.0085377

Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: September 5, 2013; Accepteret: November 26, 2013; Udgivet: 14 Jan 2014

Copyright: © 2014 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation of China (nr 30.972.967 og 30.973.502), Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse (nr 20092104110018), program til Liaoning Fremragende Talenter i University og Liaoning Provincial Videnskab og teknologi planen program (No. 2012225072). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

E3 ubiquitin ligaser spille vigtige roller i reguleringen af ​​cellefunktioner, herunder proliferation, cellecyklusstop, og apoptose. De kan også have yderligere funktioner, der afhænger af identiteten af ​​deres substrater. For eksempel, hvis en E3 ubiquitin ligase målrettet mod et onkogen for nedbrydning, det kan betragtes som en tumorsuppressor. Tilsvarende, hvis en E3 uniquitin ligase nedbryder et tumorsuppressorprotein, det kan betragtes et onkogen. Mange proteiner indeholdende RING-finger-domæner besidder ubiquitin-ligaseaktivitet, hvoraf nogle deltager i tumorigenese og tumormetastase. Den nyligt identificerede E3 ubiquitin ligase RING finger protein 146 (RNF146) interagerer med poly (ADP-ribose) (PAR) gennem en PAR-bindende motiv i Trp-Trp-Glu (WWE) domæne.

RNF146

gen er placeret på human kromosom 6q22, 33 [1]. RNF146 har neurobeskyttende aktivitet på grund af sin hæmning af Parthanatos via binding med PAR [2]. RNF146 kan lette DNA-reparation mod celledød induceret af DNA-beskadigende midler eller γ-bestråling [3]. Som reaktion på cellulær beskadigelse, RNF146 translokerer til kernen og forbedrer ubiquitinering og nedbrydning af forskellige nukleoproteiner, der deltager i DNA beskadigelse reparation. Hertil kommer, som en poly (ADP-ribosyl) ation (PARsylation) -dirigerede E3 ubiquitin ligase, RNF146 regulerer Tankyrase-afhængige nedbrydning af Axin og positivt regulerer Wnt signalvejen [1].

Wnt signalering vej er meget aktiv i lunge- cancerceller, hvilket fører til metastase og proliferation af disse celler [4]. Wnt signalering kan afvigende aktiveres af forskellige mekanismer, og en hovedfunktion er at inhibere proteolysen af ​​β-catenin, der styres ved phosphorylering [5]. Fri β-catenin kan trænge ind i kernen og aktivere målgener af Wnt. Steady state-niveauerne af Axin er meget vigtige, da dette stillads protein initierer dannelse af β-catenin-nedbrydning kompleks. Forskere har påvist, at overførsel af PAR til rester af Axin katalyseret af Tankyrase fører til PARsylation af Axin [1], [6]. RNF146 deltager i nedbrydningen af ​​PARsylated Axin gennem sin PAR-bindende motiv. Denne interaktion fører til ødelæggelse af β-catenin-nedbrydning kompleks, aggregering af intracellulær β-catenin og øget signalering gennem Wnt pathway [1].

Trods mange undersøgelser om RNF146, dens nøjagtige rolle i tumorigenese stadig uklar . I nærværende undersøgelse blev roller RNF146 i lungekræft undersøgt.

Materialer og metoder

NSCLC vævsprøver

Primære NSCLC prøver og kontrol væv blev indsamlet fra 133 patienter . Normale lunge prøver blev taget fra lungevæv mere end 5 cm fra kræft resektion webstedet. Procedurer fandt sted på fjerde Tilknyttede Hospital i Kina Medical University. Patienterne modtog ikke nogen stråling eller kemoterapi før operationen. NSCLC mellemstation var baseret på TNM Classification of maligne tumorer, syvende udgave [7]. Overlevelsestiden blev beregnet ud fra operationsdagen ihjel via evalueringen af ​​tilbagefald og metastase eller indtil den sidste opfølgning date. Friske prøver blev nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. For forsøg med humane væv blev godkendelse opnået fra den institutionelle bedømmelsesudvalg Kina Medical University. Skriftligt informeret samtykke blev givet i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

