PLoS ONE: Vitamin E δ-Tocotrienol inducerer p27KIP1-afhængig celle-cyklus Arrest i bugspytkirtelkræftceller via en E2F-1-Dependent Mechanism

Abstrakt

E-vitamin δ-tocotrienol har vist sig at have antitumoraktivitet , men den præcise molekylære mekanisme, hvormed det hæmmer proliferation af cancerceller stadig uklar. Her, demonstrerede vi, at δ-tocotrienol udøvet et betydeligt cellevækstinhiberingen pankreatiske duktale cancer (PDCA) celler uden at påvirke normal human pancreas ductal epitelcellevækst. Vi viste også, at δ-tocotrienol-induceret væksthæmning opstod samtidig med G

1 celle-cyklus anholdelse og øget p27

Kip1 nukleare akkumulation. Dette fund er væsentligt i betragtning af at tab af nukleare p27

Kip1 udtryk er en veletableret negativ prognostisk faktor i PDCA. Endvidere δ-tocotrienol inaktiveret RAF-MEK-ERK-signalering, en pathway kendt for at undertrykke p27

Kip1 ekspression. For at bestemme om p27

Kip1 induktion er nødvendig for δ-tocotrienol hæmning af PDCA celleproliferation, vi stabilt tavshed

CDKN1B

gen, der koder for p27

Kip1, i MiaPaCa-2 PDCA celler og viste, at p27

Kip1 lyddæmpning undertrykt celle-cyklus anholdelse induceret af δ-tocotrienol. Desuden δ-tocotrienol induceret p27

Kip1 mRNA-ekspression, men ikke dens protein nedbrydning. p27

Kip1 genpromotor aktivitet blev induceret ved δ-tocotrienol gennem initiativtagerkontrakten E2F-1 bindingsstedet, og denne aktivitet blev svækket ved E2F-1 depletering ved anvendelse E2F-1 lille interfererende RNA. Endelig nedsat proliferation, medieret af Ki67 og p27

Kip1 udtryk ved δ-tocotrienol, blev bekræftet

in vivo

i en nøgen mus xenotransplantat bugspytkirtelkræft model. Vores resultater afslører en ny mekanisme, afhængig af p27

Kip1 induktion, hvorved A-tocotrienol kan hæmme proliferation i PDCA celler, hvilket giver en ny rationale for p27

Kip1 som biomarkør for δ-tocotrienol effekt i forebyggelse bugspytkirtelkræft og terapi

Henvisning:. Hodul PJ, Dong Y, Husain K, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) E-vitamin δ-Tocotrienol inducerer p27

Kip1-afhængig celle-cyklus Arrest i bugspytkirtelkræftceller via en E2F-1-afhængig mekanisme. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10,1371 /journal.pone.0052526

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 23, 2012; Accepteret: November 15, 2012; Publiceret: 5 feb 2013

Copyright: © 2013 Hodul et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud K12 Klinisk Scholar i onkologi tilskud (til PJ Hodul) og ved Moffitt Foundation tilskud (Kurtz Pledge 09-33412-06-01, GI Cancer Research 09-33412-07- 01, og Steinmann Family Foundation 09-33412-08-05). Dette arbejde blev også støttet af NIH tilskud 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098.473-05, Davos 69-15099-99-01 (til MP Malafa), og Bankhead-Coley 08BR-02. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse omfatter intellektuel ejendom, hvor M. Malafa og S. Sebti er navngivet som opfindere. Drs. Malafa og Sebti og Moffitt Cancer Center har ret til at modtage licens indtægter fra udnyttelsen af ​​en sådan intellektuel ejendomsret. En USA patentansøgning blev indgivet den 26. juni 2007 at have titlen “Delta-Tocotrienol Behandling og forebyggelse af kræft i bugspytkirtlen” (OTML docket nummer 06A069). Den intellektuelle ejendomsret indgår i patentansøgningen er blevet licenseret til biogene Life Science, en Singapore-baserede selskab. Denne licensaftale giver biogene Life Science rettigheder til Dr. Malafa opdagelse. Biogene Life Science er et helejet datterselskab af Davos Life Science. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige kræftformer i USA, ranking fjerde blandt de førende årsager til kræft dødsfald [1]. Trods udviklingen behandling, har dødeligheden for patienter med kræft i bugspytkirtlen overordnet været uændret i årtier. Undersøgelser af nye terapier og kemoforebyggende midler er klart berettiget.

