PLoS ONE: Hæmning af Iron Optagelse er ansvarlig for Differential Følsomhed over for V-ATPase hæmmere i flere Cancer Cell Lines

Abstrakt

Mange cellelinjer afledt af tumorer samt transformerede cellelinier er langt mere følsomme over for V -ATPase-inhibitorer end normale modstykker. De molekylære mekanismer bag disse forskelle i følsomhed er ikke kendt. Ved hjælp af globale genekspression data viser vi, at de mest følsomme reaktioner på HeLa-celler til lave doser af V-ATPase-inhibitorer omfatter gener, der reagerer på faldende intracellulær jern eller faldende kolesterol, og at følsomheden over for jernoptagelse er en vigtig determinant for V-ATPase følsomhed i flere cancer cellelinjer. En af de mest følsomme cellelinier, melanom afledt SK-Mel-5, over-udtrykker jern efflukstransporteren ferroportin og har nedsat ekspression af proteiner involveret i jernoptagelse, hvilket antyder, at den aktivt undertrykker cytoplasmatisk jern. SK-Mel-5 celler har øget produktionen af ​​reaktive ilt arter og kan søge at begrænse yderligere produktion af ROS ved jern

Henvisning:. Straud S, Zubovych I, De Brabander JK, Roth MG (2010) Hæmning af Iron Optagelse er ansvarlig for Differential Følsomhed over for V-ATPase hæmmere i flere kræftceller. PLoS ONE 5 (7): e11629. doi: 10,1371 /journal.pone.0011629

Redaktør: Anthony Robert White, University of Melbourne, Australien

Modtaget: December 31, 2009; Accepteret: 19. juni 2010; Udgivet: den 16. juli, 2010

Copyright: © 2010 Straud et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud CA095471 og CA09349 fra National Cancer Institute (NCI), 5P30 AR41940 fra National Institutes of Health (NIH), og give i-1422 fra Robert A. Welch Foundation. Undersøgelsen blev udført i et anlæg konstrueret med støtte fra Research Faciliteter Improvement Program Grants C06-RR15437 fra National Center for Research Resources (NCRR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inhibitorer af vakuolær-type (H +) – ATPase (V-ATPase) er blevet undersøgt som potentielle terapeutiske midler til cancer [1], [2], som de viser imponerende differentiel cytotoksicitet for de 60 cellelinier af den NCI SAMMENLIGN panel. Derudover cellelinier transformeret med onkogener er mere følsomme over V-ATPase-inhibitorer end de parentale, utransformerede cellelinier [3], [4]. Mange cancercellelinier opregulere ekspression af V-ATPase-underenheder i forhold til normale væv [1] og V-ATPaser menes at spille en rolle i metastase [5], [6] og kemoresistens [2], [7]. Men de grundlæggende mekanismer, der bestemmer hvilke kræftceller er mest følsomme over for V-ATPase-inhibitorer er i øjeblikket ukendte. Dette er vigtig viden, som inhiberer V-ATPase selv kan inhibere synaptisk transmission [8]. Således proteiner involveret i cellulære processer, der er mest differentielt følsomme over for inhibering af V-ATPase måske bedre terapeutiske mål end V-ATPase selv.

V-ATPase er et stort, proteinkompleks, der kan transportere protoner over membraner mod en pH-gradient og dermed generere det sure miljø findes i endocytiske organeller, Golgi-apparatet og trans-Golgi Network [9]. Det består af en stor, cytosolisk hexamere ATPase, V

1, der er forbundet med flere bindinger til en integreret membrankompleks, V

0. Hydrolyse af ATP ved underenheder af V

1 omdannes til mekanisk rotation i V

0, der bevæger protoner fra det cytosoliske til luminale side af membranen, hvor V

0 opholder sig. Aktiviteten af ​​V-ATPase styres af flere mekanismer, således at når demonteret, V

1 ikke hydrolyserer ATP og V ikke roterer

0 og transport protoner [9]. En række inhibitorer af V-ATPase er kendt som har særskilte bindingssteder [10].

