PLoS ONE: Cirkulerende Serum miRNA som diagnostiske markører for tarmkræft

Abstrakt

Sigt

Undersøgelsen blev designet til at vurdere muligheden for at anvende cirkulerende miRNA (serum miRNA) som diagnostiske biomarkører i kolorektal cancer (CRC) og identificere deres mulighed som kandidater til målrettet terapi

Metoder

undersøgelsen involverede to prøvesæt:. 1- et træningssæt som omfattede 90 patienter med kolorektal relateret sygdom (30 med CRC, 18 med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), 18 med colon polypper (CP) og 24 med forskellige colon symptomer, men uden nogen coloskopisk abnormitet, der blev indskrevet som kontrolgruppe) og 2 en validering sæt, som omfattede 100 CRC patienter. Serum miRNA blev udvundet fra alle fag til at vurdere udtryk profiler for følgende miRNA (

miR-17

,

miR-18a

,

miR-19a

,

miR-19b

,

miR-20a

,

miR-21

,

miR-146a

,

miR-223

,

miR-24

,

miR-454

,

miR-183

,

miR-135a

,

miR- 135b og miR- 92a

) ved hjælp af brugerdefinerede miScript miRNA PCR-baseret sybergreen array. Arealet under modtageren opererer karakteristik kurven (AUC) blev anvendt til at evaluere den diagnostiske ydeevne af de undersøgte miRNA for kolorektal cancer diagnose.

Resultater

Data analyse af miRNA fra træningssættet viste, at ; sammenlignet med kontrolgruppen, kun

miR-19b

var signifikant opreguleret hos patienter med IBD gruppe (fold ændring = 5.24, p = 0,016), mens patienter med colon polypper,

miR-18a

var signifikant opreguleret (fold ændring = 3,49, p-værdi = 0,018). På den anden side,

miR-17

,

miR-19a

,

miR-20a og

miR-223

var signifikant opreguleret ( fold ændring = 2,35, 3,07, 2,38 og 10,35, henholdsvis og p-værdi = 0,02, 0,015, 0,017 og 0,016;. henholdsvis CRC patienter valideringen sæt viste imidlertid, at kun

miR-223

var betydeligt op -regulated i CRC patienter (fold ændring = 4,06, p-værdi = 0,04).

Konklusion

Aberrant miRNA udtryk er stærkt involveret i den kaskade af kolorektal carcinogenese. Vi har fundet, at (

mIR-17

,

mIR-19a

,

mIR-20a og mIR-223

) kan anvendes som diagnostiske biomarkører for CRC. på den anden side,

miR-19b

miR-18a

kunne anvendes som diagnostiske biomarkører for CP og IBD henholdsvis

Henvisning:. Zekri A-RN, Youssef ASE-D, Lotfy MM, Gabr R, Ahmed OS, Nassar A, et al (2016) cirkulerende Serum miRNA som diagnostiske markører for tarmkræft PLoS ONE 11 (5):.. e0154130 doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, UNITED STATES

modtaget: november 8, 2015; Accepteret: April 10, 2016; Udgivet: Maj 2, 2016

Copyright: © 2016 Zekri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Data tilgængelig fra figshare på følgende link: https://figshare.com/articles/Circulating_serum_miRNAs_as_diagnostic_markers_for_colorectal_cancer/3084625.

Funding: Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af de mest almindelige maligne neoplasmer i hele verden, er den anden hos kvinder og den tredje i mænd med 1,2 millioner årlige nye tilfælde på verdensplan [1]. Trods den øgede bevidsthed samt forbedrede anbefalinger og teknikker screening, CRC fortsat den næststørste årsag til kræft dødsfald hos mænd og kvinder [2] og være ansvarlig for 10% af kræft- mortalitet verdensplan [3].

