PLoS ONE: Undersøgelse af Molekylær Anerkendelse af Aptamere Valgt gennem kræft i æggestokkene Cell-SELEX

Abstrakt

Baggrund

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske malignitet, og æggestokkene klare celle karcinom undertype (OCCA) demonstrerer en særdeles dårlig respons på standard behandling. Forbedringer i kræft i æggestokkene resultater, især for OCCA, kunne forventes fra en klarere forståelse af den molekylære patologi, der kan guide strategier for tidligere diagnose og mere effektiv behandling.

Metode /vigtigste resultater

Cell -SELEX teknologi blev anvendt til at udvikle nye molekylære prober til kræft i æggestokkene celleoverflademarkører. blev opnået i alt tretten aptamerer med K

d’s til æggestokkene kræftceller i pico- til nanomolære område. Indledende undersøgelse af målene for disse aptamerer og deres bindende egenskaber blev også udført.

Konklusioner /Betydning

Vi har udvalgt en række aptamerer, der binder til forskellige typer af kræft i æggestokkene, men ikke livmoderhalskræft kræft. Selvom binding til andre cancer cellelinjer blev observeret, kunne disse aptamerer føre til identifikation af biomarkører, der er relateret til kræft

Henvisning:. Van Simaeys D, López-Colón D, Sefah K, Sutphen R, Jimenez E, Tan W (2010) Undersøgelse af Molekylær Anerkendelse af Aptamere Valgt gennem kræft i æggestokkene Cell-SELEX. PLoS ONE 5 (11): e13770. doi: 10,1371 /journal.pone.0013770

Redaktør: Cameron Neylon, University of Southampton, England

Modtaget: May 3, 2010; Accepteret: 6 OKTOBER 2010; Udgivet: November 1, 2010

Copyright: © 2010 Van Simaeys et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak National Institutes of Health (NIH) for støtte (R01GM079359, R01 CA133086, R01-CA106414). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte mest almindelige kræftform hos kvinder [1], og har den højeste dødelighed af enhver gynækologisk malignitet. Denne sygdom er karakteriseret ved få tidlige symptomer, præsentation på et fremskredent stadium i de fleste tilfælde, og fattige overlevelsesrater [2] – [8]. Prognosen er især dårlig for patienter med ovariecancer klar celle adenocarcinom (OCCA), som ofte er resistente over for standard platinbaseret kemoterapi [6] – [10].

Den mest almindeligt anvendte serum biomarkør for klinisk diagnose og prognosen er ovariecancer antigen 125 (CA-125). CA-125-værdi er forhøjet hos ca. 90% af tilfældene af epitelial ovariecancer (trin 3 og 4) sene. Det er dog kun forhøjet i 50-60% af kvinder med tidligt stadie sygdom og er også forhøjet i en række godartede [2], [5], [7], [11] – [13].

udnyttelsen af ​​aptamerer har et stort potentiale for identifikation af nye biomarkører. Aptamerer, som er prober er i stand til specifikt at binde til celleoverflademarkører udtrykt af målrettede tumorceller [14] – [21], er korte enkeltstrengede oligonucleotider på ca. 100 nt. De er udvalgt fra store kombinatoriske puljer af sekvenser ved Systematic Evolution af ligander ved eksponentiel Enrichment (SELEX) for deres evne til at binde til mål, som kan variere fra små molekyler til proteiner eller polysaccharider, samt tumorceller [16] – [19 ], [21] – [23]. Aptamerer har veldefinerede tertiære strukturer, der dikterer selektiviteten for deres mål.

Målet specificitet og affinitet af aptamerer ligner dem af antistoffer, men med flere fordele i forhold antistoffer til klinisk brug. Aptamerer kan syntetiseres kemisk på kort tid med relativt lave omkostninger, hvilket muliggør bedre batch-til-batch reproducerbarhed og lettere inkorporering af kemiske modifikationer. Da aptamerer for celler er valgt uden forudgående kendskab til mål-molekyler, kan udvalgte aptamerer bruges til at identificere nye overflade markører på kræftceller [14], [16] – [18], [20], [24] – [27] .

i dette arbejde, blev i alt 13 aptamerer udvalgt til to model æggestokkene kræft cellelinjer: den OCCA line TOV-21G [28] (10 aptamerer) og æggestokkene serøs adenocarcinom line CAOV-3 [29 ] (3 aptamerer). Celleoverfladen mål aptamererne blev også kortvarigt undersøgt. Indledende undersøgelse af aptamerer ‘mål og bindende egenskaber blev også udført

Resultater og Diskussion

To model ovariecancer cellelinjer blev valgt for udvælgelse af kræft i æggestokkene aptamerer:. Den OCCA cellelinie TOV -21G og æggestokkene serøs adenocarcinom cellelinie CAOV-3. For at identificere aptamerer, der specifikt binder til ovariecancerceller, blev den cervikale cancercellelinie HeLa anvendes til modselektion. Den SELEX procedure for TOV-21G er kort beskrevet nedenfor. En detaljeret beskrivelse findes i det eksperimentelle afsnit.

