PLoS ONE: Evaluering af Selected immunmodulatorisk glycoproteiner som et supplement til Cancer Immunotherapy

Abstrakt

Polysaccharopeptide (PSP), fra

Coriolus versicolor

, har været meget anvendt som en adjuvans til kemoterapi med påvist anti-tumor og brede immunmodulerende virkninger. Mens PSP virkningsmekanisme stadig ukendt, dens forbedrede immunmodulerende potentiale med akaciegummi er af stor interesse. Akaciegummi, som også indeholder polysaccharider og glycoproteiner, har vist sig at være immunpotenserende. At belyse, om PSP direkte aktiverer T-celle-afhængige B-celle-responser

in vivo

, anvendte vi en veletableret hapten bæresystem (nitrophenyl-kylling-gammaglobulin (NP-CGG)). 6-ugers C57BL /6 hanmus blev immuniseret med 50 ug NP

25-CGG alun udfælde intraperitonealt. Mus blev tvangsfodret dagligt med 50 mg /kg PSP i en bærer indeholdende akaciegummi og aflivet på dag 0, 4, 7, 10, 14 og 21. ELISA blev anvendt til at måle den totale og relative hapten-specifikke anti-NP IgA, IgM og IgG titreringsniveauer sammenlignet med kontroller. Det blev konstateret, at PSP, kombineret med akaciegummi, signifikant forøget total IgG titreringsniveauer på dag 4 (P 0,05), faldt IgM titreringsniveauer på dag 4 og 21 (P 0,05) uden observeret i IgA eller IgE titer ændringer niveauer på ethvert af de målte tidspunkter. Vores resultater tyder på, at mens PSP kombineret med akaciegummi synes at udøve svage immunologiske virkninger gennem specifik T-celle-afhængige B-celle responser, de sandsynligvis være bred og ikke-specifik der understøtter den aktuelle litteratur på PSP. Vi rapporterer for første gang anvendelsen af ​​en veletableret hapten-bærer-system, som kan anvendes til at karakterisere og afgrænse specifik T-celle-afhængige B-celle responser af potentielle immunmodulatoriske glycoprotein-baserede plantelægemidler kombinationer

in vivo

Henvisning:. Sekhon BK, Roubin RH, Li Y, Devi PB, Nammi S, Fan K, et al. (2016) Evaluering af Selected immunmodulatorisk glycoproteiner som et supplement til Cancerimmunterapi. PLoS ONE 11 (1): e0146881. doi: 10,1371 /journal.pone.0146881

Redaktør: Valerie A. Ferro, University of Strathclyde, Storbritannien

Modtaget: August 12, 2015; Accepteret: December 24, 2015; Udgivet: 22 Jan 2016

Copyright: © 2016 Sekhon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Cancer Institute NSW:. DMS; National Institute of Complementary Medicin. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

