PLoS ONE: Rosamines Målretning Cancer oxidative fosforylering Pathway

Abstrakt

Omprogrammering af energi metabolisme er afgørende for kræft, så mitokondrier er potentielle mål for anticancer-terapi. En tidligere undersøgelse har vist anti-proliferative aktivitet af en ny klasse af mitochondrier målretning rosamines. Nærværende undersøgelse beskriver

in vitro

cytotoksicitet af anden generation rosamine analoger, deres virkemåde, og deres

in vivo

effektiviteter i en tumor allografted musemodel. Her viste vi, at disse forbindelser udviste potent cytotoksicitet (gennemsnit IC

50 0,5 uM), inhiberede Complex II og ATP syntase aktiviteter mitokondriske oxidative phosphorylering pathway og inducerede tab af mitokondrie transmembranpotentiale. A NCI-60 cellelinjer skærmen yderligere angivet, at rosamine analoger 4 og 5 udviste potente antiproliferative effekter med Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 uM) og var mere effektiv mod en kolorektal cancer under-pladen end andre cellelinjer. Indledende

in vivo Salg undersøgelser af 4T1 murine brystcancer-bærende BALB /c-mus viste, at behandling med analog 5 i samme dosering på 5 mg /kg eller en tidsplan dosering på 3 mg /kg én gang hver 2 dage til 6 gange (q2d × 6) udviste kun minimal induktion forsinkelse tumorvækst. Vores resultater tyder på, at rosamine analoger kan videreudvikles som mitokondrie målretning agenter. Uden tvivl skal udformes for at forbedre tumor optagelse af rosamines, dvs. integration til bærermolekyler for bedre terapeutisk resultat ordentlig strategier

Henvisning:. Lim SH, Wu L, Kiew LV, Chung LY, Burgess K, Lee HB (2014) Rosamines Målretning Cancer oxidative fosforylering Pathway. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10,1371 /journal.pone.0082934

Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada

Modtaget: Juni 13, 2013; Accepteret: 30 Oktober 2013; Udgivet: 12 marts 2014

Copyright: © 2014 Lim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Cancer Research initiativer Foundation, Malaysia Ministeriet for Højere uddannelse s HIR-Mohe tilskud (UM.C /625/1 /HIR /MOHE /mED /17 og UM.C /625/1 /HIR /MOHE /mED /33), Universiti Malaya post Graduate Research Grant (PS204 /2010b), og ved tilskud til KB fra National Institutes of Health (GM087981) og Robert A. Welch Foundation (A-1121). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Konventionel cancer kemoterapi afhænger af lægemidler, der virker ved at afbryde DNA-replikation, dvs. ved at hæmme syntesen eller funktionen af ​​nye nukleinsyrer materialer, eller ved at forårsage uoprettelig skade på vitale nukleinsyrer gennem indlejring, alkylering eller enzymatisk hæmning. Mangel på selektivitet for neoplastiske celler udstillet af disse stoffer begrænser typisk deres succes som behandlingsmidler. Moderne kemoterapeutiske strategier, der er målrettet signalveje eller særlige genprodukter tendens til at være begrænset til cancere, der drives af en dominerende onkogen og er ofte sårbare over for resistens via mangfoldigheden af ​​tumorigenese signalveje [1]. For eksempel er de fleste af HER-2 positiv metastatisk brystkræft patienter, der initialt responderede på behandling med trastuzumab udvikle sekundær trastuzumab resistens inden for et år efter behandlingen begyndte [2]. Der er gjort lignende observationer for BRAF målrettet vemurafenib for melanom terapi [3] og EGFR-målrettet gefitinib eller erlotinib til behandling af ikke-småcellet lungecancer [4].