Undersøgelser har antydet, at øget indtag af kosten frugter, grøntsager og korn kan nedsætte pancreascancer risiko [2], [3], [4]. Tocotrienoler, der findes i kornkerner, omfatte en af ​​de mest overbevisende grupper af anti-tumor bioaktive stoffer [5]. Tocotrienoler er en gruppe på fire (α-, β-, δ-, γ-) umættede, naturligt forekommende vitamin E-forbindelser, der ikke kun inhiberer proliferation af en række humane tumorceller, herunder bryst-, tyktarms-, lunge- og hepatocellulær [ ,,,0],6], [7], [8], men også udviser kemoforebyggende egenskaber [9], [10]. Men hvordan tocotrienoler dæmpe tumor spredning er dårligt forstået.

Vi har tidligere vist, at δ-tocotrienol udviser den mest potente anti-tumor aktivitet blandt de fire tocotrienol isoformer i bugspytkirtelkræftceller [11], [12]. I et igangværende fase dosis-eskalering I klinisk forsøg med bugspytkirtlen kræftpatienter, foreløbige resultater viste, at δ-tocotrienol havde ingen tydelig toksicitet ved op til 3200 mg /dag, hvilket er 5 gange den forudsagte biologisk aktive kliniske dosis [13]. Disse resultater understreger løftet om δ-tocotrienol for kræft i bugspytkirtlen intervention. For yderligere at omsætte disse fund i klinikken, er det vigtigt at identificere relevante biomarkører for δ-tocotrienol aktivitet for tidlig-fase hypoteser-drevet kliniske forsøg.

Til dette formål har vi undersøgt, hvordan δ-tocotrienol hæmmer kræft i bugspytkirtlen cellevækst og identificeret cyklin-afhængige kinase (CDK) inhibitor p27

Kip1 som en molekylær mål for δ-tocotrienol. p27

Kip1 fungerer som en tumorsuppressor ved dets evne til at blokere celleproliferation. p27

Kip1 er et atypisk tumorsuppressor fordi mutationer af dens gen er ekstremt sjældne. Ikke desto mindre har tumorceller udviklet andre mekanismer til at inaktivere p27

Kip1, herunder øget proteolytisk nedbrydning og udelukkelse fra kernen. Faktisk har p27

Kip1 tab været forbundet med kræft i bugspytkirtlen progression og dårlig prognose [14], [15], [16], [17]. Her rapporterer vi for første gang, at p27

Kip1 spiller en central rolle i δ-tocotrienol-induceret G

1 anholdelse. Vi bemærkede også, at induktion af p27

Kip1 af δ-tocotrienol forekommer ved transskription niveau involverer E2F-1-medieret promoter aktivering og mRNA induktion.

Materialer og Metoder

Kemikalier

Renset δ-tocotrienol blev oprindeligt leveret af Dr. Barry Tan (Hadley, MA) (90% δ-tocotrienol og 10% γ-tocotrienol, IC

50: 15-20 μΜ) derefter ved Davos Life Sciences (Singapore) (97% δ-tocotrienol, IC

50: 50 μΜ) opløst i ethanol som en stamopløsning og fortyndet til den ønskede koncentration med DMEM

cellelinjer og kultur

MiaPaCa-2, blev SW1990, og BxPC-3 bugspytkirtelkræftceller opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket til -70% konfluens i DMEM suppleret med 10% FBS. HPDE6 C7, et menneske pancreas kanalen epitelial cellelinje udødeliggjort af transduktion med E6 /E7 gener af HPV-16 (generøst tilvejebragt af Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Ontario, Canada [18]), blev dyrket i serum- fri keratinocyt medium som beskrevet tidligere [18]. Mus embryonale fibroblaster (MEF’er) med stabil ekspression af p27

Kip1 (+ /+) og p27

Kip1 (- /-) blev leveret af Dr. Pledger (Moffitt Cancer Center) [19], [20] og dyrket i DMEM med 10% FBS.