unddrage immun ødelæggelse er blevet anset som en ny kendetegnende for kræft [1]. Navnlig kan fraværet af stærke cancerantigener, tab af MHC klasse I eller stimulerende og eller co-stimulerende molekyler resulterer i svigt i T-celle-genkendelse, antigenpræsentation og tumor elimination [2,3]. De bivirkninger forbundet med kemoterapi steder ekstra byrde på værtens evne til at iværksætte en effektiv immunrespons mod antigener og kompromitteret immunsystem er derfor sårbar over for potentielt livstruende infektioner [4]. Forsøg på at målrette og stimulere den undertrykte værtens immunreaktion mod sådanne overgreb er blevet mødt med blandet succes i leveringen af ​​effektive behandlinger. Selvom forskellige immunterapeutiske tilgange såsom dendritceller vaccination besidder lav toksicitet, desværre de sjældent overstige et objektivt klinisk tumor responsrate på 15% [5]. Behandlingsformer såsom tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) protokoller er for nylig blevet evalueret i en samlet analyse rapporterer en 20% komplet responsrate med en 70% samlet objektive responsrate hos patienter med melanom [6]. Cytokin behandlingsformer, især systemisk indgivelse af IL-12 er blevet forbundet med alvorlige bivirkninger, og en meget snæver terapeutisk indeks [7]. Kun få sådanne kliniske forsøg administrerer IL-12 i kræftpatienter har viste opmuntrende resultater [7]. , Immunterapi med andre interleukiner såsom høj dosis IL-2 er dog stadig at være en effektiv behandling for de sidste 20 år i patienter med metastatisk renalcellecarcinom, giver veldokumenterede komplette holdbare svar i 10-15% af udvalgte patienter [8] . Antistof-medieret terapier såsom udvikling af monoklonale antistoffer er blevet anvendt med succes målrette forskellige receptorer, herunder VEGF, EGFR, Her-2 udøver forskellige virkninger på forskellige kræftformer resulterer i forlænget overlevelse [9]. Især udviklingen af ​​fuldt humaniseret IgG1 monoklonalt antistof Ipilimumab målretter den cytotoksiske T-lymfocyt antigen-4 (CTLA-4) på ​​overfladen af ​​hjælper-T-celler og derved at hindre udviklingen af ​​immuntolerance. Ipilimumab er godkendt af FDA til behandling af melanom [10]. For nylig har opdagelsen af ​​MDX-1106 (nivolumab), et fuldt humaniserede IgG4 checkpoint inhibitor mål programmerede død 1 (PD-1) udøver immunosuppressive virkninger på T-celler forhindrer tolerance. Fase I og II studier er blevet udført på forskellige kræftformer, viser objektive tumorrespons og forbedre den samlede overlevelse af avancerede melanom patienter [11]. Som følge heraf er nivolumab blevet godkendt af FDA til behandling af patienter med inoperabel eller metastatisk melanom, som ikke længere reagerer på andre lægemidler, og patienter med metastatisk skællede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) med progression på eller efter platinbaseret kemoterapi. Målet er at udvikle og kombinere forskellige terapeutiske strategier sammen, der leverer bredspektrede effekter med potentielt mindre toksicitet samtidig minimere modstand og derved forbedre behandlingsresultater for dem med kræft. Thalidomid er et sådant stof, der anvendes til en effektiv styring af myelomatose, besidder komplekse, men mangesidede effekter, herunder potent cytotoksisk og immunmodulerende aktiviteter [12]. Navnlig thalidomid har evnen til at stimulere prognostisk signifikante cytotoksiske T-celler responser i patienter med myelomatose [13] og Waldenströms makroglobulinæmi [14].

Talrige ernæringsmæssige interventioner har vist potentiale i modulering af dsyregulated immunrespons. Især har champignon derivater blevet godt undersøgt og vides at besidde immun-stimulerende virkninger, men klart bevis for deres evne til at forøge immunologiske reaktioner mod specifikke antigener langsomt er på vej [15]. Proteinbundne polysaccharider eller polysaccharopeptides (PSP), er en klasse af forbindelser fundet rigeligt i visse svampe og er ofte blevet brugt som biologiske respons modifiers (BRM) i Østasien [16]. PSP afledt af

Coriolus versicolor

er blevet rapporteret at styrke immunsystemet, og være en kraftig immunmodulator mod kræft og infektioner [17-19]. Immunstimulerende virkninger af PSP omfatter forhøjelse af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom interferon γ (IFN-y), interleukiner, såsom IL-2; naturlige dræber (NK) celleaktivitet, aktivering af komplement (C3), og T-celleproliferation [20]. Vigtigt er det, vi tidligere rapporteret, at PSP opregulerer procentdelen af ​​monocytter, men ændrede ikke T-celle-undergrupper, NK-celler eller B-celler [21]. Især har vi ikke finde nogen signifikante forskelle i CD4 /8-forholdet efter PSP behandling [21]. Dette fund understøtter kliniske undersøgelser, der har rapporteret nogen væsentlige ændringer i CD4 /8-forholdet efter PSP behandling [22,23]. Mens vores tidligere undersøgelse på PSP blev gennemført in vitro, var det ikke tager hensyn til spørgsmålene om biotilgængelighed eller dens virkninger på leveren stofskifte. Det er sandsynligt, at de negative T-celle resulterer kan skyldes fraværet af en fuldstændig intakt immune triade af DC, T- og B-celler. En genfremsat undersøgelse med dyr er derfor afgørende, og emnet for denne undersøgelse.

