PLoS ONE: En model af kræft stamceller fra mus induceret pluripotente Stem Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) er i stand til kontinuerlig spredning og selv-fornyelse og foreslås at spille væsentlige roller i onkogenese , tumorvækst, metastase og cancer tilbagefald. CSCS anses afledt af normale stamceller ramt af tumormikromiljøet selvom mekanismen for udvikling er endnu ikke klart. I 2007 Yamanaka gruppe lykkedes at generere

Nanog

mus induceret pluripotente stamceller (MIPS) celler, hvor grønt fluorescerende protein (GFP) er blevet indsat i 5′-utranslaterede område af

Nanog

gen. Normalt iPS-celler, ligesom embryonale stamceller, er at betragte som induceres i progenitorceller, som differentierer til forskellige normale fænotyper afhængigt af normale niche. Vi antager, at CSCS kunne udledes fra

NANOG

MIPS celler i konditioneret dyrkningsmedium af cancer cellelinjer, som er en efterligning af carcinoma mikromiljø. Som følge heraf er de Nanog MIPS celler behandlet med det konditionerede medium af muse Lewis lungecarcinoma erhvervede karakteristika CSCS, idet de dannede sfæroider udtrykker GFP i suspensionskultur, og havde en høj tumorgenicitet i nøgne Balb /c-mus, der udviser angiogenese in vivo. Desuden er disse iPS-afledte CSCS havde en kapacitet på selv-fornyelse og udtrykte markørgener,

Nanog

,

Rex1

,

Eras

,

Esg1

og

Cripto

, der er forbundet med stamcelle egenskaber og en udifferentieret tilstand. konkluderede vi, at en model af CSCS oprindeligt blev udviklet fra MIPS celler og foreslog konditionerede dyrkningsmedium for kræft cellelinjer kan udføre som niche til fremstilling CSCS. Modellen af ​​CSCS og proceduren for deres etablering vil hjælpe studere de genetiske ændringer og de udskilte faktorer i tumor mikromiljø, der konverterer MIPS celler til CSCS. Desuden kan identifikationen af ​​potentielt bona fide markører for CSCS, hvilket vil bidrage til udviklingen af ​​nye anti-cancer behandlinger, være muligt selvom CSC model

Henvisning:. Chen L, Kasai T, Li Y, Sugii Y, Jin G, Okada M, et al. (2012) En model af kræft stamceller fra mus induceret pluripotente stamceller. PLoS ONE 7 (4): e33544. doi: 10,1371 /journal.pone.0033544

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: September 30, 2011; Accepteret: 10. februar, 2012; Udgivet: 12 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (nr 21.300.179, https://www.waseda.jp/rps/en/manual/kakenhi_honbun.html), og af National Natural Science Foundation of China (Key Program, Grant No. 30.930.038, https://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En række undersøgelser har forsøgt at identificere de mekanismer, der ligger malign tumor vækst og progression. På trods af betydelige fremskridt, de fleste terapeutiske fremgangsmåder mislykkes at fjerne alle tumorceller. De resterende tumorceller resulterer ofte i fornyet og metastase. For nylig blev hypotesen cancerstamceller (CSCS) foreslået at forklare oprindelsen af ​​cancerceller. Per definition CSCS er en lille brøkdel af tumorceller med kapacitet på både selvfornyelse og ubegrænset langsom spredning. De er ofte resistente over for kemoterapi og stråling og er således ansvarlig for kontinuerlig tilførsel af nye cancerceller [1]. En aktuel udsigt over CSCS modellen anses at voksne stamceller, stamceller, eller differentierede celler kan erhverve de mange genetiske og epigenetiske ændringer, der er nødvendige for at blive CSCS, der er involveret i at fremme og opretholde onkogenese. Denne kræft-initierende celle kan dele nogle karakteristika med voksne stamceller, der er bosiddende i organet, hvor de opstår, enten fordi organer og væv stammer fra hjemmehørende stamceller eller fordi stamceller er grupperet af egenskaberne for deres niche [2]. I denne sammenhæng kan tumorceller epigenetisk tilbageført til vævsspecifikke stamceller når transplanteret ind i en normal stamcelle niche [3] – [6]

Det er velkendt, at mikromiljøet kan udøve dybtgående genetisk eller epigenetisk. virkninger på stamceller gennem interaktioner mellem celler, eller gennem celleafledte faktorer, der stammer fra de omgivende celler i niche. Disse virkninger kan være forbigående, som det ses i aktiveringen af ​​signalveje regulerer cellulær proliferation og migrering, eller de kan være forbundet med mere stabile ændringer, såsom celleskæbne bestemmelse og differentiering [7]. I betragtning af den afgørende rolle mikromiljø i cellulær regulering, har flere undersøgelser for nylig vist, at embryonale stamceller mikromiljø kan have væsentlig indflydelse på de fænotypiske karakteristika af aggressive kræftceller [8] – [10]. Men hvorvidt det tumorigen mikromiljø kan påvirke skæbne af stamceller er ikke blevet tilstrækkeligt undersøgt.