Transfektion og Generation af stabile kloner

MiaPaCa-2 /shRNA p27

Kip1 og MiaPaCa-2 /vektor blev genereret ved transfektion MiaPaCa-2 celler med p27

Kip1 shRNA allerede klonet ind pSuperiorRetroPuro vektor (OligoEngine, Seattle, WA), en slags gave fra Dr. J. Chen (Moffitt Cancer center) [21]. Stabile puromycin-resistente kloner blev udvalgt. Transfektioner blev udført med Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Tyskland), pr producentens protokol.

siRNA Knockdown af p27

Kip1 i MiaPaCa-2 Cells

Pre-designede, siRNA til CDK inhibitor 1B (p27

Kip1, # 118.714) og uspecifik siRNA (# 4611) blev indkøbt fra Ambion (Austin, TX). MiaPaCa-2-celler blev udpladet natten over i 12-brønds plader uden antibiotika. Transient transfektion af siRNA blev udført under anvendelse Oligofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 5 nM p27

Kip1 siRNA eller kontrol siRNA blev blandet med Opti-MEM-medium (Invitrogen) til et samlet volumen på 90 pi og derefter kompleksbundet med 2 pi Oligofectamine og 8 pi Opti-MEM (totalvolumen på komplekset var 100 pi). Før transfektion blev gamle medium kasseret, cellerne blev vasket med frisk Opti-MEM, og 400 pi af frisk Opti-MEM blev anbragt i hver brønd før tilsætning af RNA-Oligofectamine kompleks. Efter 8 timer blev 500 pi DMEM indeholdende 30% FBS og ingen antibiotika tilsat til hver brønd, og cellerne blev yderligere inkuberet i 40 timer. Efter 40 timers transfektion blev cellerne behandlet med δ-tocotrienol i yderligere 24 timer og høstet til trypanblåt og Western blot analyse.

Protein Extraction og Western blot-analyse

Dyrkede celler blev lyseret i pattedyrprotein ekstraktion reagens (Pierce, Rockford, IL), pr producentens protokol. Antistof til p27

Kip1 blev købt fra BD Bioscience (San Jose, CA). Membraner blev blokeret i enten 5% mælk i PBS (pH 7,4) indeholdende 0,1% Tween 20 eller 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBS (pH 7,5) indeholdende 0,1% Tween 20. phospho-specifikke antistoffer blev inkuberet i 2% BSA i TBS (pH 7,5) indeholdende 0,1% Tween 20; alle andre antistoffer blev fortyndet i 5% mælk i PBS (pH 7,4) indeholdende 0,1% Tween 20 natten over ved 4 ° C. Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) blev fortyndet i 5% mælk i enten PBS (pH 7,4) indeholdende 0,1% Tween 20 eller TBS (pH 7,5) indeholdende 0,1% Tween 20 ved en 1:1000 fortynding i 1 time ved stuetemperatur. Western blots blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens (Pierce). Vi brugte beta-actin monoklonalt muse-antistof (katalog # 8H10D10) fra Cell Signaling at sikre lige protein lastning og udtryk.

forankringsuafhængig vækst Analyser

For blød agar vækst assays celler blev podet ved 1 × 10

3 celler /brønd in triplo i 12-brønds dyrkningsskåle i 0,35% agar over et 0,6% agarlag. Forskellige koncentrationer af δ-tocotrienol eller vehikel blev inkluderet i 0,3% agar lag af celler. Kulturer blev fodret og behandlet med forbindelse eller vehikel ugentligt indtil kolonier voksede til en passende størrelse til observation (~3-4 uger). Kolonier blev fotograferet efter inkubation med 1 mg /ml MTT natten over og talt. Vækst af δ-tocotrienol-behandlede kolonier blev sammenlignet med vehikelbehandlede kolonier (kontrol). Der blev udført tre separate forsøg.

FACS og celleproliferationsassay

Eksponentielt voksende pancreasceller blev dyrket til 70% konfluens i 96-brønds plader og inkuberet med stigende koncentrationer af δ-tocotrienol eller køretøj for 24-72 timer. Brønde blev undersøgt for cellevækst og proliferation under anvendelse af MTT kolorimetrisk assay. IC

50 resultater for hver cellelinje blev bestemt for hver 24 timers tidspunkt. For celle-cyklus analysen blev pancreasceller dyrket til 70% konfluens i 100 mm plader og derefter serum sultet i 48 timer for at tillade synkronisering. Efter 48 timer blev mediet aspireret, og frisk medium med δ-tocotrienol (IC