Det er tidligere blevet behandlet, at patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er normalt forbundet med en øget risiko for progression til epitel- dysplasi og CRC [4, 5].

miRNA repræsenterer en interessant klasse af små (18-25 nukleotider lang) ikke-kodende RNA’er, der virker som posttranskriptionel regulatorer af genekspression gennem binding til de 3`untranslated regioner (UTR) af mål-mRNA’erne og fremme mRNA nedbrydning eller translationel undertrykkelse [6]. Den omstændighed, at miRNA spiller en rolle i cancer biologi blev understøttet ved at finde, at mere end 50% af miRNA gener er placeret på de skrøbelige steder og regioner deletion eller amplificeringer, der er ændret i forskellige typer af human cancer [7]. Kumulative beviser indikerer, at nogle miRNA kan opføre sig enten som oncomirs eller tumorsuppressorgener i kaskaden af ​​CRC.Therefore, de besidder potentiale til anvendelse som diagnostiske, prognostiske eller terapeutiske tumormarkører [8]. Salg

Forskellige undersøgelser har rapporteret væsentlige ændringer af miRNA ekspressionsniveauerne i CRC væv i forhold til normal colon epitel, og identificerede grupper af miRNA, der muliggør prognostiske lagdeling af CRC patienter [9]. I denne sammenhæng forøget ekspression af mange miRNA, der medierer cellevækst og tumor progression, blev rapporteret i blodet og /eller væv af CRC sager ved hjælp af en miRNA microarray analyse,

inkluderet miR-20

,

miR-21

,

miR-17-5p

,

miR-15b

,

miR-181b

,

miR-191 og miR-200c

[10, 11]. Tilstedeværelsen af ​​miRNA i serum, plasma og andre legemsvæsker, såsom urin, spyt, og fostervand tilskyndes miRNA forskning siden dette letter deres påvisning og gør dem ideelle kandidater som ikke-invasive biomarkører for tidlig påvisning og overvågning sygdomsprogression [12].

Formålet med den aktuelle undersøgelse er at vurdere den rolle, afvigende miRNA udtryk i udvikling og progression af CRC tilfælde. Dette blev opnået ved at studere ekspressionsniveauerne af 14 miRNA på forskellige stadier af colorektal carcinogenese kaskade. Den rationelle for udvælgelse af undersøgte 14 miRNA var baseret på tidligere referencer, som illustrerede deres rolle i kolorektal carcinogenese (S1 tabel).

Patienter og metoder

Study Design

To uafhængige prøvesæt blev inkluderet i denne undersøgelse (den indstillede uddannelse og validering sæt). Uddannelsen sæt omfattede 90 patienter, der deltog i mave-endoskopi enhed af den tropemedicin afdeling, Kasr El-Aini School of Medicine, Kairo Universitet; i perioden fra januar 2011 til marts 2012. Baseret på coloskopisk resultater og histopatologisk undersøgelse af de undersøgte tilfælde blev patienterne inddeles i fire grupper; 30 patienter med CRC, 18 med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), 18 med colon polypper (CP) og 24 med forskellige colon symptomer, men uden nogen coloskopisk abnormitet, der tjente som kontrolgruppe. Valideringen sæt omfattede 100 CRC sager, som blev diagnosticeret og behandlet National Cancer Institute, Cairo Universitet i perioden fra januar 2013 til marts 2014. Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient efter godkendelsen af ​​de etiske udvalg i NCI ( National Cancer Institute), Kairo Universitet. IRB medlemmer er professor Ahmed Morsi Mostafa, prodekan for videregående uddannelse og forskning; Prof.Wahid Yousry, leder af Kirurgisk Oncology Dept .; Prof. Emad El-Gemaei, chef for Patologi Dept .; Prof. Rabab Gaafar, chef for Medicinsk Onkologi Dept .; Prof. Mahmoud El Gebaly, chef for Klinisk Patologi Dept .; Prof. Mervat El Nagar, chef for strålebehandling Dept .; Prof. Sabry Shaarawy, leder af Cancer Biology Dept .; Prof. Ikram Hamed, leder af radiodiagnose Dept .; Prof. Mai Helali, leder af Anathesia og smerte kontrol Dept .; Prof. Nelly Hassan, leder af Cancer Epidemiologi og Biostatistik Dept.and Dr. Atef Badran, Senior Klinisk Data Manager. Organisation No.IORG0003381. IRB NO.IRB00004025.