I både sekretoriske og endocytiske pathways pH-gradienter er kritiske for mange funktioner. Lumen af ​​det endoplasmatiske reticulum er neutral, og at af Golgi-komplekset er sur, og denne forskel anvendes til at regulere bindingen af ​​undslupne ER chaperoner i det sure Golgi af KDEL receptoren, som recirkulerer at frigive dem på den neutrale ER [11] . pH falder over Golgi komplekset, så prohormone konvertaser aktiveres ved den sure exit ansigt trans-Golgi netværket, og i sekretoriske vesikler, men ikke tidligere i forløbet [12]. På en tilsvarende måde, mange lysosomale proenzymer er inaktive ved pH for den sekretoriske pathway og aktiveres, efter at lysosomet, hvor pH-værdien er sædvanligvis under 5,0 [13]. I endocytiske proces er visse ligander, såsom lavdensitetslipoproteiner (LDL), binder receptorer ved neutralt pH på celleoverfladen og frigøres, når receptorerne nå sure endosomer [14]. På denne måde er effektivt taget LDL op af cellen og leverer sin last af kolesterol til lysosomer mens receptoren recirkulerer til celleoverfladen at binde mere ligand. Effektiv optagelse af jern i celler kræver også lavt pH i endosomer. Transferrin, bæreren for ekstracellulær jern, har høj affinitet for jern og for dets celleoverfladereceptor på typiske ekstracellulære pH over 7,0. Transferrinreceptoren kontinuerligt internaliseres og genbruger til plasmamembranen, transporterer transferrin til sure endosomer, hvor det frigiver jern. Jern-fri apotransferrin har høj affinitet for receptoren ved lavt pH og lav affinitet ved neutralt pH. Således apotransferrin genbruger med dets receptor tilbage til plasmamembranen, hvor den frigives og genvinder høj affinitet for ekstracellulær jern [15]. Lav pH bruges også til at fastslå identiteten af ​​endocytiske organeller. Visse cytosoliske proteiner kræves til regulering membran trafik binder til den cytoplasmatiske side af endosom membraner kun når den interne pH af organel er sure [16]. Forsuring af lysosomer er også påkrævet for processen med autophagy [17]. Selvom normalt udtrykkes ved lave niveauer på plasmamembranen undtagen i visse sure secernerende celler, V-ATPase er overudtrykt på plasmamembran nogle cancerceller og kan spille en rolle regulering cytosolisk pH [5], [6], [18 ]. Enhver af eller alle disse væsentlige funktioner kan være mere sårbare over for inhibering af V-ATPase især cancercellelinier baggrunde.

For at undersøge grundlaget for den differentielle følsomhed af cancerceller til inhibitorer af V-ATPase, vi har gjort brug af den iagttagelse, at cellerne ofte reagerer på stress ved opregulering kritiske komponenter i veje, der er registrerede som skal mislykkes, som det for eksempel reaktion på svigt af proteinfoldning i det endoplasmatiske reticulum [19]. Vores hypotese er, at en mild inhibering af V-ATPase vil afsløre de mest følsomme biologiske funktioner for dette enzym, hvilket vil fremgå af gener, der første stigning transskription som respons på inhibering. Afprøvning denne hypotese har vi observeret, at veje af jern regulering er mest følsomme over for partiel inhibering af V-ATPase i HeLa-celler, og at der kan foretages visse cancercellelinier mest følsomme til V-ATPase-inhibitorer langt mere modstandsdygtige ved tilsætning exogent jern til dyrkningsmediet. Dette tyder på, at komponenter af jern metabolisme eller transport kan være kandidater som terapeutiske mål i visse kræftformer, og disse kræftformer kan identificeres gennem deres følsomhed over for V-ATPase-inhibitorer eller ved ændret udtryk af jern transportproteiner.