50) eller vehikel blev tilsat i 24 timer. Behandlet medium blev derefter opsamlet, monolag blev vasket med kold PBS, cellerne blev trypsiniseret, og cellepellets opsamledes. Cellepellets blev vasket to gange med PBS, fikseret i kold methanol og vaskes igen med PBS til fjernelse af methanol. Efter resuspension i 300-500 pi PBS blev celler fordøjet med 20 ug /ml RNase og cellulært DNA blev farvet med propidiumiodid (50 ug /ml) med 3 timers inkubation ved stuetemperatur i mørke. Celle-cyklus fordelingen blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -system (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

konfokal mikroskopi Analyse

Behandlede MiaPaCa-2-celler (50.000) pr 250 pi 20% FBS-PBS blev tilsat til hver cytofunnel slot og centrifugeret ved 570 rpm i 5 minutter ved høj acceleration. Objektglas blev fjernet og lufttørret ved stuetemperatur. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket tre gange med 1X PBS under omrøring i 5 minutter /vask, og derefter permeabiliseret i 0,5% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur. Celler blev blokeret med 2% PBS-BSA (100 pL) i 30 minutter, og p27

Kip1 antistof (1 :500) fortynding fremstillet i 2% BSA blev anvendt direkte. Slides blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer. Celler blev derefter vasket tre gange med 1X PBS under omrøring i 5 minutter /vask. Sekundært antistof (Alexa Fluor 594) i PBS (1:500) blev fremstillet og sat til fikserede celler. Objektglas blev igen inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i lukket fugtigt kammer og derefter vasket tre gange med 1X PBS i 5 minutter /vask. Vectashield (50 pi) med DAPI blev tilsat, og dækglas blev anvendt. Efter inkubation ved 4 ° C i mørke forhold, blev slides undersøgt under et konfokal mikroskop.

Cytosolisk og nuklear Protein Extraction

Proteiner blev udvundet ved hjælp af NE-PER nukleare og Cytoplasmatisk Extraction Reagent Kit (Pierce ). Behandlede MiaPaCa-2-celler blev isoleret som 20-pi pakkede cellevolumen (40 mg) i en 1,5-ml mikrocentrifugerør ved 5 minutters centrifugering ved 500 x g. Supernatanten blev kasseret, cellepellets blev tørret, og iskold CER-1 indeholdende proteaseinhibitorer (200 pi) blev tilsat. Rør blev hvirvlet kraftigt i 15 sekunder og inkuberet på is i 10 minutter. Dernæst blev iskold CERII (11 pi) tilsat til rør, som blev hvirvlet i 5 sekunder og inkuberet på is i 1 minut, hvirvelbehandlet igen i 5 sekunder, og derefter centrifugeret ved 14.000 x g i 5 minutter. Supernatant (cytosolisk ekstrakt) blev overført til friske pre-kølede rør og opbevaret ved -80 ° C. Vi resuspenderet den uopløselige pellet indeholdende kerner i 100 pi iskold NER indeholdende proteaseinhibitorer. Rør blev hvirvlet i 15 sekunder og holdt på is i 10 minutter. Dette trin blev gentaget fire gange (40 minutter). Rør blev centrifugeret ved 14.000 x g i 10 minutter, og supernatanten (kerneekstrakt) blev overført til præ-kølet rør og opbevaret ved -80 ° C.

Luciferase Reporter Assay

MiaPaCa-2 celler blev podet i 6-brønds plader med 2 × 10

5 celler /brønd. Hver brønd blev transficeret den følgende dag med 2 ug p27

Kip1 luciferasereporterplasmid (fuld længde p27

Kip1-1609, forskellige 5’deletionsmutanter af muse p27

Kip1 promotor luciferase reporter, eller pGL- 3 base-cDNA tom vektor, alle plasmider, som Dr. Pledger) sammen med siRNA E2F-1 eller ikke-target siRNA (Santa Cruz). Metafectene blev anvendt som transfektionsreagens, ifølge producentens anvisninger. Lysater blev opsamlet 24 timer efter δ-tocotrienol behandling (IC

50 50 uM). Luciferaseaktivitet blev målt ved luciferase-assay-systemet (Promega). Til normalisering af transfektionseffektiviteten, 200 ng Renilla reniformis luciferase-ekspressionsplasmid (pRL-TK vektor, Promega) blev inkluderet i transfektionen.

