PLoS ONE: Hyppig Ændring af MLL3 rammeforskydningsmutationer i mikrosatelitter Mangelfuld Kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

MLL3 er en histon 3 lysin 4 methyltransferase med tumor-suppressor egenskaber, der tilhører en familie af kromatin regulator gener potentielt ændret på neoplasi. Mutationer i MLL3 blev fundet i en hel genom analyse af kolorektal cancer, men er ikke blevet bekræftet af en separat undersøgelse.

Metoder og Resultater

Vi analyserede mutationer af kodende region og promotor methylering i MLL3 hjælp 126 tilfælde af kolorektal cancer. Vi fandt to isoformer af MLL3 og DNA-sekventering afslørede læserammeforskydning og andre mutationer, der påvirker både isoformer af MLL3 i kolorektale cancerceller og 19 i 134 (14%) primære kolorektale prøver analyseret. Desuden læserammeforskydningsmutationer var mere almindelig i tilfælde med både i CRC cellelinjer og primære tumorer mikrosatellit instabilitet (31%). Den største isoform af MLL3 transkriberes fra en CpG ø-promoter, der har stærkt homologi med en pseudo-genet på kromosom 22 (psiTPTE22). Ved hjælp af en analyse, som målt både loci samtidigt fandt vi fremtrædende aldersrelateret methylering i normal kolon (fra 21% til personer under 25 år til 56% hos personer ældre end 70, R = 0,88, p 0,001) og hyppig hypermethylering (83 %) i begge CRC-cellelinjer og primære tumorer. Vi næste undersøgt de to loci separat og fandt, at alder og cancerrelaterede methylering udelukkende var en egenskab af pseudogenet CpG øen og at MLL3 loci var umethyleret.

Konklusioner

Vi fandt, at læserammeforskydningsmutationer af MLL3 i både CRC-celler og primære tumor, der var mere almindelig i tilfælde med mikrosatellit ustabilitet. Desuden har vi vist CpG ø-associeret promotor fra MLL3 genet har intet DNA-methylering i CRC-celler, men også primær tumor og normal colon og denne region har en stærkt homologe pseudo-gen (psiTPTE22) der var alder relaterer DNA-methylering.

Henvisning: Watanabe Y, Castoro RJ, Kim HS, North B, Oikawa R, Hiraishi T, et al. (2011) Hyppig Ændring af MLL3 rammeforskydningsmutationer i mikrosatelitter Mangelfuld kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (8): e23320. doi: 10,1371 /journal.pone.0023320

Redaktør: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Spanien

Modtaget: 10. februar, 2011; Accepteret: 15 Juli 2011; Udgivet: 11 August, 2011

Copyright: © 2011 Watanabe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Tilskud # CA098006 og CA105346. J-PJI er en American Cancer Society Clinical Research Professor understøttet af en generøs gave fra F. M. Kirby Foundation. DNA-sekventering i Core Sequencing facilitet på M. D. Anderson Cancer Center er støttet af Core Grant # CA16672 fra National Institutes of Health. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i kolorektal cancer (CRC), en systematisk analyse af 13,023 godt kommenterede humane protein-kodende gener afsløret mutationer i 69 kandidatgener [1]. Blandt disse blev histon methyltransferase genet blandet afstamning leukæmi 3 (MLL3) muteret i 6 tilfælde. MLL3 er medlem af TRX /MLL genet familie og kort til kromosom 7q36.1. Det koder et forudsagt protein på 4911 aminosyrer indeholdende to plante homeodomains (ph.d.), en ATPase alpha /beta signatur, en høj mobilitet gruppe, et sæt (undertrykker af variegation, Enhancer af Zeste, Trithorax) og to FY (phenylalanin tyrosin) rig domæner. PHD og SET domæner proteiner er kromatin regulatorer og flere af dem er ændret i kræft [2]. Inaktivering af MLL3 i mus resulterer i epiteltumor dannelse, hvilket antyder, at den fungerer som et tumor-suppressor-genet [3]. Også MLL3 er blevet rapporteret at være hyppigt slettet i myeloide leukæmier [4], [5]. Desuden andre rapporter viser somatiske mutationer i MLL3 genet i glioblastom og pancreatisk ductal adenocarcinom [6]. Imidlertid har efterfølgende rapporter endnu ikke bekræftet MLL3 mutationer i tyktarmskræft [7]. Således forbliver den rolle, MLL3 i patogenesen af ​​colorektal neoplasi ufuldstændigt defineret.