Antistoffer og reagenser

kanin anti-human RNF146 polyklonale antistof blev købt hos Abcam (Cambridge Science Park). Anti-Axin og anti-β-catenin antistoffer blev indkøbt fra BD Transduktion Laboratories (San Jose, CA, USA). Anti-CyclinA, anti-CyclinB, anti-CyclinD1, og anti-PRB-antistoffer var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-CDK4, Anti-CDK6, Anti-TIMP-1, Anti-cyclin, siAxin, siβ-catenin, og siTCF4 var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA). Antistoffer mod RhoA, RhoB, RhoC, og rock1 var fra Proteintech (Chicago, IL 60612, USA). Antistoffer mod CDK2, P21, matrixmetalloproteinase 2 (MMP2), MMP7, og MMP9 var fra NeoMarkers (Palo Alto, CA, USA). Anti-P27 og anti-P53 var fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA). De rekombinante overekspression plasmider pEX4-hRNF146 og pGPHI-shhRNF146 og kontrol tomme plasmider blev konstrueret af GenePharma (Shanghai, Kina). Den immunhistokemiske sekundære antistof-kit blev købt fra Dako (København, Danmark).

cellelinjer og Cell Culture

Den normale bronchieepithelceller cellelinje HBE, den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinjer A549 og H1299 var indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De humane NSCLC cellelinier LK2, LH7, LTE, og SPC blev købt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. Cellelinjer blev dyrket i Kaighn modifikation af Hams F-12-medium, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 eller Dulbeccos modificerede Eagle’s-F12 medium med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 100 enheder /ml penicillin og 100 enheder /ml streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C med 5% CO

2.

immunhistokemisk farvning

Paraffinsnit med en tykkelse af 4 um blev fremstillet og immunhistokemisk farvet med Envision som beskrevet tidligere [8] – [9]. Paraffinprøver blev inkuberet med anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:200), og anti-β-catenin (1:200) antistoffer ved 4 ° C natten over. PBS-inkuberede prøver blev anvendt som negative kontroller. Salg

To patologi læger vurderede farvningsresultaterne på en semikvantitativ skala. Fem høje forstørrelse felter blev tilfældigt udvalgt fra hvert afsnit, og 100 tumorceller på hvert område blev talt til at vurdere intensiteten og omfanget af RNF146 farvning. Et negativt resultat fik en score på 0 (ingen farvning), svag gul farvning blev registreret som et 1, gul blev scoret som en 2, og dyb brun farvning blev registreret som en 3. Procent scoringer blev tildelt som følger: 5 %, 0; 5-25%, 1; 26-50%, 2; 51-75%, 3; ≥75%, 4. To uafhængige scoringer blev ganget sammen for at opnå patientens farvelægning koefficient, som blev kategoriseret som “lav udtrykket” til farvning koefficienten 4 og “høj ekspression” til farvning koefficient ≥4. Axin og β-catenin blev bedømt som tidligere beskrevet [8] -. [9]

celletransfektion

Celler blev udpladet på 24-brønds plader ved ca. 50% konfluens og transficeret med plasmid eller siRNA 24 timer senere. Transfektion af lungekræft cellelinier A549 og LTE blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. For co-transfektionsforsøg, 1 til 1,5 ug cotransficeret eller tom vektor og 45 pmol siRNA blev tilsat til transfektionsblandingen. Efter 5 timer ved 37 ° C og 5% CO

2 blev komplet medium tilsat til transfektionsblandingen. Transfektion effektivitet blev bestemt ved Western blot.

RT-PCR-analyse

Samlet RNA blev ekstraheret ved anvendelse TRIzol (Invitrogen) i henhold til anvisningerne i TAKARA RNA PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) . GAPDH udtryk tjente som den interne kontrol. Primersekvenserne var: RNF146: forward: 5′-GGACGTCGCAGGAAGATTAAG-3 ‘og revers: 5′-CAATGGAGGTGTCTGGTGCT-3′; Axin: fremad: 5’-GACTTGCTGGACTTCTGGTT-3 ‘og omvendt: 5′-TGTACTTTCGGTAGATGGCT-3′; p-catenin: forward: 5’-CTAAACAGGAAGGGATGGAAG-3 ‘og revers: 5′-ACAGATGGCAGGCTCAGTGAT-3′; GAPDH: fremad: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3 ‘og omvendt: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3’. PCR-produkterne til RNF146 (376 bp), Axin (109 bp), β-catenin (221 bp), og GAPDH (153 bp) blev amplificeret med 30 PCR-cykler.