En relativt nyt alternativ til at målrette DNA og enzymer i hurtigt prolifererende celler, eller specifikke signalveje er at fokusere på organeller såsom mitokondrier. Mitokondrier er de energi generatorer, der opretholder celle liv og essentielle cellefunktioner, herunder flere signalering kaskader, der regulerer celler, for eksempel, stofskifte, cellecykluskontrol, udvikling og celledød [5]. I cancerkemoterapi, mitokondrier målretning medicin forstyrrer cancercellelinjer metabolismer ved pertubing mitokondrie transmembranpotentiale, inhibering af elektron redox kæde-komplekser, interfererende mitokondrier transmembrane permeabilitet, og målretning mitokondrie-DNA [6],. De mest almindelige typer af mitochondrier målretning narkotika er lipofile, kationiske lægemidler; disse er selektive for cancerceller, fordi de har tendens til at have højere mitokondriske membranpotentialer end normale epitelceller [8], [9].

Vi har tidligere rapporteret struktur-aktivitets-relationer (SAR) for anticancer egenskaber ved et række rosamines (fig. 1A) [10], [11]. Disse forbindelser er delokaliserede lipofile kationer (DLC) med perifere cykliske aminer og forskellige grupper i

meso

position; de fleste af disse kationer, er betydeligt mere potent end rhodamin-123, som er en velundersøgte delokaliserede lipofile kation. Konsistens med dette, SAR data for rosamines foreslog gode kræfter korreleret med hydrofobe cykliske aminer og

meso

-aryl substituenter. Thiofuryl og 4-iodphenyl

meso

substitution svarede til ca. 5 gange forbedring i styrke sammenlignet med phenyl-substitution. Derudover data viste, at signifikant lavere IC

50 værdier blev opnået for asymmetriske forbindelser (X

1 ikke samme som X

2), men kombinationen af ​​usymmetriske amin substituenter med thiofuryl og 4-iodphenyl

meso

substitution blev ikke undersøgt. Intracellulær imaging på repræsentative eksempler angivet disse forbindelser ophobes i mitokondrierne. Disse forbindelser (dvs. rosamine 2 og 5) er også fundet at være mere cytotoksisk over for cancerceller sammenlignet med immortaliserede normale epitelceller i samme organ typen [10].

(A) af de rosamine farvestoffer forskelligt funktionaliseret ved

meso

position som tidligere rapporteret af Lim et al. (Anticancer Drugs 2009, 20: 461-468), de er vist her med

meso

dem – thiofuran eller 4-iodphenyl havde overlegne anticancer aktiviteter i cellulære assays. (B) Anden generation mål med i dette arbejde

blev foretaget Forskningen rapporterede her for at sondere, hvordan to molekylære modifikationer påvirker cytotoksiciteter i denne serie:. (I) udskiftning af

para

iod eller thiofuran grupper med andre

para

halogenid eller furan grupper; og, (ii) kombination af thiofuryl og 4-iodphenyl

meso

substitution med piperidin /morpholin kombinationer. rapporterer vi således synteser af andengenerations rosamines (fig. 1B) og deres cytotoksiciteter forhold til et panel af cellelinjer fra solide tumorer. Forbindelser med lovende aktivitet blev yderligere evalueret i tumorcelle skærm NCI-60 humane linier. Udvalgte rosamines blev også undersøgt for deres virkning på cellulære redox-systemer og for effekter i en

in vivo

tumor model.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller gennemgået og godkendt af Dr. Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Laboratory Animal Centre (LAC) Animal Care og brug Udvalg medicinske fakultet, University of Malaya (referencenummer FAR /14/07 /2010 /LSH). BALB /c-mus i alderen 6-8 uger med en vægt på mindst 17 g blev holdt i et kontrolleret miljø af 12 timers lys-mørke cykler med fri adgang til foder (standard pellet diæt købt fra Altromin International, Lage, Tyskland) og renset vand. Hunmus blev anvendt, fordi den hormonale miljø afgørende for udvikling af implanterede 4TI musebrystcarcinom ville være til stede.