Serumprøver samling

Fra hver patient og kontrol emne, blev 5 ml veneblod opnået og centrifugeret, og serummet blev fraskilt. Alle serumprøver blev lagret ved -80 ° C indtil anvendelse.

RNA-ekstraktion og QRT-PCR

Total RNA herunder miRNA blev ekstraheret fra sera under anvendelse af miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland, kat . No.217004). Ifølge producentens instruktioner, blev c-DNA Synthesis udført under anvendelse miScript II RT (Qiagen, Cat. No.218161). Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) blev udført under anvendelse miScript syber grøn PCR-kittet (Qiagen, Cat. No.218075). Gene udtryk profiler blev genereret i 96-brønds arrays ved hjælp af brugerdefinerede miScript miRNA PCR array til følgende microRNA (

miR-17

,

miR-18a

,

miR-19a

,

miR-19b

,

miR-20a

,

miR-21

,

miR-146a

,

miR-223

,

miR-24

,

miR-454

,

miR-183

,

miR- 135a

,

miR- 135b og miR – 92a

)

(Qiagen, katalog nr CM1HS0064C) ifølge fabrikanternes instruktioner som følger: 15 minutter ved 95 ° C i 1 cyklus, 15s ved 94 ° C, 30s ved 55 ° C. , og 30’erne ved 70 ° C i 40 cykler ved hjælp af AB 7500 Fast Real-Time PCR-system. Threshold cycle data blev analyseret ved anvendelse af RT2 Profiler-software (version 3.4; SABiosciences). Relative genekspressionsniveauer blev normaliseret til housekeeping-gen (SNORD 68) og folden ændringer af target genet (er) ekspression forhold til dem for kontrolgruppen blev analyseret af 2-ΔΔCT metode.

Statistisk analyse

den relative udtryk for miRNA blev analyseret ved hjælp SABiosciences software og p-værdien blev beregnet på grundlag af en t-test af replikat 2 ^ (- Delta Ct) værdier for hvert gen i kontrol- og behandlingsgruppen. P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Receiver-drifts–karakteristik (ROC) kurver og arealet under kurven (AUC) blev anvendt til at vurdere den diagnostiske nøjagtighed serum miRNA. De relevante klinisk-patologiske træk blev bestemt ved en ANOVA for kvantitative data og X

2 test for kvalitative data. Alle tests var to-sidet og p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev påberåbt SPSS 17,0 software (SPSS Ltd., UK) og grafer blev genereret med Graph pad Prism 5.0 (Graph pad Software Inc, USA).

Resultater

Kliniske funktioner i studerede grupper

med hensyn til træningssæt, den gennemsnitlige alder CRC patienter (51,10 ± 10) var signifikant højere end andre grupper (p-værdi 0,05). Imidlertid blev ingen signifikant forskel rapporteret mellem gennemsnitsalder på kontrolgruppen (43,7 ± 14,2) og dem med CP (40.00 ± 15,0) og IBD (41,6 ± 15,4) eller køn for alle grupper (p-værdi 0,48) . Derudover var der statistisk signifikante forskelle mellem de undersøgte grupper i forhold til mavesmerter, slim, vægttab og anæmi (p-værdi 0,05). Med hensyn til validering sæt, var der ingen signifikant forskel mellem gennemsnitsalder på CRC-gruppen (46,7 ± 14,5) og kontrolgruppen (43,7 ± 14,2) eller sex mellem de to grupper. Men der var statistisk signifikante forskelle mellem CRC-gruppen og kontrolgruppen i forhold til mavesmerter, slim, vægttab og anæmi (p-værdi 0,05). Som vist i (tabel 1)

Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i de undersøgte grupper sammenlignet med kontrolgruppen i uddannelsen sat