RT-PCR-analyse

MiaPaCa-2-celler blev podet i 6-brønds plader og behandlet med δ-tocotrienol (IC

50 50 uM) eller vehikel (som kontrol) i 24 timer. Celler blev derefter høstet i 1X lysis buffer, og RNA blev isoleret under anvendelse Allprep RNA /protein kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Valencia, CA). Revers transkription af totalt RNA blev udført ved anvendelse af SuperScript III kit (Invitrogen). Følgende fremad og reverse primere, henholdsvis blev anvendt til PCR reaktion: for p27

Kip1, 5′-TAACCCGGGACTTGGAGAAG og 5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC at amplificere et 450 bp produkt; for actin, til 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCT og 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC amplificere et 353 bp produkt. For at undgå overforstærkning, p27

Kip1 mRNA-ekspression blev bestemt ved RT-PCR ved forskellige amplifikationscykler (20, 25, 30, og 40 PCR-cykler) og analyseret ved agarosegelelektroforese. Repræsentative resultater på cyklus 40 er vist.

cyclohexamid Blocks Protein Synthesis

Efter 12 timers δ-tocotrienol behandling (IC

50 50 uM), δ-tocotrienol blev fjernet ved skylning MiaPaCa -2 celler tre gange med PBS; cyclohexamid (40 ug /ml) blev derefter anvendt til at blokere proteinsyntese. p27

Kip1 omsætningshastighed blev undersøgt ved Western blot.

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i national Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af University of South Florida Institutional Animal Care og brug Udvalg (Application 2805).

Anti-tumor aktivitet i Nude Mouse xenograftmodel

Vi brugte kvindelige atymiske nøgne (nu /NU) mus, 5-6 uger gamle (Charles River, Wilmington, MA), for vores dyreforsøg. Dyrene blev holdt i rene bure begrænset til 4 mus pr bur. Musene blev plejet med rigelig mad og vand og undersøges på en daglig basis. Hvis tumorer forstyrret ambulation, forårsaget tegn på vægttab 10%, forårsagede åndedrætsbesvær, eller voksede til . 2 cm i størrelse, blev musene humant aflivet ved eksponering for stigende koncentrationer af carbondioxid

MiaPaCa-2-celler blev høstet og resuspenderet i PBS (1 x 10

6 celler /50 pi) og et tilsvarende volumen af ​​Matrigel (BD Biosciences). Celleprøver (100 pi) blev derefter injiceret subkutant i den højre flanke. Når tumorerne nåede mellem 250 og 300 mm

3, blev musene tilfældigt i grupper på 10 og doseres ved oral sondeernæring med 0,1 ml vehikel (renset olivenolie) eller δ-tocotrienol (100 mg /kg) dagligt i 3 uger. Tumorvolumener blev bestemt to gange om ugen ved at måle længden (

l

) og bredde (

w

) og ved at beregne volumen: V = (

l

+

w

) /2 × (

l

×

w

) × 0,5236. Statistisk signifikans mellem kontrol og behandlede dyr blev bestemt ved anvendelse af Students

t

-test.

Immunhistokemi og Slide Kvantificering

Tumorer fra xenograft eksperimenter blev fikseret i 4% paraformaldehyd, pH 7,2 . Efter fiksering blev vævsprøverne forarbejdet til paraffinblokke. De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse var monoklonalt muse (p27, p-MAPK, og Ki-67) antistoffer dannet mod de tilsvarende antigener af human oprindelse i paraffinindlejrede sektioner. Immunhistokemisk farvning blev udført på et Ventana BenchMark XT (Tucson, AZ) automatiseret slide farvningsværktøjet, under anvendelse af 4-um tyk paraffinsnit fra hver af de repræsentative tumorblokke valgt. Snittene blev deparaffineret, rehydreret, og inkuberet med 3% H