I dette papir, undersøgte vi MLL3 ændringer i coloncancer og fandt en to isoform af MLL3 hvoraf længere isoform har tidligere indregnet CpG ø overlapper promotoren. Desuden fandt vi nye genetiske ændringer i CRC-cellelinjer og også primære tumorer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af University of Texas MD Anderson Cancer center og Yonsei Universitet Wonju Christian Hospital Institutional Review Board, og skriftligt informeret samtykke blev opnået.

cellelinjer og Prøver

Otte kolorektale cancer cellelinjer (DLD1, SW48, RKO, HCT116, Caco2, SW620, LoVo og SW480) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinier blev opretholdt i passende medier indeholdende 10% føtalt bovint serum i plast dyrkningsplader. DNA blev ekstraheret under anvendelse af standard phenol-chloroform fremgangsmåden, og totale RNA’er blev ekstraheret fra de høstede celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) [8]. Vi studerede 72 prøver af primære kolorektale tumorer opnået fra Yonsei University Wonju Christian Hospital (Wonju, Sydkorea) og 54 prøver af primære kolorektale tumorer og 8 tilstødende normal- optræder væv fra patienter på M. D. Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Vi studerede også colon biopsi prøver fra 21 personer uden familie historie af kolorektal cancer og ingen colon læsioner på screening total koloskopi.

Mutation og DNA-methylering Analyse

DNA isoleret fra groft Mikrodissekterede kræftformer blev analyseret at bestemme somatisk mutation af MLL3 hjælp direkte sekventering, og begge methylering status MLL3 og pseudo-gen psiTPTE22 (pseudo-genet af transmembrane phosphatase med tensin homologi på kromosom 22) ved anvendelse af bisulfit pyrosekventering [9]. Direkte sekventering analyse blev udført for at identificere mutationer i alle 59 MLL3 exoner ved hjælp af både genomisk DNA og cDNA af otte kolorektale cancercellelinjer og bekræfte disse sekvenser af mutation regioner under anvendelse af genomisk DNA fra to forskellige sæt af primære CRCs (tabel 1). Primersekvenser blev beskrevet i tabel S1. Alle primere blev syntetiseret af Invitrogen (San Diego, CA). PCR blev udført i 22,5 pi Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, San Diego, CA), 5 uM frem og 5 pM reverse primere og 10 ng genomisk DNA. Reaktioner blev udført i 96-brønds MJ thermocyclere (MJ Research, Waltham, MA) under anvendelse af 30 cykler af PCR-amplifikation protokol (denaturere 94c i 30 sekunder; annealer 55c i 30 sekunder; forlænge 68c i 60 sekunder). PCR-produkterne blev direkte sekventeret i MD Anderson Core Sequencing Facility.

Separate DNA methylering analyse mellem MLL3 og psiTPTE22 gen CpG øer blev bekræftet af bisulfate direkte sekventering efter TOPO-TA kloning både kolorektale cancer cellelinjer og primære CRCs. Oplysninger om mismatch repair (MMR) mangel i cellelinier blev indsamlet fra offentliggjorte papirer [10], [11] og database Sanger Institute Cancer Genome Project (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI /msi_page.shtml). I de primære kolorektale kræft prøver, vi bestemt fejlparringsreparationsmangel ved mikrosatellit instabilitet (MSI) analyse, som tidligere rapporteret [12]. Alle primersekvenser og PCR-betingelserne er beskrevet i tabel S1.