Materialer

Minimum essential medium med Earls salt og L-glutamin, RPMI 1640-medium med L -glutamine, føtalt bovint serum, Pen-Strep (10 000 U /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin), trypsin 10 × blev leveret af GIBCO, Invitrogen (Auckland, New Zealand). JC-1 blev erhvervet fra Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, USA). Dimethylsulfoxid (DMSO), saltsyre 37%, polyethylenglycol 400 (PEG 400) og 2-propanol blev indkøbt fra Merck (Hohenbrunn, Tyskland). Ethylenglycol

bis

(aminoethylether) –

tetra

eddikesyre (EGTA), ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 3 – (

N

-morpholino) propansulfonsyre (MOPS ), blev kaliumchlorid, kaliumdihydrogenorthophosphat, natriumchlorid, natriumhydrogencarbonat, dinatriumhydrogenorthophosphat vandfri, saccharose og Tris købt Fisher Scientific (Leicestershire, UK). Thiazoyl tetrazolium (MTT) blev indkøbt fra Amresco (Ohio, USA). Saltvand (0,9% natriumchlorid) blev opnået fra Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Malaysia). Carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) blev indkøbt fra Sigma (Steinheim, Tyskland). Proteinassay farvereagens koncentrat blev opnået fra Bio-Rad Laboratories (Californien, USA). Kompleks I, kompleks II, blev kompleks IV og ATP syntase enzymaktivitet mikroplade assaykit indkøbt fra MitoSciences (Oregon, USA).

Synteser af Rosamine Analoger

Rosamines blev syntetiseret og oprenset som tidligere beskrevet [11]. Udgangsmaterialet med xanthone ditriflate blev fremstillet i opløsning ved triflering af phenoler efterfulgt af animation af triflatet med piperidin til opnåelse af symmetriske cykliske aminer substitution (fig. 2A) eller ved trinvis tilsætning af piperidin og morpholin, hvilket gav usymmetrisk cykliske aminer substitution ( fig. 2B) [11]. Den resulterende 3,6-diamino-xanthen-9-on omsat med organolithiumreagenser eller Grignard-reagenser til dannelse af de ønskede rosamine strukturer.

(A) Udgangsmaterialet med xanthone ditriflate blev fremstillet i opløsning ved triflering af phenoler efterfulgt af animation af triflatet med piperidin til opnåelse af symmetriske cykliske aminer substitution eller; (B) ved trinvis tilsætning af piperidin og morpholin, hvilket gav usymmetrisk cykliske aminer substitution.

Generelt blev et Grignard-reagens eller lithium-reagens (1,0 mmol) tilsat dråbevis i løbet af 1 minut til opløsning af 0,2 mmol 3,6-diamino-xanthen-9-on i 5 ml THF ved 0 ° C. Reaktionsblandingen blev omrørt i 12 timer ved stuetemperatur. Efter færdiggørelse af reaktionen blev 2 ml 2 M vandig HCI tilsat, omrørt i 10 minutter for at standse reaktionen og fortyndet med 20 ml CH

2Cl

2. Det organiske lag blev vasket med vand og saltvand, tørret over vandfrit Na

2SO

4 og koncentreret under reduceret tryk. Resten blev oprenset ved flashkromatografi (5% til 10% MeOH /CH

2Cl

2) til opnåelse af rent produkt.

spektraldata for de syntetiserede forbindelser er anført her undtagen syntesen og var som tidligere rapporteret spektrale data for rosamines 1, 2 og 5 [11]. De er opkaldt nedenfor på en måde, der beskriver

meso-

substituenter og påtager forbindelsen er symmetrisk medmindre andet er angivet.

4-Brombenzen Rosamine 3.

1H NMR (300 MHz, CDC

3) δ 7,72 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,27-7,21 (m, 4H), 7,09 (dd, 2H,

J

= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2H,

J

= 2,6 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);

13C NMR (75 MHz, CDC

3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0; λ

max abs 570 nm, λ

max emiss 590 nm, ε 110.800 M

-1 cm

-1, FWHM 38 nm, Φ 0,78 ± 0,02 i CH

2Cl

2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)

+ C

29H

30BrN

2O 501,1542; fundet 501,1539.

4-Chlorbenzen Rosamine 4.

1H NMR (300 MHz, CDC

3) δ 7,56 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2H,

J

= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2H,

J

= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2H,

J

= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2H,

J

= 2,4 Hz), 3,74-3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);

13C NMR (125 MHz, CDC

3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1; λ

max abs 570 nm, λ

max emiss 590 nm, ε 119.100 M

-1 cm

-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 i CH

2Cl

2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)

+ C

29H

30ClN

2O 457,2047; fundet 457,2052.