For at starte udvælgelsesprocessen, 20 pmol af naive bibliotek blev beriget af sekventielle bindende for TOV-21G cellemonolag. Sekvenser, der udviser ikke-specifik binding til generelle celleoverflademarkører blev fjernet ved at inkubere den berigede pool med HeLa-celler (runder 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 20, 21, 22). Den eluerede pulje for hver runde af SELEX blev amplificeret gennem PCR, hvorefter ssDNA pools af interesse blev udvundet og overvåges for berigelse mod TOV-21G ved flowcytometri. Som de valgte puljer blev beriget med sekvenser, som genkender og binder til målcellen linje, blev en stigning i fluorescenssignal observeres (figur 1a). Men forsøg på at udelade counter-udvalg i runder 13 til 19 ført til berigelse for HeLa-bindende sekvenser. Sekvenserne binder til HeLa-celler blev fjernet ved counter selektion i efterfølgende runder, mens berigelse mod målet cellelinien blev opretholdt (figur 1b). Efter 22 SELEX-runder, en beriget pulje, der er specifikt bundet til modellen OCCA cellelinie, men marginalt til HeLa-celler, blev opnået (figur 2). Således blev puljen med succes beriget for sekvenser bindende overflademarkører udtrykt af modellen OCCA cellelinie, men ikke af livmoderhalskræft celler.

A) berigelse med TOV-21G celler B) Den marginale binding af de respektive pools til HeLa-celler. Ved at gøre counter udvælgelse, blev sekvenser binding til HeLa fjernet.

Den negative kontrol i disse bindingsassays var PE /Cy5-mærket random bibliotek. C) Celler blev inkuberet med varierende koncentrationer af PE-Cy5-mærkede aptamer in duplo. Fluorescensintensiteten stammer fra baggrunden binding ved hver koncentration blev trukket fra middelværdien fluorescensintensiteten af ​​den tilsvarende aptamer

Efter gennemførelse af udvælgelsesprocessen blev tre puljer udvalgt og indsendt til sekventering:. Den endelige pool (runde 22), den tidligere pool (runde 21) og en pool, der viser minimal berigelse (runde 13). Pool-sekventering blev anvendt til at identificere aptamer kandidater ved at generere store mængder sekvenser. Dette antal af sekvenser (her mindst 2000 pr pool) er stor nok til at tillade identifikation af aptamerer, der kun har en lille repræsentation i puljen (dvs. mindre end 1%). Som det kan ses i tabel 1, udvalgte aptamerer var faktisk til stede så tidligt som en minimal berigelse blev observeret. AptTOV1 størrelse procentdel faldet, idet SELEX fortsatte, hvilket er bemærkelsesværdigt i betragtning af den høje affinitet af denne aptamer. Denne adfærd er også blevet observeret i andre markeringer [30]. Andre aptamerer viser en konsekvent stigning i størrelse procent som berigelse steget. Resultaterne fra AptTOV6 er medtaget for at vise, at selv relativt små familier kan føre til aptamerer.

Sekvenser blev justeret i familier efter sekvenshomologi. Antallet af homologe blev sammenlignet på tværs af de forskellige sekventerede puljer til at validere deres berigelse gennem udvælgelsesproceduren ved hjælp af grundlæggende bioinformatik. Ti sekvenser, der udviser den bedste homologi overalt i pools blev selekteret som aptamer kandidater, syntetiseret og testet for binding til modellen ovarian cancer cellelinjer. Alle kandidater viste binding til TOV-21G, med bindende tilhørsforhold i pico- til nano-molær område (tabel 2). Dette viser potentialet af næste generation sequencing i SELEX at blive en stærk og reproducerbar metode til udvikling af aptamerer.

Som vist i tabel 2, aptamerer aptTOV1 (K

d = 0,25 ± 0,08 nM) og aptTOV2 (0,90 ± 0,25 nM) binder meget tæt til TOV-21G celler. Som vist i tabel 2, kan begge aptamerer skelne TOV-21G fra HeLa-celler.