I T-celle afhængige B-celle antistofrespons, et antigen taget op af DC eller makrofager præsenteres for naive T-hjælper celler, hvor beslægtede interaktion mellem B-celler kan forekomme. B-celle med den samme specificitet som et særligt T-celle opsluger og fordøjer antigenet og viser de antigene fragmenter bundet til dens unikke MHC II-molekyler på sin overflade til yderligere præsentation. Et modent matching T-celle interagerer med B-celle- og udskiller cytokiner, der fører til celledeling af B-celler og antistofproduktion. Denne proces kan føre til produktion af memory B-celler (figur 1).

Interessant, meget af data (herunder vores egen) antyder en forøgelse af cytokinniveauer og immunologiske delmængder tillagt ved PSP manglende -specifikke men brede spænder aktiviteter. Hvorvidt PSP udøver T-celle-afhængige B-celle-antistofresponser, eller T-celle-uafhængige B-celle-antistofresponser er ikke blevet belyst dels på grund af mangel på egnede assays, herunder dyremodeller. Et forsøg på at vurdere adjuverende effekter af vaccination med glycoprotein-baserede urtemedicin med immunmodulerende potentiale (især

Astragalus

og betalingsformidlere fra

Coriolus versicolor

) parret med KLH-konjugater er blevet udført [24,25] . Mens denne undersøgelse var i stand til at demonstrere væsentlige adjuvans effekter med disse plantelægemidler, KLH-modeller præsentere en række begrænsninger. For det første B-celle respons til komplekset KLH-proteinet er et polyklonalt respons i forhold til et bredt repertoire af antigene epitoper gør bestemmelse af specifikke reaktioner såsom T-celle afhængige B-celle-responser umulige. For det andet denne T-celle afhængige B-celle respons i KLH model spænder forlængelse af gyldighedsperioden gør det vanskeligt at skelne mellem direkte og indirekte virkninger. Adjuvansvirkningerne af vaccination med glycoprotein-baserede naturlægemidler lægemidler i denne KLH undersøgelse vil sandsynligvis være bred og ikke-specifik. Derfor NP-CGG model adresser begge disse begrænsninger i KLH-modellen i at kunne bestemme direkte og specifikke T-celle afhængige B-celle-adjuvansvirkninger af immunmodulerende naturlægemidler kombineret med immunopotenserende midler. For at maksimere den milten immunreaktion, blev NP-CGG administreret via i.p. rute. Da dette er et mekanistisk forsøg for at bekræfte adaptiv immunitet, er der ingen eventuel klinisk anvendelse for NP-CGG model via i.p. selve ruten. Ved at måle de specifikke anti-NP-responser på forskellige tidspunkter, kan et synkront T-celle-afhængig B-celle-respons skitseres klart.

Vi rapporterer her for første gang anvendelsen af ​​en veletableret hapten -carrier systemet NP-CGG at karakterisere og afgrænse de specifikke T-celle afhængige B-celle immunologiske responser i overværelse af PSP, et almindeligt anvendt hjælpestof til cancer-immunterapi. T-celle afhængige B-celle antistofrespons især har et enormt potentiale for at tillægge adaptiv immunitet mod kræft-antigener (øget aviditet) [26-28]. Derfor PSP evne til at udøve T-celle afhængige responser

in vivo

er derfor meget ønskeligt og er blevet undersøgt i denne undersøgelse.

Vi antager, at i NP-CGG model, PSP udøver sin immunologiske virkninger gennem T-celle-afhængige B-celle-interaktioner ved at ændre den efterfølgende immunoglobulin (Ig) isotype klasse samt mængden af ​​Ig i dyr oprindeligt udfordret af NP-CGG og efterfølgende givet PSP.