Resultater

for at bestemme, hvilke metaboliske veje blev understreget af lave doser af V-ATPase-inhibitorer, vi først bestemt dosis respons på to forskellige hæmmere af V-ATPase på flere cellelinjer. Vi ønskede at finde en koncentration af hver inhibitor, der ville vise en effekt på væksten, hvilket indikerer, at celler reagerer på stimulus, men som ikke var så giftigt, at svaret ville blive forhindret eller kompliceres af celler dør under forsøget. Cellelinierne vi testede havde IC50-værdier til bafilomycin A, der varierede fra 10 nM til over 10 pM og vi valgte moderat følsomme cellelinie HeLa (IC50 = 150 nM) i vore forsøg, fordi dens relativt lave dosis respons foretaget for mere ensartet vækstinhibering eksperimenter, hvilket tyder på, at genet ekspressionseksperimenter også ville være mere reproducerbar. Vi valgte også at sammenligne to inhibitorer af V-ATPase, som virker gennem forskellige mekanismer [20], bafilomycin A (Baf) og phenylsalicylihalamide (LX1077), for at kontrollere for eventuelle ikke-tilsigtede virkninger af hver forbindelse. Koncentrationer af hver forbindelse, der inhiberede cellevækst ca. 25% efter 48 timer (figur 1) blev valgt til genekspression eksperimenter. HeLa-celler blev dyrket natten over og derefter prøver blev behandlet med 15 nM Baf til 6, 12 eller 24 timer, eller 200 nM LX1077 i 12 og 24 timer, og RNA blev høstet og forarbejdet til analyse ved microarray. Som kontroller, prøver af HeLa-celler behandlet i samme interval med 0,1% DMSO (slutkoncentrationen af ​​fortyndingsmidlet for Baf eller LX1077 i eksperimentelle prøver), blev kørt parallelt med hver eksperimentel betingelse. Hver eksperimentel betingelse blev gentaget i et uafhængigt forsøg udført på en anden dag. Salg

HeLa-celler blev dyrket i medium indeholdende Bafa eller LX1077 ved koncentrationerne vist i 48 timer og celleantal blev beregnet. Data er normaliseret til kontrollerne behandlet med 0,1% DMSO. Dataene er gennemsnit af tredobbelte prøver og fejl barer er SEM.

To store veje for optagelse af næringsstoffer til celler afhænger af surhedsgraden i endosomer leveret af V-ATPase. Inhibering af V-ATPase vil forstyrre leveringen af ​​jern ind i cellen ved at forhindre frigivelsen af ​​jern fra transferrin og forhindrer også optagelsen af ​​cholesterol ved at inhibere frigivelsen af ​​LDL fra dets receptor. Derfor behandlede vi HeLa-celler i 6 eller 12 timer med deferoxamin (DFO) til chelat jern og separat med medium, som mangler LDL at efterligne inhibere optagelse af eksogent kolesterol gennem LDL-receptoren. Kontroller blev matchet prøver dyrket i normalt dyrkningsmedium. Disse prøver blev behandlet til microarrays præcis som prøver behandlet med V-ATPase-inhibitorer. På den måde kunne vi identificere alle gener reagerer med øget transkription når jern var mangelfuld eller LDL-optagelse blev blokeret. Der blev behandlet af UT Southwestern DNA Micro Array Core Facility ved anvendelse af GCOS software med MAS5 normaliserings- og eksperimentelle prøver blev sammenlignet med DMSO behandlede prøver, eller for DFO eller lave LDL betingelser, prøver dyrket i normalt medium køre på samme tid til at beregne størrelsen af ​​ændringen.