Western Blot

Celler blev lyseret i buffer indeholdende 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotinin og 1 mM PMSF. Totalt protein blev høstet, og 60 ug blev separeret ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Proteiner på PVDF-membraner blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i phosphatbufret saltvand med Tween (PBST), inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over, og derefter inkuberet med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer. Membraner blev udviklet med forbedret kemisk væske (ECL) (Thermo Fisher Scientific), og resultaterne blev registreret ved anvendelse af et Bioimaging-system (UVP Inc., Upland, CA, USA). Protein-ekspressionsniveauer blev vurderet ved anvendelse β-actin som et loading kontrol.

immunfluorescensfarvning

Celler dyrket på dækglas blev fikseret med 4% paraformaldehyd og behandlet med 0,2% Triton X-100. Efter vask med PBS blev cellerne blokeret med ikke-immuniseret dyr serum ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter inkuberet med primære antistoffer anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:100), og anti-β-catenin (1:100) ved 4 ° C natten over. Negative og positive kontroller blev inkluderet i alle forsøg. Celler blev inkuberet med FITC eller TRITC-mærkede sekundære antistoffer (1:100, Chemicon, USA), ved 37 ° C i 30 minutter. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med 0,1% 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Invitrogen) ved 37 ° C i 10 minutter. Celler blev vasket med PBS og observeret under et fluorescensmikroskop.

MTT assay

Transficerede celler og kontrolceller blev udpladet på plader med 96 brønde ved 10

3 celler per brønd og dyrket i 24 timer. Celleproliferation blev påvist med den celletælling Kit-8-opløsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) ifølge producentens instruktioner. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay blev gentaget på 4 dage i træk. Optiske densitetsværdier blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Spectra Thermo, Männedorf, Schweiz) ved en absorbans på 550 nm.

sårheling Assay

Hver brønd i en plade med 6 brønde blev podet med 5 × 10

5 celler, dyrket i 24 timer, og ridsede med en spydspids. Celler blev vasket med PBS og dyrket i serum-frit medium ved 37 ° C og 5% CO

2. Prøver blev høstet og fotografierne blev taget ved 0, 6, 12 og 24 timer. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange, og de gennemsnitlige værdier blev beregnet.

Transwell

Cellesuspensioner af 100 pi indeholdende 2,5 x 10

6 celler /ml blev tilsat til det øvre kammer af et transwell insert, og 600 pi medium indeholdende 10% føtalt bovint serum blev anbragt i det nedre kammer. En polycarbonat mikroporøs membran med en diameter på 8 um separeres de øvre og de nedre kamre. Celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i 6 timer. Efter vask med PBS blev cellerne fikseret med methanol ved stuetemperatur i 15 minutter. Endelig blev de behandlede celler farvet med hematoxylin blev fotografier taget, og farvede celler blev talt. For at måle den invasive kapacitet af celler, forafkølet medium uden serum og Matrigel (BD Biosciences, USA) blev blandet i et volumenforhold på 01:07 og blev tilsat til det øvre kammer. Volumenet af den flydende var 100 pi. Cellerne blev behandlet i 3 timer ved stuetemperatur, og resultaterne blev opnået efter blev cellerne dyrket i 24 timer.

Cell Cycle Assay

Celler blev podet ved 5 x 10

6 celler pr 6 cm dyrkningsskål, dyrket i 12 timer, og transficerede. Celler blev synkroniseret ved serumudsultning i 20 timer. Celler blev holdt i medium indeholdende 10% serum i 24 timer. Celler blev høstet og fikseret i kold 70% ethanol. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med 0,1 mg /ml RNaseA (Roche Indianapolis, IN) ved 37 ° C i 30 minutter og behandlet med 5 mg /ml propidiumiodid i 30 minutter. Endelig blev de behandlede celler analyseret ved flowcytometri.