Mens det er godt fastslået, at i denne model peak antistof produktion af specifikke klasser forekommer ved specifikke tidspunkter (IgM = dag 10, IgG = dag 14, IgA = dag 18 [29]), kan alle udbygninger af PSP let bestemmes. Det er tidligere blevet vist, at for primære responser mod NP, findes der en indledende forsinkelsesfase på 3-4 dage T-celle priming [30]. Derefter NP-specifikke B-celler vil blive rekrutteret til milt-antistofresponser, aktiveret og vokse eksponentielt. Disse B-cellekloner derefter enten udvikle sig til kortlivede plasmablasts i extrafollicular foci, eller migrere ind follikler, hvor de danner kimcenter langlivede plasmaceller. Ikke alene har de levetider af plasmaceller fra disse to kilder er forskellige, kimcentret-afledte plasmaceller har vist sig at være af meget højere tilhørsforhold mod specifikke immunogen [30]. Denne forbedrede antigen-antistof blinding vil have en vigtig rolle for effektive B-celle-effektorfunktioner, og dermed klinisk relevante virkninger. Formålet med undersøgelsen var at bestemme de antistofresponser på forskellige tidspunkter og vurdere klassen af ​​immunoglobulin de producerede. Vores undersøgelse giver os mulighed for at belyse virkningsmekanismen af ​​en klinisk anvendelig urtemedicin som supplement til kræftbehandlingen. Acacia er en velkendt immunpotentiator, hvor undersøgelser har vist, at arabisk gummi kan aktivere dendritiske celler [31], giver medfødte og adaptive immunitet (Strobel og Ferguson, 1982) [32] samt udøve anti-parasitære effekter

i vivo

[33]. Desuden Strobel og andre (1986) senere vist sig, at akaciegummi kan anvendes til at inducere oral tolerance afhængigt af den anvendte model [34]. I vores undersøgelse blev akaciegummi brugt som immunopotentiator at udforske de kombinerede effekter med PSP at bestemme, om T-celle afhængige B-celler svar blev forbedret i forhold til akaciegummi alene

Materialer og Metoder

Dyr og kost

5 uger gamle C57BL /6 hanmus blev opnået fra The Animal Resource Centre (Canning Vale, Australien) og vedligeholdes i en SPF-facilitet med bestrålede fødevarer og vand ad libitum.

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i laboratoriet animal Services standardprocedurer og politikker, der udvikles af University of Sydney. Protokollen blev godkendt af Animal Ethics Committee fra University of Sydney (Godkendelse nr: L24 /2-2007 /1/4484). Se flow diagrammet i figur 2. Alle mus blev overvåget regelmæssigt og især efter hjælp af sondeernæring og immunisering for eventuelle sundhedsskadelige problemer og forvaltes i overensstemmelse hermed. Passende fremgangsmåder til eutanasi blev udført.

5 uger gamle mus fik lov at akklimatisere sig i en uge, immuniseret med NP

25-CGG ved 6 uger, blev grupper af mus derpå tvangsfodret dagligt med PSP, akacie eller MQ i op til 21 dage og aflivet på forskellige tidspunkter (dag 0, 4, 7, 10, 14 og 21).

Immunisering og antigen

4-hydroxy- 3-nitrophenylacetyl (NP) hapten konjugeret til kylling γ-globulin (CGG) (NP

25-CGG, Biosearch Technologies, Novato, CA) blev udfældet i alun [35]. 6 uger gamle mus blev immuniseret med 50 ug alun bundfald (i 200 pi PBS) injiceret i.p. ved baseline (dag 0) og derefter opdelt i 4 grupper: NPCGG = ingen sonde kontrol eller ubehandlet kontrol, kontrol MQ = MQ vand køretøj, ACACIA = akacie gummi, PSP = PSP behandlede

PSP og serum samling

Polysaccharopeptide (PSP) afledt fra det kinesiske

Cov-1

stamme af

Coriolus versicolor

(Winsor Health Products Ltd, Hong Kong) blev opnået, og tidligere [21] beskrevet. PSP blev suspenderet i 5% steriliseret akaciegummi i MQ vand (Sigma, St. Louis, MO, USA) i en endelig koncentration på 5 mg /ml. 50 mg /kg (200 pi), i PSP blev administreret dagligt til musene i behandlingsgruppen ved oral sondeernæring (PSP) og standset efter 21 dage. Da akaciegummi var den immunmodulerende potentielle baseline for undersøgelsen blev PSP administreres sammen med arabisk gummi. Alle potentielle immunmodulatoriske virkninger af PSP vil forventes at være større end dem af akaciegummi. De resterende mus kontroller og administreret akaciegummi (ACACIA), MQ vand (MQ), eller ingen sonde (NP-CGG). PSP blev ikke administreret til mus i MQ gruppe

Grupper på 6 mus blev derefter aflivet sekventielt ved baseline (dag 0).; 4, 7, 10, 14 og 21 dage efter immunisering. PSP og akacie behandlede mus blev aflivet på dag 4, 7, 10, 14 og 21; mens MQ og NP-CGG behandlede mus blev aflivet dag 10 og 21. Serum blev indsamlet på alle disse tidspunkter.