Furan Rosamine 6.

1H NMR (500 MHz, CDC

3) δ 7,97 (d, 2H,

J

= 9,7 Hz), 7,92-7,91 (m, 1H), 7,18 (dd, 2H,

J

= 9,7, 2,6 Hz), 7,15-7,14 (m, 1 H), 6,90 (d, 2H,

J

= 2,6 Hz), 6,82-6,81 (m, 1H), 3,74-3,72 (m, 8H), 1,76 (br, 12H);

13C NMR (125 MHz, CDC

3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1; λ

max abs 592 nm, λ

max emiss 627 nm, ε 86900 M

-1 cm

-1, FWHM 105 nm, Φ 0,38 ± 0,01 i CH

2Cl

2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)

+ C

27H

29N

2O

2 413,2229; fundet 413,2232.

asymmetrisk 4-Iodophenyl Rosamine 7.

1H NMR (300 MHz, CDC

3) δ 7,96 (d, 2H,

J

= 8,3 Hz), 7,35-7,29 (m, 2H), 7,17-7,09 (m, 6H), 3,88 (t, 4H,

J

= 4,7 Hz), 3,78-3,71 (m, 8H) , 1,77 (br, 6H);

13C NMR (75 MHz, CDC

3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66,4, 49,5, 47,4, 26,1, 24,0; λ

max abs 565 nm, λ

max emiss 586 nm, ε 80.900 M

-1 cm

-1, FWHM 39 nm, Φ 0,52 ± 0,02 i CH

2Cl

2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)

+ C

28H

28in

2O

2 551,1195; fundet 551,1192.

usymmetrisk Thiofuryl Rosamine 8.

1H NMR (500 MHz, CDC

3) δ 7,69 (dd, 1H,

J

= 4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1 H,

J

= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1 H,

J

= 9,7 Hz), 7,26-7,22 (m, 2H) , 7,19 (dd, 1 H,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1 H,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1 H,

J

= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1 H,

J

= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4H,

J

= 4,9 Hz), 3,68-3,65 (m , 8H), 1,67 (br, 6H);

13C NMR (75 MHz, CDC

3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (to toppe: 130,62, 130.56), 128,2, 115,2, 114,6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9; λ

max abs 576 nm, λ

max emiss 599 nm, ε 87600 M

-1 cm

-1, FWHM 42 nm, Φ 0,30 ± 0,01 i CH

2Cl

2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)

+ C

26H

27N

2O

2S 431,1793; fundet 431,1795.

Cell Kultur og

In Vitro

Cell Levedygtighed Assay

MCF-7 mammacancer og HCT-116 coloncarcinom cellelinjer blev opnået fra American Tissue Culture Collection ( Virginia, USA) og opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS. HSC-2 mundhulen humane skællede carcinomceller blev opnået fra Health Science Research Resources Bank (Japan). HK-1, en tidligere karakteriserede nasopharyngeale skællede carcinomceller [12] er en gave fra Prof. Wong Y.C. fra University of Hong Kong. Begge cellelinier blev dyrket i MEM-medium suppleret med 10% FBS. For celleviabilitetstest, celler ved 4000 celler /brønd i 80 pi medium blev inokuleret i 96-brønds plader og fik lov at adhærere natten over. Celler blev derefter behandlet med hver forbindelse ved koncentrationer i området fra 0,001-10 uM giver det endelige volumen på 100 pi i hver brønd. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden, 15 pi 5,0 mg /ml MTT i phosphatpufret saltvand (PBS) blev tilsat og inkuberet i 4 timer. Medium og overdreven MTT blev aspireret, og den resulterende formazan blev solubiliseret med 100 pi dimethylsulfoxid. Absorbans blev aflæst ved 570 nm med SpectraMax M4 mikroplade-spektrofotometer (Molecular Devices, CA).