Blandt alle undersøgte miRNA, kun

miR-19b

var signifikant opreguleret i IBD-gruppen (fold ændring = 5,24, p-værdi = 0,016) (figur 1 og tabel 2), mens

miR-18a

var betydeligt op reguleret i CP-gruppen (fold ændring = 3,49, p-værdi = 0,018) (figur 2 og tabel 3) og

miR-17

,

miR-19a

,

miR-20a og miR-223

var signifikant opreguleret i CRC-gruppen (fold ændring = 2,35, 3,07, 2,38 10.35 og p-værdi = 0,021, 0,015, 0,017 0,0166 henholdsvis). som vist i (figur 3 og tabel 4)

A) Volcano plot viser differentiel ekspression af 14-miRNA i IBD versus kontrolgruppen.

miR-19b

var signifikant op reguleret. B) ROC kurve analyse af

miR-19b

mellem IBD-gruppen og kontrolgruppen.

A) Volcano plot viser forskellen udtryk for 14-miRNA i colon polypper gruppen versus kontrolgruppen.

miR-18a

var signifikant op reguleret. B) ROC kurve analyse af

miR-18a

mellem colon polypper gruppen og kontrolgruppen.

miR-17

,

miR-19a

.

miR-20a og miR-233

var betydeligt op reguleret. B) ROC kurve analyse af

miR-17

,

miR-19a

.

miR-20a og miR-233

mellem CRC-gruppen og kontrolgruppen. C) Den clustergram udfører hierarkiske clustering af hele datasættet for at vise et kort varme med dendrogrammer indikerer co-regulerede gener på tværs af kontrol, IBD, colon polypper og CRC grupper hhv. Vejviser

Ved sammenligning af CRC-gruppen (maligne) versus de andre grupper (ikke-malign); kun miR-223 var betydeligt op reguleret (fold ændring = 4,49, p-værdi = 0,002), som vist i (tabel 5).

Det er dog kun

miR-135b

miR-454

var signifikant nedreguleret i CRC-gruppen sammenlignet med IBD gruppen (fold ændring = 0,24 0,44 og p-værdi = 0,023 0,018 henholdsvis) som vist i S2 tabel. Mens

miR-135a

miR-135b

var signifikant nedreguleret i CP-gruppen sammenlignet med IBD gruppen (fold ændring = 0,12, 0,09 og p-værdi = 0,019 og 0,018 henholdsvis ) som vist i S3 tabel.

Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i CRC-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen i valideringen sat

Blandt alle undersøgte miRNA, kun

miR-223

var signifikant opreguleret i CRC-gruppen (fold ændring = 4,06, p-værdi = 0,04) som vist i (tabel 6). Ved at opdele CRC patienter valideringen sat i mandlige og kvindelige grupper; Vi fandt, at

miR-19a

,

miR-19b

, og

miR-20a

var signifikant op reguleret i de kvindelige CRC patienter sammenlignet med kontrolgruppen (fold ændring = 2,8, 4,1 2,2 og p-værdi = 0,021, 0,023 0,04 henholdsvis) som vist i S4 tabel. På den anden side, kun

MIR-17

var signifikant opreguleret i de mandlige CRC patienter sammenlignet med kontrolgruppen (fold ændring = 2,1, p-værdi = 0,03) som vist i S5 tabel.

ROC kurve analyse af differentielt udtrykt miRNA

for at diskriminere CRC gruppe fra kontrolgruppen; Vi har fundet, at

miR-223 Hotel (AUC 0,838), miR-17 (AUC 0,813),

miR-19a

(AUC 0,825) besad højere diagnostisk ydelse end

miR-20a Hotel (AUC 0,788). På den anden side,

MIR-18a

(AUC 0,8) udviste god diagnostisk resultater i skelne IBD gruppe fra kontrolgruppen. Også

miR-19b

(AUC 0,875) viste, god diagnostisk præstationer i diskriminere CP gruppe fra kontrolgruppen, som vist i (tabel 7).