2O

2 for at blokere endogen peroxidase. Efter antigen demaskering hjælp proprietære CC1 opløsning i 60 minutter online (standard) ved 100 ° C blev sektionerne inkuberet med antistoffer mod p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (proprietære fortynding, Cell Marque, Rocklin, CA) og Ki-67 (proprietære fortynding, Ventana, Tucson, AZ). Inkubationstiderne var 32 minutter for p27 og Ki-67, ifølge producentens instruktioner. Phospho-p44 /42 MAPK kanin-monoklonalt antistof (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (katalog nr 4376, Cell Signaling, Danvers, MA.) Blev anvendt ved en 1: 200-koncentration i PSS fortyndingsmidler (Ventana) og inkuberet i 32 minutter. Ventana anti-kanin sekundært antistof blev anvendt i 20 minutter. Snittene blev derefter udsat for biotin blok under anvendelse af en Ventana endogen biotin-kit (Ventana). Snittene blev inkuberet med biotin-mærket sekundært antistof og streptavidin-peroxidase i 30 minutter hver (Dako Diagnostics). En opløsning af 3,3′-diaminobenziden tetrahydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som et chromogen efterfulgt af natriumazid og 20 pi H

20

2 i 100 ml Tris-HCI (50 uM, pH 7,6). Efter let kontrastfarve med Harris ‘hæmatoxylin blev snittene undersøgt under lysmikroskopi.

Evaluering af Pletter

immunhistokemisk udtryk for p27, p-MAPK og Ki-67 proteiner blev bestemt som produktet af immunofarvningsprocedure intensitet og procent af cellerne farvet. Disse blev scoret på en 0-3 skala, med 3 er maksimal. Den immunofarvningsprocedure intensitet blev scoret med nogen farvning er 0, let farvning som 1, moderat farvning som 2, og tunge farvning som 3. Procentdelen af ​​celler farves blev målt uden nogen påviselig farvning som 0, 1-33% som 1, 34- 66% som 2, og 67-100% i 3. den endelige IHC score var et produkt af den procent af celler farvet score multipliceret med intensiteten score, der giver mulighed for en maksimal score på 9 og en minimal score på 0.

Statistisk analyse

data udtrykt som gennemsnit ± SEM, blev analyseret statistisk ved hjælp af uparrede t-test eller envejs variansanalyse (ANOVA) i givet fald. Vi brugte GraphPad Prism-version 5,04 for vores analyser. Statistisk signifikans blev sat til

P

. 0,05

Resultater

δ-tocotrienol Forhindrer forankringsafhængige og-Independent cellevækst og inducerer G

1 Arrest i bugspytkirtelkræftceller

virkningerne af δ-tocotrienol (1A) på cellevækst i MiaPaCa-2, BxPC-3, og SW1990 humane bugspytkirtelkræftceller blev undersøgt af 3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) celleproliferationsassay. Celler blev behandlet med 0,50 uM δ-tocotrienol i 24, 48 og 72 timer. Virkningerne af δ-tocotrienol blev også evalueret i de ikke-transformerede humane pancreas ductal epitelcellelinie HPDE6 C7 at udelukke eventuelle cytotoksiske virkninger af δ-tocotrienol på ikke neoplastiske celler. δ-Tocotrienol behandling inhiberede forankringsafhængige celleproliferation i både en tids- og koncentrationsafhængig måde i humane bugspytkirtelkræftceller (figur 1B); dog var ingen signifikante væksthæmmende virkninger noteret i HPDE6 C7 celler. δ-Tocotrienol behandling også signifikant hæmmede kolonidannelse i MiaPaCa-2 celler dyrket i blød agar fra 2,5 pM (

P

= 0,02) (Figur 1C).

A, kemiske strukturer af tocotrienoler. B, δ-tocotrienol hæmmer selektivt pancreascancer celleproliferation. HPDE6 C7 og menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer MiaPaCa2, BXPC3, og SW1990 blev behandlet med stigende koncentrationer af δ-tocotrienol eller køretøj, og analyseret af MTT ved 24, 48 og 72 timer. Resultater viser selektiv hæmning af bugspytkirtelkræftceller på en tids- og dosisafhængig måde. C, δ-tocotrienol inhiberer forankringsuafhængig vækst af transformerede MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller. Antallet af kolonier var normaliseret og sammenlignet med vehikel. * Koncentration, hvor statistisk signifikans begynder. D, effekter af δ-tocotrienol på cellecyklusprogression. Bugspytkirtelkræftceller og HPDE6 C7-celler blev inkuberet i nærvær af δ-tocotrienol (IC

50) (grå) eller vehikel (sort) som kontrol i 24 timer. Celler blev opsamlet til bestemmelse af cellecyklusfordeling ved FACS-analyse efter cellefarvning med propidiumiodid. Hver analyse repræsenterer middelværdier ± SD af 3 uafhængige forsøg. δ-Tocotrienol hæmmer G

1-til-S cellecyklus progression selektivt i transformerede bugspytkirtelkræft cellelinjer.