Konjugation af NP succinimidester til protein luftfartsselskaber

Brug den metode, Lalor [36] succinimid ester af NP (4-hydroxy-5-iod-3-nitrophenyl) caproat-O-succinimid (NIP-OSu) (Biosearch Technologies, Novato, CA, USA) blev konjugeret til bovint serumalbumin (BSA; Sigma), hvilket giver et omtrentligt substitution forhold på NP

2-BSA og NP

18-BSA henholdsvis.

Påvisning af NP-specifikt antistof i serum ved ELISA

NP-specifik serum IgM, IgG, IgA og IgE blev kvantificeret ved ELISA på forskellige tidspunkter. For at bestemme om PSP kunne forøge overvejende tidligt IgM-antistof reaktion på NP-CGG der topper på dag 10 målte vi serumniveauer af mus ved 0, 4, 7, 10, 14 og 21 dage efter immunisering. Ligeledes at vurdere ændringer i IgA responser på NP-CGG som topper på dag 18 målte vi serum titreringsniveauer af mus ved 0, 10, 14 og 21 dage efter immunisering. For at undersøge om PSP har potentiale til at forøge eventuelle langsigtede immunologiske responser, der opstår efterfølgende 14 dage immunisering vi målte høj affinitet og total IgG antistofresponser mod NP-CGG ved direkte ELISA under anvendelse af NP

2-BSA og NP

18-BSA som henholdsvis belægningen proteinet. Serumtitere blev bestemt ved 0, 4, 7, 10, 14 og 21 dage efter immunisering på NP

25-CGG. For at udelukke eventuelle inflammatoriske eller allergiske reaktioner, der kan være sket som reaktion på administration af PSP i en længere periode, vi målte IgE titreringsniveauer 7 dage efter immunisering. Kort fortalt plader med 96 brønde blev overtrukket med enten 100 ul 5 ug /ml NP

2-BSA eller NP

18-BSA i 0,5 M carbonatbuffer (pH 9,6) ved 4 ° C natten over og blokeret med 1% BSA i PBS. Efter fire vaske med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), blev serielt fortyndede serumprøver tilsat til hver brønd in duplo og inkuberet i 1 time ved 37 ° C i en fugtig boks. Efter vask, biotin-konjugeret ged anti-mus IgM, IgG, IgA (Caltag Laboratories) eller IgE (Southern Biotech) fortyndinger i området fra 1: 3000 til 1: blev 10000 tilsat og inkuberet i 1 time ved 37 ° C i en fugtig boks . SA-HRP-aktiviteten blev visualiseret under anvendelse af O-phenylendiamin (OPD; Sigma). Efter udvikling det farvede Reaktionen blev standset med 50 pi 20% H

2SO

4 og optiske densiteter blev bestemt ved 492 nm under anvendelse af en POLARstar pladelæser (BMG Labtech, Australien). Positiv kontrol sera blev medtaget, så standard kalibreringskurver til bestemmelse af relative antistoftitre kunne produceres.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af ikke-parametrisk Kruskall-Wallis eller

post-hoc

Mann-Whitney test når det er hensigtsmæssigt. Statistisk signifikans blev nået, når p 0,05 sammenlignet med kontrolgrupperne.

Resultater

Acacia og PSP har ingen effekt på krop og milt vægte

Som PSP og Acacia er begge kendt for at være immunopotentiatorer, det er sandsynligt, at eventuelle forbedrede immunreaktioner forårsaget af disse agenter i NP-CGG model forventes at forekomme i milten og afspejles i ændringer i milten vægt. Kropsvægten blev også vurderet til at svare til eventuelle ændringer i milten vægt og udelukke eventuelle negative virkninger af PSP og Acacia som måske omvendt ses i et fald i kropsvægt. Vi fandt ikke nogen betydelig forskel i kropsvægt af mus før eller under immunisering (tabel 1). Der var heller ingen signifikant variation i kropsvægt af mus i mellem grupperne eller på forskellige tidspunkter, undtagen på dag 21, hvor NPCGG og MQ (P 0,05) var signifikant øget sammenlignet med ACACIA (tabel 2). Der er en tendens til stigende milt vægt set fra dag 7-14 i ACACIA gruppen selvom denne stigning ikke nåede statistisk signifikans. Samlet var der ingen signifikant variation i milt vægte ved døden mellem grupper (tabel 3). Vejviser