Gener blev anset for at vise signifikant forøget ekspression hvis begge prøver på én gang punkt med enten Baf eller LX1077 havde en ændring P-værdi på mindre end 0,002 og gennemsnittet af de to prøver steg mere end 2-fold. I de fleste tilfælde Baf induceret transkription mere end LX1077, selvom generne responderede på Baf også reageret på LX1077. De gener, der øgede transkription tidligste er vist i tabel S1, S2 og tabel 1. Tabel S1 viser 47 gener, der øgede ekspression, når HeLa-celler blev behandlet med V-ATPase-inhibitorer eller med lavt kolesterol medium og repræsenterer reaktionen på inhibering af V-ATPase der skyldes blokering levering af eksogent kolesterol. Svaret fra de fleste af disse gener er hurtigere i nærvær af de V-ATPase-inhibitorer end det er at medium uden LDL, måske fordi medium, som mangler LDL ikke blokerer leveringen af ​​cholesterol fra LDL-partikler, der enten er bundet til deres receptor på celleoverfladen eller allerede frigives i endocytiske proces på tidspunktet mediet mangelfuld i LDL blev tilsat. Størstedelen af ​​generne vist i tabel S1 funktion i lipid biosyntetiske veje og 23 er kendte mål for SREBP1 eller 2 [21]. Med undtagelse af EGLN1 og STARD4, ingen af ​​de gener, der øger transkription tidligt som reaktion på lave LDL reagere på den jernkelator DFO. EGLN1 koder en jern-afhængig prolylhydroxylase der undertrykker HIF-1α aktivitet under normoxiske betingelser [22], og er ikke kendt for at være følsomme over for aktiviteten af ​​kolesterol biosyntesevejen. Men i gær og pattedyr er der cross-talk mellem kolesterol biosyntesen og veje tilpasning til hypoxi [23], [24]. STARD4 koder for et cytosolisk kolesterol transfer protein, som er en SREBP target [21] og også opreguleres af ER stress [25] og kan kun indirekte opreguleret af jern-chelateringsmidlet. Interessant øget transkription af INSIG1, der koder for en negativ regulator af SREBP transkriptionsfaktorer, der styrer cholesterolbiosyntese, er en af ​​de hurtigere reaktioner på V-ATPase-inhibitorer. Dette er muligvis en negativ feedback-mekanisme til at begrænse transkriptionel respons når lipid metaboliske veje har øget produktionen af ​​endogene kolesterol [26].

Tabel S2 lister 64 gener, at øget transskription hurtigste, når jern blev chelateret og også svare inhibering af V-ATPase. Disse er gener i veje, der formentlig reagerer på inhiberingen af ​​jern frigivelse ved transferrin i endosomer når V-ATPase hæmmes. Mindst 29 af disse gener er kendt mål for HIF-1α og svare hypoxi. Som man kunne forvente, disse gener fungerer i mange veje. Aldolase C er en HIF-1α target [27] og er stærkt opreguleres ved V-ATPase-inhibitorer. Selvom vi ikke registrerer en tidlig stigning i aldolase C i celler behandlet med lav LDL medium, aldolase C er også en kendt mål for SREBPs [21]. Aldolase C binder til V-ATPase [28] og i gær er ansvarlig for glucose regulering af V-ATPase-aktivitet [29], [30]. Da aldolase C reagerer på hypoksi i lungeepitelceller og V-ATPase-inhibitorer i HeLa-celler, hvorimod mere rigelige glycolytiske enzym aldolase A ikke gør det, er det muligt, at en større funktion af aldolase C i afhængighed af jernmangel eller hypoxi er at regulere V-ATPase som en del af den mekanisme for at sikre jern homeostase. HIF-1α er undertrykt primært ved at blive hydroxyleret på prolin ved jern-afhængige prolyhydroxylases, som er rettet mod det for nedbrydning [31]. Ved immunoblot fandt vi, at inkubere HeLa-celler i 15 nM Baf i 1 time stabiliseret HIF-1α (data ikke vist), hvilket antyder, at veje reguleres af HIF-1α er blandt de mest følsomme over for inhibering af V-ATPase. Således V-ATPase-inhibitorer giver et mest effektive middel til indgreb HIF-1a pathways eksperimentelt.

Tabel 1 viser 7 gener, der øgede transkription i respons på V-ATPase-inhibitorer, men ikke i HeLa-celler behandlet med lav LDL medium eller med jern-chelateringsmidlet. Disse er kandidater til veje, som mærker manglen på V-ATPase-aktivitet uafhængigt af påvirkningen af ​​transferrin eller LDL. Andre end CLCN6, er disse gener ikke stærkt opreguleret og flere af dem er involveret i cellecyklus og vækstkontrol og kan være en tidlig del af vækstinhibering, der vil forekomme efter længere inkubation i inhibitorerne. CLCN6 er en klorid kanal findes i neuroner og epitelceller [32], [33], og lokaliserer til sene endosomer [33]. Chloride kanaler i endosomer arbejde sammen med V-ATPase og dermed CLCN6 opregulering kan være en reaktion på tab af sene endosom funktion. SREBF2 (SREBP2) er en vigtig regulator af kolesterol biosyntesen, og det er primært reguleret efter transskription af membran trafik og proteolyse [34]. Den beskedne transkriptionelle Stigningen er sandsynligvis afbalanceret med stigningen i udtryk for inhibitor af SREBP aktivering, INSIG1.