Diskussion

Vores undersøgelse vurderede muligheden for at anvende forskellige cirkulerende miRNA som serologiske biomarkører for detektion af CRC. Vores undersøgelse blev korrekt designet til at omfatte tilfælde på forskellige stadier af kolorektale sygdomme dvs. patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), adenomatøse colon polypper (CP) og CRC.

Vores resultater viste, at der var betydelig opregulering af

miR-17

,

miR-19a

,

miR-20a

miR-223

i CRC-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen.

miR-17

,

miR-20a og miR-19a

er medlemmer af den polycistroniske

miR17-92

klynge (

miR-17

,

miR-18a

,

miR-19a

,

miR-19b

,

miR-20a

,

og miR-92a

), som ligger på 13q31.3; et locus, der ofte amplificeret i kolorektal cancer [13, 14]. Vores konklusion vedrørende betydelig opregulering af

miR-20a

kom i overensstemmelse med de tidligere resultater af Xu et al., Der fandt, at opregulering af

miR-20

var forbundet med tumor invasion og lymfeknude metastase af HCC patienter [15]. Så

miR-20a

kan have en potentiel tumor onkogen funktion i CRC. Desuden

MIR-20a

fremmer epitelcelle til mesenchymal overgang (EMT), et vigtigt skridt i tumormetastase, ved at målrette tumorsuppressorgenet (tissue inhibitor matrixmetalloproteinase 3 (TIMP3)); negativ regulator af matrixmetalloproteinase 2 (MMP2) og matrixmetalloproteinase 9 (MMP9), som medierede ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning [15]. Også målretter miR-20a de aktiverende medlemmer af

E2F

familie, herunder cellecyklus og apoptose regulatoriske gener, der fører til G1 S faseovergang. Men høje niveauer af E2F proteiner, især E2F1, kan inducere apoptose der fungerer som en nødbremse for over prolifererende celler. Den onkogene funktion

miR-20a

blev foreslået at hindre denne nødbremse funktion af E2F faktorer og dermed stimulere tumorvækst [16]. Desuden

MIR-20a

styrer cellecyklusprogression via målretning cyclinafhængige kinaseinhibitorer, CDKN1A /p21; vigtig regulator af G2 /S overgang [17]. Endvidere MIR-20a målretter tumorsuppressor PTEN; som er en negativ regulator af onkogen prosurvival PI3K \\ AKT pathway [18, 19]. Vore data vedrørende opregulering af

miR-17a

miR-19a

i CRC patienter kan sammenlignes med tidligere rapporter i litteraturen [9, 16-19]. I lighed med

miR-20a

,

miR-17a

blev vist sig at fremme cellecyklus progression gennem målrettet CDKN1A /p21 og E2F [16, 17], mens den onkogene potentiale

miR -19a

opnås primært gennem målrette PTEN; dermed fremme onkogene pro-overlevelse vej [9, 18-20].

Vores data om

MIR-223

end udtryk i CRC gruppe er overensstemmende med de Huang

et al

som vurderede ekspressionsniveauerne af miRNA i plasmaet fra 100 CRC patienter og hos 37 patienter med colon adenomer sammenlignet med 59 raske individer. Blandt deres panel, blev 12 miRNA op reguleret, herunder

miR-223

[21]. Tilsvarende Li

et al

. rapporterede, at overekspression af

MIR-223

i de neoplastiske colon væv sammenlignet med de tilstødende ikke-kræft dem [22]. Den onkogene funktion

miR-223

i CRC blev opnået gennem målrettet FOXO1 [23] og RASA1 [24]. FOXO1 er medlem af FOX transkriptionsfaktorer-O-underfamilien. Det regulerer transskriptionen aktiviteten af ​​forskellige gener, herunder p21, og således inhiberer cellecyklusfremadskriden [25, 26] .På den anden side, RASA1, en RAS signalering terminator, er associeret med tumorudvikling [27]. Desuden Li

et al

. viste, at

miR-223

kan betragtes som en dårlig prognostisk markør, da det er overekspression korrelerer signifikant med høj TNM stadie, nodal og fjernmetastaser samt med reducerede overordnede overlevelse [22]. Vore data viste også, at signifikant opregulering af