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Første cDNA blev fremstillet ved revers transkription af 1 ug prøver af totalt RNA ved anvendelse af Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Real-time kvantitativ revers transkription-PCR blev udført ved anvendelse Taqman genekspression Assays [MLL3 exon boundary 1 -2, Hs01005501_m1 (probe A); MLL3 exon grænse 38 -39, Hs01005520_m1 (probe B); MLL3 exon grænse 58 -59, Hs01005539_m1 (probe C) og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hs_00266705_gl (Applied Biosystems)] i kolorektale cancercellelinjer. (Figur 1). Human colon-cDNA (BioChain, Hayward, CA) blev anvendt som normale kontroller; de blev fremstillet fra normal colon slimhinder puljet fra raske forsøgspersoner.

MLL3 transkriberes fra to separate promotorer (pile), og promotoren for det større transskript indeholder et CpG island mens der er ingen i den trunkerede form. Placeringerne af mutationer findes i denne og tidligere rapporter er angivet med pile. Hver pil svarer til et enkelt tilfælde med en mutation, bortset fra den ene region med flere pile, som svarer til polyA tract. MLL3 genet koder et forudsagt protein på 4911 aminosyrer indeholdende to plante homeodomains (ph.d.), en ATPase alpha /beta signatur, en høj mobilitet gruppe, et sæt (undertrykker af variegation, Enhancer af Zeste, Trithorax) og to FY (phenylalanin tyrosin) rige domæner. Hver af mutationer i delprøver blev vist under genomet struktur skema i figur 1.

Western Blotting

Kanin polyklonale anti-MLL3 antistof (SAB1300328 Sigma-Aldrich, St. Louis , MO)) blev anvendt til immunoblotting. Helcellelysater blev fremstillet ved at skrabe monolag af celler ind i assaypuffer uden SDS [indeholdende 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l Tris-HCI (pH 7,2), 1% deoxycholsyre, 1% Triton X-100, 0,25 mmol /l EDTA (pH 8,0), protease og phosphataseinhibitorer, 5 ug /ml leupeptin, 5 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml pepstatin A, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mmol /l NaF, og 100 pmol /l natriumorthovanadat ], og proteinkoncentrationer blev bestemt (Lowry reagens, Bio-Rad, Hercules, CA). Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Statistical Analysis

methylering niveauer opnået ved pyrosekventering (%) blev analyseret som en kontinuerlig variabel for sammenligning af MLL3 gen methylering med clinicopathologic funktioner; betyder, og 95% fortrolige intervaller (CIS) blev beregnet. Tosidet

P

0,05 blev betragtet som signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af PRISM 4 software (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

Resultater

I denne undersøgelse fandt vi hyppige inaktivering af MLL3 af en læserammeforskydningsmutationer i mikrosatellit mangelfuld CRC’er og ingen DNA methylering på MLL3 loci i eventuelle kolon prøver.

for mutation analyse, vi screenede 8 CRC cellelinjer ved hjælp af PCR og sekventering af alle 59 kodende exoner. Vi fandt mutationer i 5 ud af de 8 cellelinier (63,0%). MLL3 har en poly-A (A)

9 tarmkanalen i den kodende sekvens af exon 38, der er inkluderet i det forarbejdede transkript; homozygote læserammeforskydningsmutationer blev fundet i RKO og HCT116, mens heterozygotiske mutationer blev fundet i mikrosatellit ustabile cellelinier SW48 og LoVo. Disse er alle mikrosatellitmarkørerne ustabile cellelinjer. Derudover fandt vi, at SW48 og DLD1 har separate somatiske mutationer i andre kodende regioner af MLL3 (figur 1, 2A). Disse resultater af mutationsanalyse kunne bekræfte anvendelse af cDNA (data ikke vist). Dernæst analyserede vi de 3 somatiske mutation regioner (c.8382delA (læserammeforskydning), c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W)) i et første sæt af 72 primære CRC’er og fundet læserammeforskydning mutationer i (A)

9 tarmkanalen i 10 prøver (MSI-H, 22,9% (8/35); MSS, 5,4% (2/37)) (tabel 1). Vi analyserede derefter 9 somatiske mutation regioner, herunder de 3 steder vi fandt og 6 steder fundet af Sjöblom et al. [1] i et separat sæt af 54 primære CRCs og 21 raske patientprøver (tabel 1). Vi fandt hyppige mutationer inden for (A)

9 tarmkanalen i mikrosatellit ustabile CRCs (28,6%, 4/14, se eksempler i figur 2B), men ingen andre mutationer i disse prøver. Således samlet, fandt vi mutationer i 19/134 analyserede sager (14%). Disse mutationer kan påvises i en bred vifte af den kodende sekvens, med klynger i poly (A) kanal, bekræftet ved vores analyse af mikrosatellit ustabile tumorer.