Tabel 2 viser resultaterne af at tage en mindre restriktiv analyse af de gener, der ændrer i HeLa celler behandlet med 15 nM Baf i 6 timer. Alle gener, der viste en statistisk signifikant ændring (ændring P-værdi 0,00025), uanset retning af forandring blev analyseret med behændighed Pathways at afgøre, hvilke kanoniske veje i Ingenuity Database blev beriget i gener, der blev ændret som reaktion på Baf. Veje, der reagerede væsentligt til Baf indeholdt meget få gener, der faldt udtryk, bekræfter vores formodning om, at den tidlige reaktion ville blive øget genekspression. Langt den mest markant berørte veje var steroid biosyntese, efterfulgt af glykolyse, og involverede gener for det meste også identificeret ved vores mere restriktiv analyse.

Efter længere intervaller behandling med V-ATPase-inhibitorer, 52 gener, der var steget som respons på 12 timers dyrkning i lav LDL-medium viste også forøget ekspression i celler behandlet i 24 timer med V-ATPase-inhibitorer (tabel S3). Otte af kolesterol responsive gener, der blev opreguleres tidligere ikke længere viste en stigning og 15 nye kolesterol responsive gener viste øget transkription, med 6 af disse koder for proteiner involveret i lipid biosyntetiske. 104 “jern responsive” gener (Tabel S4) blev forhøjet i celler behandlet med V-ATPase-inhibitorer i 24 timer, herunder en række gener, der koder for glycolytiske enzymer eller repressorer af mitokondriefunktion, transkriptionsfaktorer og proteiner regulerer cellevækst. STXBP1, som koder for Munc-18 regulator af membranfusion, udviste beskeden stigning i respons på enten nedbryder kolesterol eller jern og en stærkere stigning i celler behandlet med V-ATPase-inhibitorer. Dette er en af ​​de meget få gener, der koder proteiner, som regulerer membran trafik, der øges som reaktion på inhibering af V-ATPase (HIP1R, SV2A og OPTN var de andre). Tres to gener forøget ekspression mindst to gange som svar på inhibering af V-ATPase i 24 timer, men reagerede ikke på cholesterol deficient medium eller DFO (tabel S5). Dette sæt af gener blev analyseret ved anvendelse Opfindsomt Pathways software til at identificere metaboliske veje, hvor generne blev signifikant opreguleres (figur 2). Langt den mest signifikant respons i gener involveret i lipid og steroid biosyntese.

Generne i tabel S4 blev analyseret med behændighed Pathways at tildele dem til kanoniske veje. Den procent af gener i vejen repræsenteret i dette datasæt, og betydningen af ​​ændringen vises.

Som man kunne forvente, hvis både stigninger og fald i genekspression anses, efter 24 timer i Baf der er en kompliceret reaktion involverer en række veje, der styrer væksten og reaktion på stress (tabel S6). Den mest markante af disse er den Nrf2-medieret oxidativ stress respons, hvilket antyder, at inhibering af V-ATPase forøger reaktive oxygenarter. Som vigtige komponenter i den mitokondrielle respiration vej kræver jern, og hæmning af oxidative fosforylering kan producere ROS, kan ændringer i Nrf2 medierede veje være en sekundær følge af hæmningen jern import fra transferrin.