δ-Tocotrienol behandling havde også en signifikant selektiv effekt på celle-cyklus progression, som demonstreret ved en stigning i andelen af ​​bugspytkirtelkræftceller men ikke HPDE6 C7 celler i G

1 fase (

P

0,001 vs.

P

= 0,92) (Figur 1D ). Vi fandt, at bugspytkirtelkræftceller akkumuleret i G

1 fase på bekostning af et fald i S-fasen befolkning.

δ-Tocotrienol inducerer p27

Kip1 Expression og hæmmer RAS-MEK -ERK Signaling

Regulering af intracellulære signalveje er central for evnen af ​​onkogener til at fremme celle-cyklus progression. To større veje intimt involveret i G

1-til-S travers er RAS-aktiverede RAF-MEK-ERK og PI3-AKT pathways. Disse veje påvirke ekspressionen eller aktivitet eller subcellulær lokalisering af nøglekomponenter i cellecyklen maskiner såsom cycliner, CDK’er og CDK-inhibitorer, hvilket fører til den passende aktivering af E2F-1 transkriptionsfaktorer. Flere midler er blevet beskrevet som regulerer G

1 travers og overgang til S-fasen i bugspytkirtelkræftceller, og p27

Kip1 er blevet rapporteret til at blive forøget med disse stoffer [22], [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Vi bestemt derfor kinetik p27

Kip1 niveauer og RAF-MEK-ERK pathway aktivitet i bugspytkirtelkræftceller og i HPDE6 C7 celler udsat for δ-tocotrienol. Vi fandt, at δ-tocotrienol signifikant øget P27

Kip1 niveauer ved 6 timer i pancreasceller cancerpatienter (figur 2A). Denne øgede niveau blev opretholdt og steg i alle cellelinjer af 48 timer og er forbundet med tilsvarende inhibering af aktiviteten af ​​den aktiverede RAF-MEK-ERK signalvej, målt ved nedsat phosphorylerede MEK og ERK-niveauer i de bugspytkirtelkræftceller (figur 2A ). I modsætning hertil blev PI3-AKT pathway oprindeligt induceret ved 12 timer efterfulgt af efterfølgende inhibering ved 24 timer, som målt ved phosphorylerede AKT niveauer (figur 2a og 2b). Overensstemmelse med den virkning på proliferation, δ-tocotrienol undertrykt p27

Kip1 niveauer i ikke-transformeret human pancreas ductal cellelinje, HPDE6 C7, og havde ingen virkning på MEK, ERK, eller AKT. Vi viste også, at virkningerne af δ-tocotrienol var specifikke for maligne celler, som δ-tocotrienol ikke inducerede P27

Kip1 niveauer eller ændre MEK, ERK, eller AKT ekspression i de ikke-transformerede pancreatiske duktale epitelceller. Mekanismerne i dette behov for yderligere undersøgelse.

A, pancreascancer og HPDE6 C7-celler blev behandlet med δ-tocotrienol ved forudbestemt IC

50 for hver cellelinie. Protein lysater fra 0-48 timer blev indsamlet og analyseret ved Western blot-analyse for Ras mål onkogen signalering, MEK og ERK, og p27

Kip1. Resultater er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. δ-Tocotrienol selektivt hæmmer MAP-kinase signalering og øger p27

Kip1 udtryk i transformerede bugspytkirtelkræftceller. B, blev MiaPaCa-2-celler behandlet med δ-tocotrienol ved forudbestemt IC

50. Proteinlysater fra 0-24 timer blev opsamlet og analyseret ved Western blot for AKT og en nedstrøms target GSK-3β. C, MiaPaCa-2-celler blev behandlet med vehikel eller δ-tocotrienol i FBS i 12 timer, og rene kerner og cytosol fraktioner blev isoleret. Western blots viser øget niveauer af p27

Kip1 i δ-tocotrienol behandlede celler med høje koncentrationer i kernen. D, samtidigt, hele celler blev farvet med immunfluorescent p27

Kip1 antistof og analyseres ved fluorescerende mikroskopi for p27

Kip1 lokalisering. δ-Tocotrienol lokaliseret p27

Kip1 til kernen ligner den udsultet tilstand, mens serum-behandlede celler viste lige niveauer af p27