PSP falder NP-specifikke IgM titreringsniveauer på dag 4 og 21

Vi vurderede IgM titreringsniveauer da de er de første antistof, der skal produceres af B-celler mod et antigen i mus og mennesker ens og er især potente i aktivering af komplementsystemet. IgM titreringsniveauer blev vurderet ved hvert tidspunkt (dag 4, 7, 10, 14 og 21) for at afgøre, om PSP kombineret med Acacia kunne forøge den kendte IgM titer niveau som pr NP-CGG model. I denne model vil vi forventer, at IgM titer niveau at toppe på dag 10. Eventuelle afvigelser såsom et skift i denne top eller tidligere eller senere ændringer vil blive afspejlet i dette maksimum forekommer på forskellige tidspunkter. Interessant fandt vi et signifikant fald i serum NP specifikke IgM titreringsniveauer i musene behandlet med PSP på dag 4 og 21 (fig 3B og 3F) sammenlignet med dem behandlet med Acacia (P 0,05). I modsætning hertil fandt vi en signifikant stigning i Acacia gruppen end i NP-CGG kontrolgruppen (P 0,05) på dag 21 (figur 3F). MQ udviste en lille stigning i serum NP specifikke IgM titreringsniveauer på dag 10, som er tydeligere på dag 21 (fig 3D og 3F), selv om de ikke var signifikant forskellige fra nogen af ​​de andre grupper. Der var ingen signifikante forskelle i NP specifikke IgM titreringsniveauer på 7, 10 eller 14 dage efter immunisering i PSP eller akacie-grupper eller i MQ eller NP-CGG kontrolgrupper (P 0,05) (Fig 3C-3E).

C57BL /6 mus blev immuniseret med NP

25CGG og serum blev opsamlet på dag 0, 4, 7, 10, 14 og 21. NP-specifikke IgM-titere blev målt fra dobbelt seriefortyndet ( 1 /40-1 /80) serumprøver ved ELISA. ACACIA steg betydeligt NP-specifik IgM-responser på dag 21 sammenlignet med NP-CGG alene. Data er vist som medianen fra to uafhængige forsøg med 5-6 mus pr gruppe. * P 0.05.

PSP øger NP-specifikke IgG titer niveauer på dag 4

Vi vurderede IgG niveauer som da de følger produktionen af ​​IgM og IgA dog mere potent i længere sigt sekundær immun besvarelser, blev IgG titreringsniveauer vurderes ved hvert tidspunkt (dag 4, 7, 10, 14 og 21) med henblik på at afgøre, om PSP kombineret med Acacia kunne forøge den kendte IgG titer niveau som pr NP-CGG model. I denne model vil vi forventer, at IgG titer niveau at toppe på dag 14. Eventuelle afvigelser såsom et skift i denne top eller tidligere eller senere ændringer vil blive afspejlet i dette maksimum forekommer på forskellige tidspunkter. Vi fandt en signifikant stigning i den lave affinitet NP-specifik IgG serum titreringsniveauer i mus behandlet med PSP på dag 4 sammenlignet i Acacia (P 0,05) som vist i fig 4. Denne stigning i titer niveau på dag 4 forekommer meget tidligere end forventet. Forholdet mellem ekspressionen af ​​den samlede høj affinitet til det lavaffinitets NP-specifik IgG antistofrespons var signifikant for ACACIA på dag 4 (P = 0,008) sammenlignet med PSP (Fig 4). MQ udviste en svag stigning i NP specifik IgG serum titreringsniveauer på dag 10, som er tydeligere på dag 21 (fig 4D og 4F) for både den samlede høj affinitet og lav affinitet responser selv om de ikke var signifikant forskellige fra nogen af andre grupper.