Bindingen af ​​de udvalgte aptamerer blev testet med forskellige adenocarcinom cellelinjer, såvel som andre typer af cancercellelinjer, som vist i tabel 2. Fem af de udvalgte mod TOV-21G aptamerer viste binding til CEM-celler (akut lymfoblastisk leukæmi), mens ingen af ​​aptamererne bundet til Ramos-celler (Burkitts lymfom) eller HL-60 (akut promyelocytisk leukæmi). Alle de opnåede aptamerer binder til colorektal adenocarcinom (HCT-116) og glioblastoma (A172). De opnåede fra TOV-21G ikke binder til DLD-1 (Dukes ‘type C colorectal adenocarcinom) aptamerer, mens aptamererne fra CAOV-3 bandt til denne cellelinje. Denne adfærd svarer til den observeret i tidligere arbejde udført i vores laboratorium.

Da begge valg fandt sted ved 4 ° C, blev de udvalgte aptamerer testet ved fysiologiske betingelser. Aptamererne blev inkuberet med målcellelinie ved 37 ° C og 4 ° C og deres binding blev målt. Alle aptamerer viste lignende binding ved 4 ° C og 37 ° C (f.eks aptTOV1 i figur 2a), hvilket antyder, at de har potentiale til in vivo-undersøgelser.

For at undersøge karakteren af ​​målmolekylet af hver aptamer, binding af hver aptamer blev testet efter behandling af målcellerne med proteaserne trypsin eller proteinase K. Som det kan ses i figur 3a, aptTOV1 viser en klar tab af binding til TOV-21G efter protease behandling. Den samme adfærd blev også observeret med alle andre aptTOV aptamerer. Interessant nok for den anden model cellelinie CAOV-3, DOV3 og DOV4 bevaret deres binding efter protease behandling (figur 3b), hvilket antyder, at disse aptamerer ikke kan binde til celleoverflade membranproteiner, men snarere til en anden type celleoverflademarkør (dvs. kulhydrat eller lipid). Hverken DOV3 eller DOV4 binder sig til de testede leukæmiceller (tabel 3).

A) Ingen binding blev observeret for aptTOV1 at trypsiniseret TOV-21G celler. B) Bindingen af ​​DOV 3 og 4 til CAOV-3-celler blev ikke påvirket af protease behandling. Alle andre aptamerer viste den samme adfærd som repræsenteret i a).

Som konklusion, har vi udvalgt en række aptamerer med høj affinitet for kræft i æggestokkene celler, herunder OCCA (TOV-21G) og serøs adenocarcinom (CAOV-3). Ved counter selektion mod HeLa-celler, blev aptamerer der kan skelne ovariecancer fra livmoderhalskræft valgt. Navnlig AptTOV 1 viste meget høj affinitet over TOV-21G, med en K

d på 250 pM.

betragtning af det begrænsede antal biomarkører for ovariecancer øjeblikket er til rådighed, de opnået fra disse markeringer aptamerer har potentiale for at forbedre diagnosticering og behandling af denne dødelige sygdom. Fordi aptamererne også binde godartede cyster (tabel 3), kan de aptamerer ikke anvendes til at identificere ovariecancer

per se

. Men da aptTOV apamers ikke binde sig til kræft i lignende ætiologi (CaOV3), og heller ikke til HeLa, de stadig har potentiale til at give mere indsigt i patologi for kræft i æggestokkene. Det er blevet observeret, at der er betydelige forskelle i proteom af serøs og klar celle ovariecancer [31]. Målene for disse aptamerer er mest sandsynligt nedreguleres eller stumme i disse to cellemodeller. Derudover AptTOV aptamerer viser binding til cancercellelinjer fra forskellige ikke-beslægtede cancerformer (tabel 3), og nogle AptTOV aptamerer binder også CEM-celler. Dette resultat antyder, at de opnåede fra denne SELEX aptamerer kan anvendes til profilering af ekspressionen af ​​membranproteiner fra forskellige kræftformer. forventes Identifikation målene i de udvalgte aptamerer at belyse de underliggende mekanismer, der er involveret.

Opdagelsen af ​​to aptamerer, der var ufølsom over for protease fordøjelsen er spændende. Derudover deres binding til alle testede adenokarcinomceller, men ikke til nogen af ​​de leukæmicellelinjer, foreslår potentiale til yderligere at belyse de underliggende molekylære forskelle mellem disse kræftformer. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at identificere målene for disse aptamerer og vurdere deres præstationer i kliniske prøver.