Statistisk analyse

Databaser blev oprettet ved hjælp af Excel. Dataanalyse blev udført under anvendelse SPSS17.0. Forbindelserne mellem den udtryk for RNF146, Axin, β-catenin, og kliniske og patologiske faktorer blev vurderet af

χ

2

test og Fisher test. Kaplan-Meier overlevelseskurver og Log-rank blev brugt til at opdage og vurdere forskelle. Andre data blev sammenlignet med

t

-test. Data fra tre uafhængige forsøg blev vist som

± s

. En

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

RNF146 Overekspression i NSCLC

For at undersøge ekspressionen af ​​RNF146 i NSCLC, 20 parret. NSCLC og ikke-kræft vævsprøver blev opsamlet, og RT-PCR og Western blot blev anvendt til at analysere RNF146 mRNA og protein-ekspressionsniveauer hhv. Ekspression af RNF146 mRNA i NSCLC prøverne var højere end for de ikke-kræft lungevæv (

P =

0,030) (figur 1A). Resultaterne af Western blot og immunhistokemisk farvning bekræftede, at RNF146 proteinekspression blev forøget i NSCLC (

P =

0,014,

P =

0,000) (figur 1B), i overensstemmelse med RT-PCR resultater. Ekspressionen af ​​RNF146 blev også analyseret i HBE og NSCLC cellelinier. Forskellige ekspressionsniveauer af RNF146 blev observeret blandt de NSCLC cellelinjer (figur 1C). Ekspressionen af ​​RNF146 mRNA og protein i både HBE og LK2 (skællede) cellelinier var lave. Ekspressionen af ​​RNF146 protein i LTE (adenocarcinom) og LK2 (skvamøs) cellelinjer var moderat, og ekspressionen af ​​RNF146 protein i A549 og H1299 (adenocarcinom) cellelinier var høje. Dataene viste, at ekspression af RNF146 blev øget i de kliniske NSCLC prøver og lungekræft cellelinier.

Påvisning af mRNA og protein ekspression af RNF146 i 20 NSCLC og kontrolprøver ved RT-PCR (A) og Western blot (B). T: tumorprøver; N: matchede normale væv; M: Marker. (C) mRNA og protein ekspression af RNF146 i HBE-cellelinien og de humane NSCLC cellelinier LK2, LH7 (squamous cancer), H1299, LTE, A549, og SPC (adenocarcinom). GAPDH og β-actin tjente som interne kontroller. (D) Udtryk og distribution af RNF146 i NSCLC ved immunhistokemi. D1, RNF146 blev ikke udtrykt i den normale bronchiale og alveolær epitel. D2, RNF146 blev udtrykt i cytoplasmaet i lungecancerceller, og svag RNF146 ekspression blev detekteret i den tilstødende bronkieepitel. D3 og D5 viste svag RNF146 farvning i godt differentieret planocellulært karcinom og adenokarcinom. D4 og D6 udviste stærk RNF146 farvning i dårligt differentieret planocellulært karcinom og adenokarcinom. (E) Forholdet mellem RNF146 udtryk og prognosen for NSCLC patienter. E1 viste korrelation mellem RNF146 udtryk og prognose af fase I-patienter (

P

0,05). E2 og E3, ingen sammenhæng mellem RNF146 udtryk og prognose af fase II og fase III patienter (

P

0,05).

At udforske rolle RNF146 i NSCLC videre, den relationer mellem proteinekspression og kliniske patologiske karakteristika blev analyseret. Der var sammenhænge mellem ekspression af RNF146 og tumorstørrelse (

P

= 0,044), histologiske type (

P =

0,005), dårlig differentiering (

P

= 0,002) , lymfatisk metastaser (

P

= 0,009), og pTNM etape (

P

= 0,015). Imidlertid blev RNF146 udtryk ikke korreleret med alder eller køn NSCLC-patienter (tabel 1, figur 1D). Desuden Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at overekspression af RNF146 var korreleret med overlevelsen af ​​patienter med lungecancer i fase I (

P

= 0,016). Der var ingen sammenhæng mellem RNF146 udtryk og overlevelsestid hos alle patienter (

P =

0,616) eller patienter med stadie II (

P

= 0,437), eller stadium III NSCLC (

P =

0.520) (figur 1E).

Angivelse af RNF146, Axin, og nuklear Fordeling af β-catenin

Som en E3 ubiquitinligase, RNF146 regulerer Tankyrase -afhængige nedbrydning af Axin og positivt regulerer Wnt signalvejen [1]. At undersøge forholdet mellem RNF146, Axin, og β-catenin, blev påvist udtrykkene for Axin og β-catenin i 133 NSCLC prøver ved immunohistokemiske metoder og korrelationer af proteinerne blev beregnet. RNF146 var negativt korreleret med Axin ekspression (

P =

0,003), men det var ikke korreleret med reduceret ekspression af β-catenin i membraner eller forøget ekspression af β-catenin i cytoplasmaet (

P =

0,524). Høj RNF146 udtryk var positivt korreleret med nukleare β-catenin farvning (

P =

0,047) (Tabel 2, figur 2A).