NCI-60 human tumorcellelinie Screen

NCI-60 celle panel screening blev udført ved NCI /National Institutes of Health udviklingsmæssige terapi program (Bethesda, USA). Denne platform muliggør bestemmelse af vækstinhiberende profiler af testforbindelser på 60 forskellige humane cancercellelinier, der repræsenterer leukæmi, melanom og kræft i lunge, colon, centralnervesystemet, ovarie, bryst, prostata, og renal underpanel. Sulforhodamin B-assay blev anvendt til at vurdere cytotoksiciteten af ​​testmidler i et panel af 60 cellelinier [13]. Kort fortalt blev humane tumorcellelinjer af panelet cancer screening dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 5% FBS og 2 mM L-glutamin. For en typisk screening eksperiment blev celler podet i mikrotiterplader med 96 brønde i 100 pi ved plating densiteter afhængig af fordoblingstiden for individuelle cellelinier. Efter celle inokulering mikrotiterpladerne inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 og 100% relativ fugtighed i 24 timer. Efter inkubation blev portioner på 100 pi af forbindelse ved forskellige fortyndinger tilsat til de passende mikrotiterbrønde og blev yderligere inkuberet i 48 timer. Ved assayet endepunkt blev celler fikseret med trichloreddikesyre efterfulgt af sulforhodamin B farvning for cellulære proteinindhold. Sulforhodamin B absorbans blev aflæst ved en bølgelængde på 515 nm som en måling af celledensitet.

Mitokondrier Isolering og detergentsolubilisering

Funktionelle mitokondrier blev isoleret fra muselever ved differentiel centrifugering metode [14]. Kort beskrevet blev en mus (-30 g) sultet natten over, inden aflivet ved cervikal dislokation. Leveren blev høstet hurtigt og skyllet med iskold mitokondrier isolation buffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA /Tris, 0,2 M saccharose, pH 7,4) indtil blod-fri. Leveren blev derefter skåret i små stykker i et bægerglas med en saks og samtidig holde i et is-bad. Bufferen blev udskiftet med 5 ml frisk isolation puffer og leveren blev homogeniseret med en Polytron probe (Ultra-Turrax T8, Ika-Werke, Tyskland) indtil glat. Homogenatet blev centrifugeret ved 1000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Pelleten blev kasseret, og supernatanten blev centrifugeret ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ° C for at pelletere mitokondrier. Mitokondrier blev vasket to gange ved resuspendering i 4 volumener isolation buffer indeholdende 1 × protease cocktail inhibitor. Koncentrationen af ​​det mitokondrielle protein blev bestemt under anvendelse af Bradford (Biorad protein assay) metode. Mitokondrier blev frosset i 10 mg /ml portion ved -80 ° C.

detergentsolubilisering af mitokondrierne proteinerne blev gjort forud for måling af den oxidative phosphorylering komplekser aktivitet. Mitokondrier blev fortyndet til 5,5 mg /ml med PBS og opløst ved tilsætning af en 1 /10th volumen af ​​detergent tilvejebragt for at give den endelige proteinkoncentration på 5 mg /ml. Blandingen blev inkuberet på is i 30 minutter og centrifugeret ved 17 000 g ved 4 ° C i 20 min. Supernatanten blev opsamlet og fortyndet til passende koncentration for hver oxidative fosforylering komplekser aktivitet.

Måling af oxidative fosforylering komplekser Aktivitet

Målinger af mitokondrier oxidative fosforylering aktiviteter for Complex I, II, IV og ATP- syntase blev udført under anvendelse af mikroplade immunocapture ELISA-assay kit ifølge deres respektive producentens protokoller [15]. Generelt plade præ-coatet med passende immunocapture antistof blev inkuberet med mitokondrier ekstrakt ved anbefalet koncentration at tillade immobilisering af deres respektive komplekser. Komplekser aktivitet blev målt ved tilsætning af substrater opløsning mix tilvejebragt af kittet og forbindelse blev tilsat ved koncentration i området fra 0,01-10 pM i tre eksemplarer. Kontrolbrønde behandlet med kun 0,1% DMSO (v /v) og brønde uden mitokondrier ekstrakt inkubation blev inkluderet som referenceramme. Den kinetiske af komplekser aktivitet blev optaget med SpectraMax M4 mikroplade spektrofotometer læser ved hjælp af de foreslåede parametre måling.