(A) MLL3 har en poly-A (A)

9 tarmkanalen i den kodende sekvens af exon 38. Homozygote rammeskift mutationer blev fundet i RKO og HCT116, mens heterozygotiske mutationer blev fundet i mikrosatellit ustabile cellelinier SW48 og LoVo. Separate somatiske mutationer blev fundet i SW48 og DLD1 c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W). (B) Heterozygotiske mutationer blev fundet i samme poly-A (A)

9 tarmkanalen i den kodende sekvens af exon 38.

At studere DNA-methylering, vi først bemærkes, at MLL3 transkriberes fra to særskilte promotorer, hvoraf den ene resulterer i en trunkeret version af proteinet (figur 1). Promotoren for den større transskript indeholder en hidtil ukendt CpG øen, men man er ikke til stede i den trunkerede form. Vi analyserede methylering af denne CpG ø hjælp kvantitativ bisulfite- pyrosekventering (eksempler i figur 3A). Vi fandt imidlertid, at CpG øen MLL3 område er stærkt homologe (~92%) til et CpG ø, som overlapper promotoren af ​​et pseudo-genet på kromosom 22 (psiTPTE22, pseudo-gen af ​​transmembrane phosphatase med tensin homologi på kromosom 22 : NR_001591). Faktisk bisulfit pyrosekventering assayet var i stand til at amplificere denne region såvel som angiver muligheden for falske positiver. Vi fandt tætte methylering i alle 8 cellelinier undersøgt ved pyrosekventering (HCT116, 74%: RKO, 66%: LoVo, 77%: SW48, 50%: Caco2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%), og en høj grad af methylering i primære CRCs (45 ud af 54 undersøgte eller 83,3%, figur 3A). Methylering af denne CpG ø i kræft var ikke forbundet med fælles clinicopathologic funktioner, herunder alder, køn, placering og klinisk fase. En målelig grad af methylering var til stede i den tilstødende normalt udseende slimhinde fleste patienter analyseret, hvilket antyder, at dette locus kunne være et mål for aldersrelateret methylering [13]. Ja, i sund vises normale kolon mucosa prøver, fandt vi en stærk aldersrelateret methylering af denne CpG øen (

r

= 0,88,

s

= 0,0001).

(A) Eksempel på pyrogram resultater ved hjælp CpG øen (primer region for pyrosekventering blev vist i figur 1), med polymorf position C /T fremhævet. Sequence læser TC /TGTC /TGGAGGAGGATAAGAG, Pyrogram i venstre side shows.normal kolon og primær CRC (Højre side). (B) Resultat af relative ekspression i normale colon og colon cancer cellelinjer analyseret ved qPCR for transskript i fuld længde (probe A: Hs01005501_m1) og en blanding af fuld-længde og trunkerede transkripter (Probe B og C: Hs01005520_m1, Hs01005539_m1) . Relativ ekspression i probe A blev nedreguleret i 5 ud af 6 cell undersøgte linjer. Og de to andre sonder (Probe B og C) demonstrerer minimal nedregulering (eller endda opregulering) i disse cellelinjer.

Vi næste søgt at bedre at forstå DNA methylering af to homologe loci ved at udføre bisulfit direkte sekventering analyser, som kunne diskriminerer de to loci. På grund af den psiTPTE22 genet er 10 basepar mindre end MLL3 genet i denne region (figur 4A). Interessant, methylering af MLL3 genet varierede fra 0-5% i normale slimhinde og CRC-cellelinier undtagen RKO (14,7%). Men den, psiTPTE22 genet var meget methyleret i kolon prøver, både i CRC cellelinjer og primære tumorer. Endvidere blev methylering af psiTPTE22 loci forbundet med aldersrelateret methylering i normal colon mucosa (fig 4J).