(A) Ekspression og distribution af RNF146, Axin, og β catenin i NSCLC ved immunhistokemi (x 200). Stærk Axin udtryk og membran tilhørende β-catenin korreleret med lav ekspression af RNF146 i adenocarcinom (A1). Lav Axin udtryk og cytoplasmatisk og nuklear-ekspressionen af ​​β-catenin blev fundet i pladecellekræft kræftformer med høj ekspression af RNF146 (A2 og A3). Ekspression og distribution af RNF146, Axin og β-catenin påvises ved (B) RT-PCR, (C) Western blot, og (D) immunofluorescens. Celler transficeret med tomme vektorer tjente som kontroller.

LTE cellelinjer blev kortvarigt transficeret med pEX4-RNF146 overekspression plasmid eller kontrol pEX4 tomme plasmid. Eksperimenter har bekræftet, at RNF146 blev opreguleret. A549 og H1299 cellelinier blev transient transficeret med RNF146-shRNA1, RNF146-shRNA2 eller kontrol shNC, og eksperimenter bekræftede, at RNF146 ekspression blev reduceret (figur 2C og fig S1A). Endvidere blev ekspressionsniveauer af Axin og β-catenin analyseret ved RT-PCR, Western blot, og immunofluorescens. Overekspression eller knock-down af RNF146 påvirkede ikke mRNA ekspressionsniveauerne af Axin og β-catenin (figur. 2B). Imidlertid Western blot resultater viste, at overekspression af RNF146 i LTE lungecancerceller inhiberede protein ekspression af Axin og forøget ekspression af β-catenin (fig. 2C). Immunofluorescens bekræftede yderligere, at overekspression af RNF146 faldt den cytoplasmatiske ekspression af Axin og forøget ekspression af β-catenin i cytoplasmaet og kernen. I modsætning hertil reduceret ekspression af RNF146 ført til øget ekspression af Axin i cytoplasmaet og nedsat udtryk for β-catenin i cytoplasmaet og kernen (figur. 2D).

Angivelse af RNF146 og spredning af Lung Cancer Cells

for at undersøge rollerne for RNF146 i celleproliferation, blev LTE og A549-celler transficeret med plasmider, som beskrevet ovenfor, og celleproliferation blev påvist ved MTT-assayet. Sammenlignet med kontrolgruppen og gruppen transficeret med den tomme plasmid, overekspression af RNF146 signifikant forøget celleproliferation i LTE-celler, hvorimod knockdown af RNF146 inhiberede celleproliferation i A549 og H1299-celler (figur 3A og figur S1B). Cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri, og resultaterne viste, at overekspression af RNF146 faldt procentdelen af ​​G

0 /G

1 fase LTE celler og forøget procentdelen af ​​S-fase celler. I modsætning hertil knockdown af RNF146 i A549 og H1299-celler steg procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase og faldt procentdelen af ​​celler i S fase (figur 3B og figur S1c).

(A) MTT celleproliferationsassay med overekspression af RNF146 og shRNA-medieret knockdown af RNF146. **

P

0,05. (B) Virkninger af RNF146 på cellecyklus analyseret ved flowcytometri. (C) Afsløring cellecyklus proteinekspression ved Western blot.

Western blot resultater viste også sammenhænge mellem niveauerne af RNF146 i lungekræft celler og ekspression af cellecyklus-relaterede regulatoriske proteiner, herunder cyclinD1, cyclin og CDK4 (figur 3C). Dataene viste, at RNF146 reguleret ekspression af cyclinD1 og cyclin og reguleret cellecyklusprogression ved at inducere G

0 /G

1-S overgang.