JC-1 Analyse af mitokondrie Membrane Potential

mitochondriemembranpotential blev målt baseret på den potentielle -afhængige akkumulering af den kationiske JC-1 farvestof, som resulterer i en forskydning af fluorescensemission fra grøn (~525 nm) til rød (~590 nm) på grund af dannelsen af ​​J-aggregater [16]. Derfor er mitokondrie depolarisering indikeret ved et fald i rød /grøn fluorescensintensitet ratio. Kort beskrevet blev celler opsamlet og suspenderet i 1 ml varm medier ved ca. 1 × 10

6 celle /ml. I et kontrolrør, blev 1 pi 50 mM CCCP tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 5 min. Derefter blev 10 pi 200 pM JC-1 tilføjet i cellerne og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Celler blev vasket to gange med varm PBS, resuspenderet i 500 pi PBS og analyseret på en FACSCalibur flowcytometer hjælp 488 nm excitation med 530/30 nm og 585/42 nm båndpas emissionsfiltre.

In vivo

antitumorvirkning

Tumor allotransplantater blev igangsat ved subkutan injektion af 5 x 10

5 4T1 musebrystcarcinom i 0,1 ml RPMI 1640 medier i lyske yverfedt-puder af mus [17]. Tumorvækst blev overvåget og behandlinger blev initieret, når tumorerne nåede volumen på ca. 200 mm

3. For at vurdere tumorvækstinhibering blev 4T1-tumorbærende mus randomiseret i grupper med mindst otte dyr per gruppe. Forbindelse 5 blev fremstillet ved 0,3 mg /ml i normalt saltvand og behandling blev administreret intravenøst ​​med 5 mg /kg på mellemstationer dag eller 3 mg /kg hver anden dag i seks behandlinger (Q2Dx6). For kontrolgruppen, blev den normale saltvand givet. dyr vægte og tumor volumen Den blev målt tre gange om ugen i 14 d. Tumorvolumenet blev beregnet ved anvendelse af ligningen: (længde x bredde

2) /2 og relativ tumorvolumen (RTV) blev beregnet for hver tumorvolumen på et givet tidspunkt (V

T) mod tumorvolumenet på mellemstationer dag (V

0) ved hjælp af ligningen: V

T /V

0. RTV – tidsprofil for hver gruppe blev afbildet og tumorvækstforsinkelse med at nå et bestemt antal fordoblinger sammenlignet med kontrol blev bestemt [18], [19]. Resultaterne blev udtrykt som median ± 95% konfidensinterval (n = 8).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA

post hoc

med Bonferroni-test (SPSS 16.0, IBM Corporation, Armonk, NY) og forskel blev betragtet som signifikante, når

P

. 0,05

Resultater og diskussion

Rosamine analoger

Vores tidligere undersøgelse indikerede strukturer

meso

substitueret med 4-iodbenzen 2 og thiofuran 5 blev 5 gange mere aktiv end phenyl substitueret forbindelse 1. Forbindelser 3, 4 og 6 blev syntetiseret til at teste, om

meso

-replacement med 4-brombenzen 3, 4-chlorbenzen 4 eller 2-furyl 6 grupper vil påvirke anticanceraktivitet. Derudover er 4-iodbenzen 7 eller 2-thiofuran

meso Salg substituenter 8

og Salg usymmetriske piperidin /morfin amin substituenter blev syntetiseret og undersøgt. Rosamines 1-4 og 7 ikke var mærkbart vandopløselige, så de blev rekonstitueret i DMSO ved 10 mM som behandling lager. Rosamines 5, 6 og 8 blev let opløst i vandige medier ved lignende koncentrationer, så blev anvendt uden DMSO.