MIR-18a

hos patienter med CP sammenlignet med kontrolgruppen. Vores resultater støttede en tidligere rapport fra Wu et al, [28], som viste, at

miR-18a

spiller en onkogen rolle i kolorektal carcinogenese gennem nedregulering af Ataksi telangiectasia muterede gen (ATM).; et nøgleenzym i reparation af DNA dobbelt-strengbrud. Desuden phosphorylerer flere vigtige proteiner, initierer aktivering af DNA beskadigelse checkpoint, hvilket fører til standsning af cellecyklus, DNA-reparation eller apoptose [29].

Som for

MIR-19b

, signifikant opregulering blev rapporteret hos patienter med IBD sammenlignet med kontrolgruppen. Jiang et al. viste, at både

miR17

miR-19b

, tilhører

miR-17-92

klynge, hæmmer treg celledifferentiering og fremme Th1 respons [30]. Th1 er ansvarlig for den pro inflammatoriske respons via secernerende af IL12, IL2, IL6, IFN og TNF [31]. Sidstnævnte (TNF) spiller en afgørende rolle i inflammation proces gennem aktivering af NF-kB-vejen; et prototypisk pro inflammatorisk signalvej [32]. Den mulige mekanistiske rolle betydelige miRNA i CRC, IBD og colon polypper grupper sammenlignet med kontrolgruppen, og deres efterfølgende mål blev illustreret i den foreslåede tegneserie (Fig 4).

Rød stjerne angiver signifikant miRNA i CRC mens gul stjerne angiver signifikante miRNA i IBD og grøn stjerne angiver miRNA i colon polypper. Pilen viser aktiveringen, mens cirklen for enden af ​​linje angiver hæmning.

Rød stjerne angiver signifikant miRNA i CRC mens gul stjerne angiver signifikante miRNA i IBD og grøn stjerne angiver miRNA i colon polypper. Pilen viser aktiveringen, mens cirklen for enden af ​​linje angiver hæmning.

Yderligere analyse af data ved hjælp af (ROC) analyse kurve og det tilhørende areal under kurven blev forsøgt for de betydelige miRNA i hvert parvise sammenligning at undersøge deres diagnostiske nøjagtighed. ROC kurve analyse af de enkelte miRNA viste, at

miR-17

,

miR-19a

,

miR-20a miR-223

effektivt kan skelne mellem CRC-gruppen og kontrolgruppen. Men

miR-18a

viste, god diagnostisk nøjagtighed i at diskriminere CP gruppe fra kontrolgruppen. På den anden side,

miR-19b

viste god diagnostisk nøjagtighed i at diskriminere IBD gruppe fra kontrolgruppen.

Afslutningsvis

Aberrant miRNA udtryk er stærkt involveret i kaskade af kolorektal carcinogenese. Vi har fundet, at (

miR-17

,

miR-19a

,

miR-20a

miR-223

) kunne bruges som diagnostisk biomarkører for CRC. På den anden side,

miR-19b

miR-18a

kunne anvendes som diagnostiske biomarkører for CP og IBD hhv.

Støtte Information

S1 Table. Den rationelt for at vælge de undersøgte 14 miRNA baseret på tidligere referencer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s001

(DOC)

S2 tabel. Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i CRC versus IBD gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s002

(DOC)

S3 Table. Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i CP versus IBD gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s003

(DOC)

S4 Table. Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i kvindelig CRC versus kontrolgruppen “Validering Set”

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s004

(DOC)

S5 Table. Differentiel udtryk for de undersøgte miRNA i mandlige CRC patienter versus kontrolgruppen “Validering Set”

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s005

(DOC)

Tak

Vi anerkender Yasser Mabrouk Bakr til hans råd om den statistiske analyse.