Vores oprindelige hensigt at forfølge disse undersøgelser var at undersøge årsagerne til forskellen respons på V-ATPase-inhibitorer ses i kræftceller. Fordi de store øjeblikkelige svar på inhibering af V-ATPase var manglen på jern eller cholesterol, undersøgte vi, om disse var ansvarlige for overfølsomhed af visse cancerceller til V-ATPase-inhibitorer (figur 3). Vi målte dosis-respons for livmoderhalskræft afledt HeLa, melanoma afledt cellelinier SK-MEL-5 og SK-MEL-28, ikke-småcellet lungekræft line H1299, brystcancer MCF-7 og Morris Hepatom (MH) celler til Baf i nærvær eller fravær af 150 uM jern citrat. Baf havde meget lignende IC50 koncentrationer til HeLa, MCF7 og H1299. Både MH og SK-Mel-5-celler var 10 gange mere følsom end HeLa, og SK-MEL-28 var meget ufølsom (figur 3). For Hela, SK-Mel-5 og SK-Mel-28 testede vi også virkningen af ​​at tilsætte cholesterol afgives til celler med methyl-β-cyclodextrin, som tilføjer kolesterol direkte til plasmamembranen [26]. Tilføjelse jern til mediet gjort HeLa-celler 20 gange mere resistent over for vækstinhibering forårsaget af 20 til 200 nM bafilomycin, men forudsat ringe beskyttelse for de cytotoksiske virkninger observeret ved højere koncentrationer (figur 3). Kolesterol var beskyttende for HeLa-celler, men ikke for de Baf-følsomme SK-Mel-5-celler eller Baf resistente SK-Mel-28 (figur 4). Dette indikerer, at de cytostatiske effekter af V-ATPase-inhibitorer i HeLa-celler er hovedsageligt på grund af hæmning af jern og cholesterol optagelse, men de cytotoksiske virkninger skyldes en alternativ, og endnu ukendte funktion. Supplering H1299, MCF7 eller mere følsom SK-Mel-5 melanom cellelinie med jern beskyttet dem til lavere koncentrationer af Baf ligner HeLa-celler (figur 3). Faktisk MCF7 eller SK-Mel-5-celler behandlet med jern og bafilomycin havde en dosisreaktion bemærkelsesværdigt lig HeLa celler behandlet med bafilomycin alene, hvilket antyder, at disse cellelinjer var særligt følsom over for inhibering af jernoptagelse. Hverken jern eller kolesterol havde nogen beskyttende virkning på meget modstandsdygtigt cellelinie SK-Mel-28 eller den meget følsomme MH cellelinje.

Dosis-respons på seks cancercellelinjer til Baf i nærvær eller fravær af 150 uM jern citrat blev bestemt som beskrevet i forklaringen til figur 1.

dosisresponskurverne af HeLa, SK-MEL-5 og SK-Mel-28-celler til Baf i nærvær eller fravær af exogent cholesterol leveres til celler med methyl-β-cyclodextrin blev bestemt som beskrevet i forklaringen til figur 1.

for at undersøge mekanismen for cytotoksicitet induceret af Baf i SK-Mel-5 og HeLa-celler behandlede vi celler af hver linie til 0 til 1000 nm Baf i 24 timer og derefter undersøgt spaltningen af ​​PARP eller caspase 3 som tegn for induktion af apoptose (figur 5). I begge cellelinier Baf induceret apoptose efter 24 timer; imidlertid krævede koncentration var over 20 gange lavere for SK-Mel-5 end HeLa-celler, meget lig forskellene i dødelige doser for de to cellelinier. Således cytotoksicitet som følge af inhibering af V-ATPase i overfølsomme cellelinie SK-Mel-5 er gennem induktion af apoptose.

HeLa og SK-Mel-5-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af Baf til 24 hrs og derefter forberedt til immunoblotting med antistoffer mod spaltet PARP eller spaltet caspase 3. de spaltede proteiner forekommer ved meget lavere koncentrationer af Baf i SK-MEL-5-celler sammenlignet med HeLa, med koncentrationen forskel mellem forekomsten af ​​spaltede protein svarende til den forskelle i dødelige doser for de to cellelinier. De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg.