(A-I) bisulfit direkte-sekventering blev udført ved anvendelse af primere, der dækker promotorregionen af ​​både MLL3 ( større form) og psiTPTE22 hjælp forskellig alder af normale kolon epitheliums (alder: 24, 31, 38 41, 48, 52, 68 og 82 år). (J) Dots plotte viser sammenhæng mellem DNA methylering i psiTPTE22 og hver prøve alder. Resultaterne viser, at psiTPTE22 methylering var korreleret med aldrende men ikke MLL3 (

r

= 0,830,

s

= 0,015).

For at undersøge ekspressionen profilen af ​​MLL3 anvendte vi qPCR (kvantitativ polymerasekædereaktion) og tre forskellige Taqman-prober til at dække den fulde længde transkript (NM 170.606) og den trunkerede transskript (NM 021.230) (figur 1). Som vist i figur 3B, det transskript i fuld længde (probe A) i det væsentlige nedreguleret i 5 ud af 6 cell undersøgte linjer, hvilket tyder på en genetisk ætiologi for denne dæmpning (figur 3B). Derimod er de to andre sonder (Probe B og C), som detekterer både trunkerede og fuld længde transkripter, demonstrere minimal nedregulering (eller endda opregulering) i disse cellelinjer. Tilsammen viser dataene, at somatiske mutationer især rammeskift mutationer i cancer tavshed fuldlængde transkript mens den trunkerede transskript intakt.

Vi analyserede næste to forskellige størrelse af protein af MLL3 i celler (både vildtype /rammeskift mutation). Protein analyse blev udført ved western blot for at bestemme, om disse celler kan producere det relevante MLL3 proteinet (figur 3C). MLL3 har en trunkeret form i 3′-enden. Således har vi analyseret MLL3 proteinniveauet anvendelse af antistoffer (dette antistof blev designet fra centrum grænse af MLL3 (Sigma-Aldrich, kat. # SAB1300328 (St. Louis, MO)). Det vil detektere kun lange isoform af MLL3 proteinprodukt.

Vi fandt det passende bånd i CaCo2 og SW480, vild type MLL3, og LoVo og SW48, heterozygote for læserammeskiftemutation ved MLL3 antistof. i modsætning hertil var der ingen påviselig band i RKO og HCT116, både homozygot for rammeskift mutation. Disse resultater korrelerede med genekspressionsniveauer og proteinanalyse af MLL3 (figur 3B, C).

Discussion

i denne undersøgelse fandt vi hyppige inaktivering af MLL3 af rammeskift mutationer, som ikke tidligere var blevet rapporteret.

Vi har vist, at de (A)

9 tarmkanalen i MLL3 er muteret i mismatch reparation mangelfuld tumorer. En tidligere undersøgelse [1] udelukket mismatch reparation mangelfuld tumorer og stadig fundet mutationer i 2,2% af tilfældene (6/37). i primære tumorer, men vi screenet for mutationer i de tidligere rapporterede berørte regioner og fandt kun polyA tract mutationer. Vi har således undervurderet den præcise mutation på det gen, da vi ikke sekventere alle 59 exons i alle tumorer. Ikke desto mindre er det klart, at MLL3 mutationer ligne andre vigtige tumor-suppressor gen i CRC – TGFBRII. For begge gener, de fleste mutationer set i CRC er polyA tract mutationer i mismatch reparation deficiente tilfælde [14], men nogle af de mutationer findes også uden for polyA tract, også i tilfælde uden fejlparringsreparationsmangel. Forbedringer i sekventering teknologier og omkostninger bør tillade den præcise beregning af MLL3 mutationer i primære CRC’er i den nærmeste fremtid.