Ekspression af den samlede høj affinitet og lav affinitet NP-specifikke IgG-titere blev målt fra to gange serielt fortyndede serumprøver (fra 1 /40-1 /80 for dag 4 til 1 /8000- 1/10000 til dag 10 og frem) ved hjælp af NP

2-per BSA (NP

2) og NP henholdsvis

18-per BSA (NP

18) ved ELISA. Den lave affinitet NP-specifikke IgG-antistofresponser i Acacia var signifikant på dag 4, men på intet andet tidspunkt (dag 7, 10, 14 eller 21) i forhold til PSP. Forholdet mellem ekspressionen af ​​samlede høj affinitet og lav affinitet NP-specifikke IgG-responser var signifikant for ACACIA på dag 4 i forhold til PSP. NP

2 baseline meget lave (data ikke vist). Data er vist som medianen fra to uafhængige forsøg med 5-6 mus pr gruppe. * P 0.05.

Samlet set har vi ikke finde nogen signifikante forskelle i angivelsen af ​​de samlede høj affinitet eller lav affinitet NP-specifikke IgG serumniveauer til NP-CGG på nogen af ​​de andre tidspunkter eller grupper (P 0,05).

PSP ændrer ikke NP-specifik IgA titreringsniveauer

Vi vurderede IgA titreringsniveauer da de er det første niveau af forsvar fungerer som et neutraliserende antistof mod antigener invaderende gennem slimhinden. IgA titreringsniveauer blev vurderet ved hvert tidspunkt (dag 4, 7, 10, 14 og 21) for at afgøre, om PSP kombineret med Acacia kunne forøge den kendte IgA titer niveau som pr NP-CGG model. I denne model vil vi forventer, at IgA titer niveau at toppe på dag 18. Eventuelle afvigelser såsom et skift i denne top eller tidligere eller senere ændringer vil blive afspejlet i dette maksimum forekommer på forskellige tidspunkter. Som sådan har vi ikke finde nogen væsentlige forskelle i de NP-specifikke IgA serumniveauer på nogen af ​​den tid undersøgte punkter eller i nogen af ​​grupperne (P 0,05). (Fig 5)

Efter NP CGG immunisering blev observeret nogen ændringer i IgA-antistofreaktioner på ethvert tidspunkt (dag 0, 10, 14 eller 21) til PSP eller akacie. NP specifikke IgA titre blev målt fra to gange serielt fortyndet (1 /50-1 /100) serumprøver ved ELISA. Data er vist som medianen fra to uafhængige forsøg med 5-6 mus pr gruppe.

PSP ændrer ikke NP-specifikke IgE titreringsniveauer

Vi vurderede IgE titreringsniveauer at regere ud af, om PSP er stand til at inducere allergene virkninger i denne model, idet antigenbinding kan udløse mastcelle at frigive kemiske mediatorer såsom histamin, som inducerer anti-parasit immunitet og allergi. Vi fandt ingen signifikante ændringer i IgE niveauer på dag 10, 14 eller 21 i PSP behandlede gruppe sammenlignet med baseline (NP-CGG gruppe på dag 0 efter immunisering) (P 0,05), som det ses i figur 6. Det er usandsynligt, at PSP udøver allergiske reaktioner i denne model.

Efter NP-CGG immunisering ingen ændringer i IgE antistof-reaktioner blev observeret ved et hvilket som helst tidspunkt (dag 4, 7, 10, 14 eller 21) til PSP NP specifik IgE-titere blev målt fra to gange serielt fortyndede (1 /5-1 /20) serumprøver ved ELISA. Data er vist som medianen fra to uafhængige forsøg med 5-6 mus pr gruppe.

Diskussion

Kræft immunosurveillance opstår, når immunforsvarets kontrol processer er svækket, hvilket resulterer i en manglende evne til korrekt at identificere, effektivt målrette og ødelægge cancerceller som kan føre til tumorvækst og metastase. For nylig, “kræft immunoediting” er blevet brugt til at beskrive denne dynamiske proces udelukkelsesmetoden, ligevægt og flygte [37]. Mens immunterapi er en sund målrettet tilgang til at løse og forøge hver af disse processer, brug af plantelægemidler giver store løfter. Polysaccharopeptides såsom PSK og PSP afledt af champignon

Coriolus versicolor

er blevet godt undersøgt og foregav at styrke immunsystemet med brede spænder anti-cancer aktiviteter, der giver en overlevelse fordel hos kræftpatienter [38]. PSK (også kendt som krestin) er blevet anvendt i Japan som adjuvans til konventionelle anti-cancer behandlinger siden 1977 [39].