Både SK-Mel-5 celler og MCF7-celler var mere følsomme over for Baf end HeLa-celler, og denne forskel i følsomhed blev afskaffet ved at supplere dyrkningsmediet med jern (figur 3). undersøgte vi således ekspressionen af ​​proteiner involveret i jernoptagelse, opbevaring eller efflux i disse cellelinier og HeLa-celler (figur 6). SK-Mel-5-celler udtrykte mindre transferrin receptor end nogen af ​​de andre to cellelinjer og meget lave niveauer af DMT1, transportøren ansvarlig i at bevæge jern tværs endosomet membran til cytoplasmaet. Bemærkelsesværdigt, SK-Mel-5-celler udtrykte høje niveauer af jern efflukstransporteren, ferroportin, som transporterer jern over plasmamembranen og ud af cellen. Ferroportin blev ikke påvist i nogen af ​​de andre to cellelinjer. SK-Mel-5-celler udtrykte mindre ferritin end HeLa-celler, konsistent med at have lave niveauer af cytoplasmatisk jern. Tilsammen har dette mønster af udtryk foreslog, at SK-Mel-5 celler var aktivt opretholde relativt lave cytoplasmiske jern niveauer. I modsætning hertil MCF7-celler havde niveauer af transferrin receptor ligner HeLa-celler, forøget ekspression af DMT1 og meget lave niveauer af jern opbevaring protein, ferritin. Dette er et mønster af udtryk i overensstemmelse med en celle, der har lave cytoplasmatiske jern niveauer og har opreguleret mekanismer jern transport som svar. Således SK-Mel-5 celler og MCF7-celler, selv om begge overfølsomme over for Baf grundet hæmning af jern optagelse, afveg i de molekylære mekanismer bag denne sårbarhed.

udtryk for transferrin receptor 1, ferritin og ferroportin i HeLa og SK-Mel-5-celler i nærvær eller fravær af DFO blev målt ved immunblotting. I forhold til HeLa-celler, SK-Mel-5 har nedsat ekspression af transferrin receptor og ferritin og en stor stigning i ekspression af jern efflux protein ferroportin. TfR, transferrin receptor. DMT1, divalent metal transportør 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kæde. De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg.

Forskellene i ekspression af transferrin receptor og ferroportin i SK-Mel-5-celler var ikke på grund af en manglende evne til at regulere disse proteiner som reaktion på jern. Når SK-Mel-5-celler eller HeLa-celler blev behandlet med DFO at chelatere jern, begge opreguleret ekspression af transferrin receptor (figur 7). Som svar på DFO, transferrin receptorekspression i SK-Mel-5-celler var meget lig den i HeLa, hvilket indikerer, at mekanismer til udtrykker receptoren som respons på jern var intakte i SK-Mel-5-celler. DFO behandling faldt udtryk for ferroportin og ferritin i SK-Mel-5 celler, som man ville forvente for en celle stræber efter at opretholde cellulære jern niveauer. Således mekanismer til at regulere disse proteiner ved jern var også intakt i SK-Mel-5 celler. Når SK-Mel-5-celler blev behandlet med Baf, steg også ekspression af transferrin-receptoren og faldt ferritin. Imidlertid blev ferroportin udtryk væsentligt forøget. Siden chelaterende jern faldt ferroportin ekspression i SK-MEL-5-celler, denne reaktion skyldtes en anden virkning af at inhibere V-ATPase. Salg

Behandling af HeLa eller SK-Mel-5-celler med 100 uM DFO for 24 timer resulterede i forøget ekspression af transferrinreceptoren i begge cellelinier, og et fald i ferroportin og ferritin i SK-Mel-5-celler. Baf behandling havde en lignende effekt, med den undtagelse at ferroportin ekspression i SK-Mel-5-celler blev forøget med Baf. HeLa-celler ikke udtrykker ferroportin og SK-Mel-5 celler havde meget lav udtryk for DMT1. TfR, transferrin receptor. DMT1, divalent metal transportør 1. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kæde. De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg.

En mulig årsag til en celle til aktivt nedtrykke cytoplasmiske jern niveauer ville være at beskytte mod generering af reaktive oxygenarter (ROS) efter jern. For at undersøge, om SK-Mel-5-celler kan producere mere ROS, vi mærkede SK-MEL-5 og HeLa-celler med farvestoffer, der øger fluorescens i nærvær af ROS. Celler blev fotograferet med identiske kameraindstillinger og fluorescensintensiteter af celler blev målt under anvendelse Billede J software. SK-Mel-5-celler producerede signifikant flere ROS end HeLa-celler, målt med begge farvestoffer (figur 8).