In Vitro

antitumorvirkningen af ​​Rosamine og NCI-60 Screen

in vitro

antitumoraktivitet rosamines blev vurderet under anvendelse af en 48 h endpoint cellelevedygtighed methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) assay mod et panel af solide humane tumorcellelinier, herunder brystcarcinom (MCF-7), colon carcinom (HCT-116), oral pladecellecarcinom (HSC-2) og nasopharyngeal carcinom (HK-1). IC

50 værdier for disse rosamines over panel af cancercellelinjer testet varierede fra 0.07-1.2 pM som opsummeret i tabel 1. Fra denne undersøgelse, rosamines bærer phenyl halogenid eller heterocykliske dele var signifikant (

P

0,05) mere potent end phenylsubstitueret rosamine 1. halogenid substitution resulterede i en forbedring af cytotoksicitet; dette var forventet, fordi udskiftningen af ​​

H

efter halogenid almindeligvis bruges til at øge forbindelse lipofilicitet, der forbedrer membranpermeabilitet lipid-dobbeltlag [20]. Inden for halogenid serien, cytotoksiciteter stige i følgende rækkefølge 4 3 2 (Cl br I), men ikke statistisk signifikant (

P

0,05). Forbindelserne med

meso

heterocyklisk substituenter 5 og 6 var mere potente end de aromatiske halogenider 2-4. Af de to forbindelser med

meso

-heterocycles den thiofuran-substituerede 5 var lidt mere aktiv end 6, furan-substituerede én.

Forbindelser 7 og 8 har en mere polær kombination af amin substituenter end den symmetriske

bis

piperidin 2, og de viste sig at være mere cytotoksisk (tabel 1). Dette er i overensstemmelse med vore tidligere data for 2-methylbenzenes usymmetrisk substituerede med piperidin og morpholin som viste næsten 2 gange lavere IC

50 værdier i forhold til den symmetriske hydrofobe struktur, der indeholder kun piperidin [10]. I mellemtiden for

meso

-thiofuran 5, substitution af en af ​​de piperidingrupper med morfolin giver 8, som har en lidt

faldt

aktivitet, i modsætning til vores forventninger.

Rosamines kan udvise fototoksicitet grund generering af reaktive oxygenspecies i nærvær af lys. For at teste for dette blev en duplikat plade bestrålet med 5,3 J /cm

2 af bredspektret lys i 2 timer efter behandling med forbindelsen parallelt med en plade holdes i mørke. Der var ingen signifikante forskelle i IC

50 værdier opnået mellem begge bestrålede og ikke-bestrålede eksperimenter (data ikke vist), hvilket indikerer fototoksicitet var ikke et problem.

På baggrund af ovenstående resultater, rosamines 4 ( NSC751819) og 5 (NSC751817) blev fremlagt for NIC-60 humane tumorcellelinier skærmen for at give flere oplysninger om de væksthæmmende profiler mod 60 forskellige menneskelige kræftceller, der repræsenterer leukæmi, melanom og kræft i lungerne, tyktarmen, centralnervesystem , ovarie, bryst, prostata, og renal undertavle. Denne platform gør det muligt virkningsmekanisme kan udledes ved at sammenligne med lægemiddel-aktivitetsmønstre af standard agenter med kendte målretning egenskaber ved hjælp SAMMENLIGN (edb mønster-genkendelse algoritme) analyser [21]. GI

50 værdier genereret fra skærmen NCI-60 cellelinjer viste, at både rosamine 4 og 5 udviste potente antiproliferative effekter med Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 uM) og var især mere effektivt mod en sub-panel af kolorektale cancercellelinjer (fig. 3). SAMMENLIGN analyser viste, at begge disse rosamines havde lignende mønstre af aktivitet med methyl violet (NSC271967), et kationisk triarylmethanfarvestoffer farvestof, som har været tidligere brugt i medicin for sin antimikrobielle, svampedræbende og antihelmintic egenskaber. Denne klasse af farvestoffer havde vist sig at fremme mitokondrisk respiratorisk inhibering ved inhibering ATP-syntese, sprede mitokondrielle membranpotentiale og inducere mitokondriel permeabilitetsovergang [22], [23]. Således skærm NCI-60 cellelinjer angivet de testede forbindelser havde en signatur unik for energiomsætningen målretning anticancer midler.