RNF146 Expression og Invasion af Lung Cancer Cells

Overekspression og knockdown af RNF146 påvirket celle migration og invasion evner NSCLC celler. Sårheling og transwell forsøg viste, at overekspression af RNF146 forbedret cellemigrering og invasion i LTE-celler, og at knockdown af RNF146 nedsat cellemigration og invasion i A549-celler (Figur 4A, B, C). Lignende resultater blev opnået i H1299 celler, hvor RNF146 ekspression blev forarmet (figur S2, S3). Proteiner relateret til migration og invasion blev også påvist ved Western blot. Ekspressionsniveauerne af MMP2 og MMP7 blev forøget i LTE celler, overeksprimeres RNF146, mens niveauerne af RhoA, RhoB, RhoC, rock1, og TIMP-1 var uændret. Desuden blev niveauet af MMP2 og MMP7 faldt betydeligt, når RNF146 udtryk blev slået ned (figur 4D).

(A) sårheling assay i LTE celler, der overudtrykker RNF146 og A549 celler behandlet med shRNA-1 målrettet RNF146. Histogrammet viser procenterne af migrerede celler i skrabet områder (nederst). (B-C) Analyse af cellemigration og invasion evne i transwell assay. Histogrammet viser antallet af migrerede eller invaderede celler. (D) Western blot for migration og invasion-associerede proteiner. β-actin tjente som den interne kontrol.

RNF146-reguleret ekspression af cyclinD1 og MMP7

Vi foreslog, at RNF146 reguleret celle migration og invasion ved indirekte at regulere target-gentranskription gennem Axin /β-catenin signalering. For at teste denne hypotese, vi bankede ned RNF146 i celler behandlet med siRNA rettet mod Axin. Vi fandt, at niveauerne af cyclinD1, cyclin, og MMP7 udvundet som sammenlignet med celler behandlet med shRNF146 alene (figur 5A). Overekspression af RNF146 i kombination med siRNA knockdown af β-catenin forårsagede ikke niveauer af cyclinD1, cyclin eller MMP7 at stige, mens MMP2 niveauerne stadig var steget (figur 5B). Knockdown af endogen TCF-4 i LTE celler kombineret med overekspression RNF146 forårsagede ikke niveauer af cyclinD1 og MMP7 at øge (figur 5C). Men når RNF146 og TCF-4 blev slået ned i A549 celler samtidig, udtryk for cyclinD1 og MMP7 faldt mere drastisk (figur 5D). Samlet set data viste, at RNF146 sandsynligvis reguleret udtryk for cyclinD1 og MMP7 af Wnt /β-catenin signalvejen.

(A) Niveauer af cyclinD1 /E og MMP2 /7 i A549 celler efter behandling med shRNA målrettet mod RNF146 og siRNA målrettet mod Axin. (B) Niveauer af cyclinD1 /E og MMP2 /7 i LTE efter overekspression af RNF146 og knockdown af β-catenin. (C og D) blev påvist Niveauer af cyclinD1 og MMP7 efter knockdown af endogen TCF-4 i LTE og A549 celler med overekspression eller knockdown af RNF146.

Diskussion

I den nuværende undersøgelse fandt vi, at RNF146 blev overudtrykt i NSCLC væv sammenlignet med tilstødende normale lungevæv. Den RNF146 udtryk niveau viste korrelationer med flere kliniske patologiske faktorer, herunder tumor størrelse, differentiering niveau, lymfe metastase, pTNM iscenesættelse, og prognosen for patienter i fase I, som er vigtige faktorer, der repræsenterer potentialet for lungekræft malignitet. Disse data tyder på, at overekspression af RNF146 i NSCLC kan øge metastase i lungekræft, og at RNF146 kan være en indikator for dårlig prognose i fase I NSCLC.

Vores data er i overensstemmelse med resultaterne af to nylige rapporter [10 ] – [11], at RNF146 kan være involveret i udviklingen af ​​tumorer. Guld

et al.

Opdagede en risiko for brystkræft gen i den jødiske Ashkenazi befolkning ligger på 6Q 22.33 i et genom-dækkende forening undersøgelse. Denne placering indeholdt to gener,

RNF146

enoyl CoA hydratase domæne indeholdende 1 [11]. En anden vigtig opdagelse var, at RNF146 interageret med PARsylated Axin gennem sin PAR-bindende motiv, hvilket fører til Axin nedbrydning og positiv regulering af Wnt signalvejen. Disse resultater er nye beviser for potentielle rolle RNF146 i tumor udvikling [1], [6]. Det er blevet oplyst, at de nyligt identificerede RNF146 substrater grundlæggende leucin zipper nuklear faktor 1 (BLZF1) og kræft modtagelighed kandidat 3 (CASC3) er involveret i tumor udvikling og celledeling [12] – [13]. Disse rapporter tyder på, at RNF146 kunne spille vigtige roller i tumorer ved at ændre genekspression eller nedværdigende målproteiner.