A. Celler blev mærket med H2O2 sensitive probe DCF, eller superoxid følsomme probe DHE, som beskrevet i fremgangsmåder. Celler blev fotograferet med identiske kameraindstillinger. B. Fluorescerende celler blev skitseret i Image J og fluorescens i de enkelte celler blev målt og afbildet med GraphPad Prism.

Da SK-Mel-5 celler syntes at have lave niveauer af intracellulær jern og var overfølsomme til Baf, hvilket yderligere vil formindske jernoptagelse, undersøgte vi følsomheden af ​​SK-Mel-5-celler til jernkelator DFO (figur 9). Som forventet, SK-Mel-5-celler var overfølsomme over for DFO sammenlignet med HeLa-celler. Faktisk DFO var kun cytostatisk for HeLa-celler, mens det var cytotoksisk for SK-Mel-5. Tilføjelse exogent jern til celledyrkningsmediet fra SK-Mel-5 eller HeLa-celler havde ingen virkning på cellevækst (data ikke vist).

Celler blev behandlet med koncentrationerne af DFO vist som beskrevet i Methods og efter 72 timer blev cellerne talt. To brønde for hver koncentration blev talt, og det gennemsnitlige antal af to uafhængige forsøg blev afbildet +/- SEM, n = 2.

Tre observationer foreslog, at ferroportin udtryk kan blive induceret af ROS i SK- Mel-5-celler. SK-Mel-5 celler havde både forøget ROS produktion og øget ferroportin udtryk. En af de store veje induceret af Baf behandling af HeLa-celler i 24 timer var den antioxidant respons medieret af Nrf2, hvilket antyder, at Baf behandling kan øge ROS. Baf inducerede snarere end undertrykte ferroportin udtryk i SK-Mel-5 celler, mens sænke jern niveauer med DFO faldt ferroportin udtryk. Hvis ferroportin ekspression blev induceret ved ROS, derefter behandle SK-MEL-5-celler med anti-oxidant N-acetylcystein (NAC) ville forventes at falde ferroportin ekspression. Når SK-Mel-5-celler blev behandlet i 48 timer med stigende koncentrationer af NAC, blev ferroportin ekspression reduceret (figur 10). Tilsammen vore data antyder, at SK-Mel-5-celler er sårbare over for inhibering af jernoptagelse fordi de opretholder jern reserver lav, måske for at beskytte sig mod generere toksiske niveauer af ROS. Salg

SK-MEL-5-celler blev behandlet med NAC som beskrevet i fremgangsmåderne og derefter bearbejdet til immunoblotting med antistoffer mod proteinerne er vist. TfR, transferrin receptor. FPN1, ferroportin 1. FTH, ferritin H tung kæde. De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg.

Discussion

Selv om en række cellelinier afledt fra tumorer eller cellelinier transformeret med onkogener er meget følsomme over V-ATPase-inhibitorer, problemer med toksicitet i dyr, særligt neurotoksicitet, har forhindret udvikling af disse inhibitorer som anti-cancermidler. Det indlysende problem er, at V-ATPase er et vigtigt enzym ansvarlig for mange fundamentale cellulære processer og inhibere det vil have mange effekter i mange celletyper. Hvilket igen antyder, at hypersensitivitet af cancerceller til V-ATPase-inhibitorer bør skyldes en sårbarhed i en eller flere af de mange processer, der kræver V-ATPase og at identificere disse svagheder kan afsløre terapeutiske mål, der kan udnyttes med færre toksiske virkninger på normalt væv. Vore data viser, at inhibering af jern optagelse af V-ATPase-inhibitorer er en vigtig determinant for differentiel følsomhed cancercellelinier til disse inhibitorer, hvilket antyder, at mekanismer, der styrer intracellulære jernniveauer kan være nyttige terapeutiske mål for visse tumorer.