Kip1 i kernen og cytoplasmaet. E, δ-tocotrienol (DT3) undertrykker tumorcellevækst af MiaPaCa-2-celler i nærvær af tilsat mevalonat, en metabolit af HMG-CoA reduktase. MiaPaCa-2-celler (i 96-brønds plader) blev behandlet i 24 timer med δ-tocotrienol eller lovastatin i fravær eller nærvær af stigende koncentrationer af mevalonat. MTT resultater viser, at mevalonat redder de væksthæmmende effekter af lovastatin, men ikke fra δ-tocotrienol. I E, linje 1 og 7 havde ingen δ-tocotrienol (DT3) eller lovastatin.

Udover modulation af sine ekspressionsniveauerne, subcellulære lokalisering er også vigtigt styrende p27

Kip1 funktion. At fungere som en celle-cyklus-hæmmer, skal p27

Kip1 være placeret i kernen, mens dens cytoplasmatiske mislocalization favoriserer celle-cyklus progression og kan bidrage til cellulær transformation [27], [28]. Figur 2C viser, at p27

Kip1 niveauer øges i både den cytosoliske og nukleare rum i δ-tocotrienol-behandlede MiaPaCa-2-celler sammenlignet med køretøj. I figur 2D, observerede vi p27

Kip1 cytoplasmatisk akkumulering i bærerbehandlede MiaPaCa-2 celler versus øget p27

Kip1 niveauer i den nukleare rum i serum-udsultede hvilende MiaPaCa-2 celler og δ-tocotrienol behandlet MIAPaCa- 2-celler. Nogle forfattere har foreslået, at tocotrienoler modulere HMG-CoA-reduktase-aktivitet via post-transkriptionelle aktioner, og derved hæmmer farnesylering af downstream onkogene signalveje mål, der ligner virkningerne af lovastatin [29], [30], [31]. For at bestemme om δ-tocotrienol inhiberer proliferation gennem mevalonat-vejen inhibering behandlede vi MiaPaCa-2-celler med δ-tocotrienol eller lovastatin og med stigende koncentrationer af mevalonat, et efterfølgende produkt af HMG-CoA reduktase. Tilsætning af mevalonat til A-tocotrienol-behandlede celler resulterede ikke i nogen signifikant redning fra væksthæmmende effekter af δ-tocotrienol på MiaPaCa-2-celler (Figur 2E); dog var lovastatin evne til at hæmme proliferation reddet af mevalonat.

p27

Kip1 kræves til δ-Tocotrienol-induceret G

1 Arrest

For at fastlægge den rolle, P27

Kip1 induktion i δ-tocotrienol bugspytkirtelkræft cellevækstinhibering, vi forbigående reduceret p27

Kip1 ekspression i MiaPaCa-2-celler under anvendelse af p27

Kip1 lille interfererende RNA (siRNA, bekræftet ved Western blot). Efter 24 timer, fravær af p27

Kip1 ekspression betydeligt ophævet δ-tocotrienol-induceret cellevækstinhiberingen (figur 3A). For at bekræfte disse resultater, stabile cellelinjer, der udtrykker p27

Kip1 kort hårnål RNA (shRNA) eller vektor blev oprettet ved hjælp af MiaPaCa-2 celler. Reduceret p27

Kip1 ekspression blev bekræftet ved Western blot analyse. Figur 3B viser, at udtømning af p27

Kip1 medførte resistens over for δ-tocotrienol behandling. For at undersøge, om disse observationer kan generaliseres ud over MiaPaCa-2 celler, vi analyserede stabile MEF’er [19], [20] udstille p27

Kip1 knock-out eller vildtypeceller efter δ-tocotrienol behandling. Vi fandt, at den manglende p27

Kip1 afsmeltet MEF’er delvist resistente over for de antiproliferative virkninger af δ-tocotrienol i denne cellelinie (figur 3C). Tilsammen udgør disse undersøgelser understreger betydningen af ​​P27

Kip1 i δ-tocotrienol-induceret G

1 anholdelse og viser, at bidraget fra denne CDK-inhibitor er ikke cellelinje specifik.

A, p27

Kip1 siRNA dæmper δ-tocotrienol-medieret vækst undertrykkelse i humane MiaPaCa-2 i bugspytkirtlen kræftceller.