Tilsvarende har PSP blevet anvendt som en immun enhancer i Kina og har været genstand for 30 års forskning; Men trods omfattende

in vitro

,

in vivo

og kliniske studier, den specifikke immunologiske virkningsmekanisme er endnu ikke klart. Vi er de første til at rapportere anvendelsen af ​​en veletableret

in vivo

model NP-CGG til naturmedicin med immunterapeutisk potentiale. Vi rapporterer, at PSP ikke udøver specifikke immunologiske virkninger gennem T-celle afhængige B-celle responser. Dette kan ses i mangel af væsentlige ændringer i de forskellige anti NP-immunoglobuliner testet herunder IgM, IgG, IgA eller IgE (figur 3-6). Selvom vi observeret et statistisk signifikant fald i det specifikke IgM titer niveau serum i mus behandlet PSP på dag 4 og 21 (fig 3B og 3F) sammenlignet med dem behandlet med ACACIA (P 0,05), disse resultater selv om små indikerer en tendens. Derudover observerede vi en signifikant stigning i det samlede IgG titeren hos mus behandlet med PSP på dag 4 sammenlignet i Acacia (P 0,05) som vist i fig 4. I forhold til de kendte mekanik af NP-CGG model, IgG reaktioner er sandsynligvis vil forekomme på dag 14 og frem [30], disse tidlige ændringer, der observeres er små, men lavere end forventet. Mens PSP ikke signifikant ændrer IgE titreringsniveauer i mus behandlet med PSP (Fig 6), er det usandsynligt, at PSP bidrager til allergiske reaktioner. I denne undersøgelse har vi vist en konsekvent stigende tendens i alle Ig klasser, undtagen IgE, til NP-CGG af PSP. Dette er i overensstemmelse med isotypeskift IgM til IgG. IgA-reaktioner frafald over tid som forventet på grund af tolerance skyldes konsekvent slimhinder stimulering af hjælp af sondeernæring. PSP derfor producerer små virkninger på T-celle afhængige B-cellereaktioner

in vivo

. Der er en tendens til stigende miltvægten set fra dag 7-14 i gruppen vægt ACACIA med en tilsvarende reduktion i kropsvægt, selv om denne stigning ikke nåede statistisk signifikans. Derudover har vi ikke observere nogen væsentlige ændringer i kroppen eller milt vægte i nogen af ​​grupperne målt på grund af tilsætningen af ​​PSP (tabel 2 og 3) eller bivirkninger forbundet med immunisering. vægte Øget krop inden grupper var som forventet.

Interessant, virkningerne af arabisk gummi på T-celle afhængige reaktioner er af betydning. I modsætning til PSP, fandt vi en signifikant stigning i IgM titer niveau i Acacia gruppen end i NP-CGG (P 0,05) på dag 21 (fig 3F), som er senere end forventet som IgM topper på dag 10. Interessant nok er forholdet mellem ekspressionen af ​​det samlede høj affinitet og lav affinitet NP-specifik IgG antistofrespons var signifikant for ACACIA på dag 4 (P = 0,008) sammenlignet med PSP (fig 4), også tidligere end forventet forekommende. Der var en lille, men ikke-signifikant stigning i serum NP specifikt IgM og IgG titer niveauer for MQ, navnlig på dag 21, som kan skyldes den større variation af individuelle svar observeret inden for denne særlige gruppe (P 0,05). Derudover fandt vi ikke nogen signifikante forskelle i udtryk for den samlede høj affinitet eller lav affinitet IgG serumniveauer til NP-CGG på nogen af ​​de andre tidspunkter eller grupper (P 0,05). Selv om disse resultater antyder, at ACACIA kunne påvirke T-celle-afhængige B-celle-responser, fold forskelle er små og skal bekræftes. Undersøgelser har vist, at arabisk gummi kan aktivere dendritiske celler [31], giver medfødte og adaptive immunitet samt udøve anti-parasitære effekter

in vivo

.