Kombination af epigenetisk og genetisk lyddæmpning karakteriserer flere tumor-suppressor og cancer-disponerende gener såsom P16, MLH1, VHL og andre. MLL3 bedragerisk viste DNA hypermethylering i CRC celler, men også i primære tumorer ved kvantitativ bisulfit pyrosekventering analyse. Til denne analyse analyserede DNA methylering af CpG sites 224 bp fra TSS som angivet methylering i CRC cellelinjer, primære tumorer og normal colon. Vi fandt imidlertid, at omkring TSS på MLL3 der et stærkt homologe (~92.0%) til et pseudo-gen på kromosom 22, der er opkaldt psiTPTE22 (pseudo-genet af transmembrane phosphatase med tensin homologi på kromosom 22). TPTE (transmembrane fosfatase med tensin homologi) er placeret på human kromosom 21 og har mange homologe kopier /pseudogener på kromosom 13, 15, 21, 22 og Y [15].

Vi analyserede næste disse CpG websted ved hjælp bisulfat direkte sekventering efter TOPO-TA kloning i CRC-cellelinjer (figur S1A-i)) og primære normale colon prøver (figur 4A-J)). Bisulfit direkte sekventering assay var i stand til at skelne psiTPTE22 fra MLL3 efter sekventering, fordi promotorregionen af ​​psiTPTE genet er 10 bp mindre end MLL3 genet (figur 4A). Vi fandt, at MLL3 viste kun 0-5% methylering, bortset fra RKO som blev methyleret ved 13,0%. På den anden side blev psiTPTE22 methyleret mellem 65-90% i alle CRC cellelinier (figur 4B-I). Addtionally, psiTPTE22 havde methylering niveauer i normale colon væv svarende til, hvad vi tidligere har observeret for flere gener [16].

Pseudogener er hedengangne ​​slægtninge til kendte gener, der har mistet deres protein-kodende evne eller på anden måde ikke længere udtrykt i cellen [17]. Selv om nogle ikke har introns eller promotorer, de fleste har nogle gen-lignende egenskaber (såsom promotorer, CpG-øer, og splejsningssteder), er de alligevel betragtes ikke-funktionelt på grund af deres mangel på protein-kodende evne som følge af forskellige genetiske invaliditet ud ( stopkodoner, rammeforskydninger, eller mangel på transkription) eller deres manglende evne til at kode for RNA. Pseudogener er kendetegnet ved en kombination af homologi med en kendt gen og nonfunctionality. Det vil sige, selv om enhver pseudogen har en DNA-sekvens, der ligner nogle funktionelt gen, er de imidlertid ikke i stand til at producere funktionelle slutprodukter [18].

Interessant Liang et al beskrev, at psiTPTE22-HERV er tavshed af DNA-methylering i ikke kun GI cancere men også nyre-, lever- og lungekræft [19]. Og Herv-relaterede sekvenser i psiTPTE22-HERV meste splejses ud som introner fra transkripterne, og aminosyresekvensen af ​​15 kDa-proteinet er ikke en homolog til nogen retrovirale proteiner. Disse gør det HERV-relaterede psiTPTE22-HERV gen en almindelig somatiske gen-.

Sammenfattende rapporterer vi, at MLL3 inaktiveres i CRC ved genetisk ændring. Navnlig fandt vi, at mikrosatellit ustabil CRC celle liness har hyppige rammeskift mutationer i et (A)

9 tarmkanalen kodende region af MLL3 forårsager et tab af proteinfunktion, og en tidligere undersøgelse rapporteret af mutationer uden for denne tarmkanalen i mikrosatellit stabile cancere . Desuden MLL3 promotoren CpG øen er meget homologe til et CpG ø i promotorregionen af ​​en pseudogen psiTPTE22. psiTPTE22 var tæt methylering i både primære CRC’er og korreleret med aldring i normal epitel men ikke MLL3 (figur 4A-J). MLL3 tab af funktion kan være et centralt element i begyndelsen af ​​CRC tumorigenese.

Støtte Information

figur S1.

bisulfit direkte sekventering analyse af både MLL3 og psiTPTE22 methylering status i 6 CRC-cellelinjer. (A-I) Vi fandt 0-5% methylering af MLL3 i alle cellelinjer. Derimod blev pseudo-genet (psiTPTE22) methylerede mellem 65-90% i alle cellelinjer

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023320.s001

(EPS)

tabel S1. Salg Primere sekvenser anvendt til bisulfit pyrosekventering og direkte-sekvensanalyse.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023320.s002

(DOC)