GI

50 (50% væksthæmning) gennemsnitlige grafer, der viser aktivitet mønstre af 4, 5 og methyl violet (NSC271967) i NCI-60 cellelinje skærme. Både rosamines udstillet potente antiproliferative effekter med Log

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 uM) og var især mere effektive mod kolorektal cancer panel. SAMMENLIGN analyser angivet 4 og 5 har lignende mønster af aktivitet som methyl violet med Pearson korrelationskoefficient værdier på 0,767 og 0,72, henholdsvis.

Rosamines blandede Energy Redox

Vi har tidligere demonstreret at rosamines primært lokaliseres i mitokondrierne [10] og at akkumulering af cytotoksiske DLC er kendt for at ændre mitochondriske transmembranpotentialer [24], [25]. Således blev ændringer i mitochondriemembranpotential forårsaget af rosamines 2 og 5 overvåget baseret på akkumulering af potentielt afhængige JC-1 farvestof, som resulterede i en forskydning af fluorescensemission fra grøn (~525 nm) til rød (~590 nm) på grund til dannelsen af ​​J-aggregater. Fra undersøgelsen, HSC-2-celler behandlet med 2 ved 0,1 uM, 9% af cellepopulationen udviste indtræden af ​​mitokondrielle transmembranpotentiale tab inden for 1 time efter behandling og gradvist øget til 19% (

P

0,05) i 8 h (Fig. 4). I mellemtiden er den mitokondrielle transmembranpotentiale tab var mere fremtrædende i HSC-2-celler behandlet med 5 ved 0,1 uM. Ca. 21% (

P

0,05) af cellepopulationen var påvirket i den første time, og den procentdel steget drastisk til 34% i 8 timer. For de ubehandlede kontrolceller, populationen af ​​depolariserede celler ved 8 h forblev på ca. 8%. I mellemtiden, celler behandlet med 5 pM af CCCP i 5 minutter resulterede i tab af membranpotentiale i 70% (

P

0,05) af cellepopulationen. CCCP er et oxidativt phosphorylering afkobling stof, som virker som en positiv kontrol for forsøget.

repræsentant tilfælde af mitokondrisk transmembranpotentiale tab i HSC-2-celler behandlet med 2 og 5 ved 0,1 uM. Efter 8 timer af behandling med 2 og 5, den procentdel af cellepopulationen med mitokondrie transmembrane potentielle tab steg til 19% og 34%, hhv. Procentdelen depolariseret celle af ubehandlet kontrol ved 8 h forbliver på 8%, mens den for positiv kontrol, celler behandlet med 5 pM af carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) i 5 min resulterer i 70% depolariseret cellepopulation. * Forskel med

P

-værdi. 0,05 sammenlignet med kontrol ved 0 h

For yderligere at forstå mitokondrier hæmning featured af rosamines, deres effekt på den oxidative fosforylering pathway blev undersøgt . Brug af immunocapture ELISA mikroplade-assay blev enzymkinetik af mitokondrielle redox bærere Complex I, Kompleks II, Kompleks IV og ATP-syntase overvåges ved behandling med 2 eller 5. Aktiviteten af ​​Complex II (fig. 5B) blev delvist inhiberet af 5 med IC

50 værdi på 9,6 ± 0,1 uM mens for 2, hæmning blev observeret, men nåede ikke 50% op til maksimale koncentrationer undersøgt. I mellemtiden, både 2 og 5 viste hæmning af ATP syntase aktiviteter (Fig. 5D) med IC

50 værdier på 3,9 ± 0,3 uM og 3,0 ± 0,8 uM hhv. Aktiviteten af ​​kompleks I og Kompleks IV (fig. 5A og 5C) blev ikke påvirket af de rosamines ved koncentrationer op til den maksimale anvendte 10 uM. Disse data antyder, at rosamines 2 eller 5 kompromis mitochondriale bioenergetik primært ved at hæmme ATP-syntase, et proton-drevet enzym, som producerer ATP fra ADP og uorganisk phosphat. Lignende biokemisk interaktion blev observeret i rhodamin-123, og denne effekt forventes at den sammensatte har tæt strukturel lighed med rosamines [26].

Dosis-respons hæmning af mitokondrie oxidativ fosforylering Complex 1 (A), Complex