Materialer og metoder

Instrumentering og reagenser

Alle oligonukleotider blev syntetiseret ved standard phosphoramidit kemi under anvendelse af en 3400 DNA-synthesizer (Applied Biosystems) og blev oprenset ved omvendt fase-HPLC (Varian Prostar). Alle PCR-blandinger indeholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 2,0 mM MgC

2, dNTP’er (hver ved 2,5 mM), 0,5 uM af hver primer, og varmstart Taq DNA-polymerase (5 enheder /pl ). PCR blev udført på en Biorad Thermocycler og alle reagenser blev indkøbt fra Takara. Overvågning af pool berigelse, karakterisering af de valgte aptamerer, og identifikation af målproteinet assays blev udført ved hjælp af flow cytometrisk analyse under anvendelse af en FACScan cytometer (BD Immunocytometry Systems). Trypsin og proteinase K blev indkøbt fra Fisher Biotech. Billeddannelse af celler blev udført med et Olympus FV500-IX81 konfokalt mikroskop (Olympus America Inc., Melville, NY). DNA-sekvenserne blev bestemt ved genomsekvensering Services Laboratory ved University of Florida med anvendelsen af ​​454-sekventering (Roche).

Cellekultur og buffere

CAOV-3, HeLa, Hs832 (C) T og TOV-21G cellelinjer hvor opnået fra American Type Cell Culture (ATCC). Den CAOV-3 og TOV-21G ovariecancer cellelinjer hvor opretholdt i kultur med MCBD 105: Medium 199 (1:01); HeLa-cellelinien blev dyrket i RPMI-1640; og Hs832 (C) T-cellelinje blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Alle medier, hvor suppleret med 10% FBS og 100 UI /ml penicillin-streptomycin. Andre cellelinjer anvendes til selektivitet analyser inkluderet CEM (T-celle leukæmi), Ramos (Burkitts lymfom), HCT-116, DLD-1, HT-29 (kolorektal adenocarcinom), NCI_H23 (ikke-småcellet lungekræft) og A172 (glioblastoma ), som alle blev dyrket ifølge ATCC specifikationer. Alle cellelinier hvor inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære.

Under udvælgelsen blev cellerne vasket før og efter inkubering med vaskebuffer (WB), indeholdende 4,5 g /l glucose og 5 mM MgCl

2 i Dulbeccos phosphatbufret saltvand med calciumchlorid og magnesiumchlorid (Sigma). Bindingspuffer (BB) anvendes til selektion blev fremstillet ved tilsætning af gær-tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma) og BSA (1 mg /ml) (Fisher) til vaskepufferen at reducere baggrunden bindende.

SELEX bibliotek og primere

HPLC-renset bibliotek indeholdt et segment af randomiseret sekvens på 40 nukleotider (nt) flankeret af 20-nt primer hybridiseringssites:

(5’ATC CAG AGT GAC GCA GCA (N)

40 TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3 ‘) og (5’-ACT ACC AAC GAG CGA CCA CT (N)

40 AGA GTT CAG GAG AGG CAG GT-3′). De fremadrettede primere blev mærket med 5′-FITC og reverse primere blev mærket med 5′-biotin.

In Vitro celle-SELEX

I denne undersøgelse TOV-21G blev anvendt som målcellelinie og HeLa blev anvendt til modselektion. For den første runde blev cellerne inkuberet med 20 pmol naive ssDNA bibliotek opløst i BB. For senere runder, blev 50 pmol af beriget pulje anvendes til inkubation også opløst i BB. Før inkubering blev ssDNA pool denatureret ved opvarmning til 95 ° C i 5 minutter og afkøledes hurtigt på is i 5 minutter, så hver sekvens til dannelse den mest stabile sekundære struktur.

Cellerne blev vasket to gange ( 2 min) med WB og inkuberet med DNA-pool på is i en orbitalryster i 30 minutter. I senere udvælgelsesrunder blev cellerne vasket med øget stringens for at fjerne svagt bindende sekvenser (et større antal vaske og øget vasketid, op til 5 min). De bundne sekvenser blev elueret i 500 pi BB ved opvarmning ved 95 ° C i 15 minutter, afkølet på is i 5 minutter og centrifugeret ved 14.000 rpm i 2 min.