Wnt signalvejen påvirker genekspression og celle migration. Som et vigtigt molekyle i Wnt signalvejen, Axin deltager i dannelsen af ​​Axin /glycogensynthasekinase 3β (GSK-3β) /adenomatøs polyposis coli (APC) /Caseinkinase I (CKI) nedbrydning kompleks, hvilket forbedrer nedbrydningen af ​​β catenin og hæmmer tumor spredning, invasion, og metastase [14] – [15]. Tidligere undersøgelser har fastslået, at Axin spiller vigtige roller i NSCLC [14]. Axin ekspression er blevet vist at inhibere proliferation og invasion af lungecancerceller [9]. Cytoplasmatisk stabilisering og akkumulering af nukleare β-catenin, et vigtigt signal transducer, er vigtige processer i Wnt signaltransduktion.

Vi fandt, at RNF146 var negativt korreleret med ekspressionen af ​​Axin og positivt korreleret med nukleare udtryk for β- catenin. Immunfluorescensfarvning viste, at RNF146 reguleret distributionen og nuklear ophobning af β-catenin. Tidligere undersøgelser har vist, at nuklear β-catenin-ekspression fører til tab af celleadhæsion. Desuden er dette protein forøgede transkriptionen af ​​målgener, herunder c-myc, cyclinD1, VEGF, og MMP7, ved at interagere med T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor, hvilket fører til proliferation og metastase af tumorceller [16] – [ ,,,0],17]. I den foreliggende undersøgelse RNF146 reguleret Axin og β-catenin af Wnt signalvejen, hvilket indikerer, at RNF146 påvirket af spredning og invasion af tumorceller.

Vores MTT og cellecyklus eksperimenter viste, at RNF146 ikke kun reguleret celleproliferation og cellecyklusprogression men påvirkes også ekspressionsniveauerne af proteiner relateret til cellecyklus. Cyclin D1 primært regulerer G

1 fase progression [18], og cyclin E-forstærker G

1 /S overgang [19] – [20]. Cyclin D1 kunne interagere med CDK4 /6 og forbedre transkriptionen af ​​nedstrøms gener [18]. Således kan det konkluderes, at RNF146 styrer tumor spredning ved at regulere cellens cyklus.

Vores data viste også, at RNF146 påvirkede migration og invasion af lungekræft celler, hvilket tyder på, at RNF146 har flere funktioner. scratch test og transwell analyseresultater De viste, at RNF146 øget migration og invasion af lungekræft celler. MMP nedbryder forskellige proteiner i den ekstracellulære matrix, forstyrre væv barrierer for tumorceller invasion, og spiller en vigtig rolle i invasionen og metastase af tumorer [21]. Dataene i denne undersøgelse viste, at MMP2 og MMP7 blev reguleret af RNF146. Nedbrydning af den extracellulære matrix og knoglematrix ved MMP2 og MMP7 har vist sig at være tæt forbundet med NSCLC invasion og metastase [22] – [23]. Data tyder på, at RNF146 kunne regulere migration og invasion af lungekræft ved at regulere MMP2 og MMP7.

Forud for vores undersøgelse, roller RNF146 i Wnt signalvejen var begrænset til nedbrydningen af ​​Axin og fremme den nukleare aggregering af β-catenin. Fordi β-catenin interagerer med TCF-4 efter den kommer ind i kernen [16] – [17], vi hypotese, at RNF146 kunne regulere celleproliferation og invasion ved indirekte regulering målrettet gentranskription gennem Axin /β-catenin. Vores forsøg viste, at RNF146 ikke spillede regulatoriske roller i de nedstrøms proteiner cyclinD1, cyclin, og MMP7 i celler med knockeddown Axin og β-catenin. Tilsvarende gjorde overekspression eller knockdown af RNF146 fremprovokere ændringer i de målrettede protein niveauer, når TCF4 blev slået ned. **

P

0.05.

doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003

(TIF)

Acknowledgments

We