Supernatanten indeholdende DNA-sekvenserne blev derefter inkuberet med en negativ cellelinie til at udføre en subtraktion af generelle sekvenser, som beskrevet ovenfor. De resterende sekvenser blev amplificeret ved PCR under anvendelse af FITC- og biotinmærkede primere. Amplifikationer blev udført ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, efterfulgt af endelig forlængelse i 3 minutter ved 72 ° C. Den valgte sense ssDNA blev separeret fra den biotinylerede antisense ssDNA ved streptavidinovertrukne sepharoseperler (Amersham Bioscience). Den ssDNA blev elueret fra sepharoseperler ved smeltning i en 0,2M NaOH-opløsning.

berigelse af specifikke sekvenser blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri som beskrevet nedenfor. Når niveauet af berigelse nåede et plateau, blev pools af interesse forelægges til sekventering. Aptameren udvælgelse til CaOV3 cellelinje blev udført under anvendelse af den samme protokol, men en 1 minutters trypsinbehandling trin blev anvendt til at suspendere cellerne før tilsætning i pools. Supplerende data S1 og S2 indeholder CLUSTAL data for de justeringer af hvert valg (endelig pool)

Affinity undersøgelser:. Flowcytofluorimetrisk analyse til bestemmelse af bindingsaffinitet

For at bestemme de bindingsaffiniteter aptamererne, målcellerne (5 x 10

5) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af 5′-biotinmærkede aptamerer på is i 20 min i 100 pi BB. Celler blev derefter vasket to gange med 500 pi BB og suspenderet i 100 pi BB indeholdende streptavidin-PE-Cy5.5. Celler blev derefter vasket to gange med 500 pi WB, og blev suspenderet i 200 pi BB til flowcytometrisk analyse, ved anvendelse af en 5′-biotin-mærket random sekvens som den negative kontrol. Alle forsøgene for binding assays blev gentaget mindst 2 gange. Den specifikke binding intensitet blev beregnet ved subtraktion af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af baggrunden bindende ved gennemsnitlige fluorescensintensitet af aptamerer. Ligevægtsdissociationskonstanten (K

d) af det fluorescerende ligand blev opnået ved at tilpasse en afbildning af den specifikke binding intensitet versus (Y) aptameren fusion (X) til ligningen Y = B

maxX /(K

d + X) under anvendelse af SigmaPlot. (Jandel, San Rafael, CA). Supplerende data S3 indeholder flow data for alle eksperimenter præsenteret i denne artikel.

selektivitet og specificitet

For at bestemme cellens specificitet af de udvalgte aptamerer, cellelinjer, herunder HeLa, K562, H23, H69 , A172, HL-60. HT-29, blev Ramos og CEM anvendes i bindingsassays ved flowcytometri som beskrevet ovenfor.

Virkning af temperatur på aptamer binding

aptamer udvælgelsesprocessen og alle de bindingsassays blev udført på is. Det er blevet observeret, at nogle af de udvalgte ved lavere temperaturer aptamerer ikke kan binde godt ved 37 ° C [26], hvilket fører til dårlige resultater under fysiologiske betingelser. For at verificere bindende stabilitet blev aptamerer inkuberet med målet ved 37 ° C, og fluorescensintensiteten blev bestemt ved flowcytometri. Aptamerer inkuberet på is blev anvendt som den positive kontrol.

Protease fordøjelse assay

Målceller (5 x 10

5) blev frigjort under anvendelse af ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning. Efter resuspension blev cellerne vasket med 3 ml PBS og derefter inkuberet med 1 ml 0,05% trypsin /0,53 mM EDTA i HBSS eller 0,1 mg /ml proteinase K i PBS ved 37 ° C i 1, 5, 15, 30 og 60 minutter. Pure FBS blev tilsat for at standse proteinaserne. Efter vask med 2 ml BB blev de behandlede celler bruges til at binde analyser som beskrevet ovenfor.

Støtte Information

data S1.

Allignment af den endelige TOV pool

doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s001

(1,13 MB TXT)

data S2.

Allignment af den endelige CaOV3 pool

doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s002

(0,20 MB TXT)

data S3.

Denne fil indeholder flow data fra tallene i denne artikel

doi:. 10,1371 /journal.pone.0013770.s003

(3,69 MB ZIP)

data S4.

Legend til mængden af ​​plusser. Dette tal var vores retningslinje for at bestemme mængden af ​​plusser til tabel 3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0013770.s004

(0,04 MB PDF)

Tak

Vi takker Drs. Parag Parekh og Tahir Bayrac for de mange nyttige videnskabelige diskussioner, der bidrog til dette arbejde, Mr. George Ansoaunoor for teknisk hjælp. Vi takker også Dr. Kathryn Williams for hendes kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi takker DNA-sekventering kerne, ICBR, ved University of Florida.