I 2007 Yamanaka gruppe [11] lykkedes at generere

NANOG

MIPS celler ved retroviral transduktion af fire transkriptionsfaktorer (

octamer 3/4

(

oktober 3/4

),

SRY box-holdige gen 2 Hotel (

Sox2

),

Kruppel-lignende faktor 4

(

Klf4

) og

C-myc

) i muse embryonale fibroblaster (MEF). GFP blev stabilt udtrykt i disse celler, men GFP-ekspression blev slukket, når disse celler blev induceret til at differentiere. Til dato har MIPS-celler blevet differentieret i forskellige celletyper, herunder hæmatopoietiske og endotelceller [12], neurale celler [13], hjerteceller [14] og pankreatiske p-celler [15]. Trods disse succesfulde rapporter om in vitro differentiering, iPS celler ikke fuldstændigt egnet til transplantation til patienter. Det vigtigste spørgsmål er sikkerhedsproblemer i at IPS celler tendens til at danne teratomer og har risiko for malign transformation [16] – [18]. Baseret på CSCS teori, vi undersøgt, om CSCS kan afledes fra MIPS-celler efter eksponering for en tumor mikromiljø (fig. 1).

MIPS celler bør induceres til nogle former for progenitorceller, såsom hæmatopoietiske celler og neurale stamceller, differentiere til forskellige fænotyper, såsom makrofag, monocytter, neurale celler, hjerteceller og pankreatiske p- celler, når de udsættes for normale niche. Vi antager, at CSCS også kan stamme fra MIPS celler, når udsættelse for en ondartet niche.

Resultater

MIPS celler dyrket i de konditionerede medier af cancer cellelinjer viste tumorigenicitet og angiogenese

in vivo

i denne undersøgelse har vi designet to procedurer til at behandle MIPS celler. MIPS celler blev dyrket uden fødeceller i en blanding af MIPS medium og konditioneret medium fremstillet af følgende muse cancercellelinier: Lewis lungecarcinom (LLC), muse embryonal carcinom (P19), muse melanom (B16) og musebrystcarcinom (MC .E12) i 4 uger. MIPS celler dyrket under disse betingelser blev betegnet MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm, og MIPS-MC.E12 cm celler hhv. MIPS celler blev også dyrket sammen med hver cancercellelinie, der tidligere var blevet behandlet med mitomycin C som fødeceller i 4 uger. Disse MIPS celler blev kaldt MIPS-LLCc, MIPS-P19c, MIPS-B16c og MIPS-MC.E12c celler hhv. MIPS celler, der var blevet dyrket med eller uden fødeceller under de forskellige betingelser blev derefter transplanteret i nøgne mus. Efter 4 uger, MIPS celler dannet typiske teratomer, der indeholdt opdelte væv uden metastaser (fig. S1A). I modsætning hertil mus allotransplantater af MIPS-celler, der var blevet behandlet med konditioneret medie, MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm og MIPS-MC.E12 cm celler, dannet udifferentierede karcinomer, der besad celler med høj kerne og cytoplasma forholdet , nuklear pleomorphism, afvigende høje mitotiske satser, og flere patologiske mitotiske figurer (fig. 2A og S1B). På den anden side, kun MIPS-MC.E12c celler i cokultur gruppe dannet maligne tumorer (fig. S1B). Tumorigeniciteten af ​​de forskellige celler er opsummeret i tabel 1. Det er bemærkelsesværdigt, at kun tumorer, som blev afledt fra MIPS-LLCcm celler viste træk ved angiogenese og mikrometastaser (fig. 2A).

(A) Histologi af MIPS -LLCcm celler afledt tumor. Tumoren udviste maligne fænotype med kirtel epitelial hyperplasi (stjerne), høj kerne og cytoplasma ratio, alvorlig nuklear atypi og flere patologiske mitotiske tal (pilespidser, indsat) (øverst til venstre); mikrometastaser (pil, øverst til højre); og hypervascularization indikerer angiogenese (nederst til venstre) af HE farvning. Den positive af CD31 (Rat monoklonalt antistof, brun) ved IHC farvning viste flere vaskulære skibe i tumoren (nederst til højre). Scale barer: 100 um (øverst til venstre og bund), 50 um (øverst til højre). (B) Primær kultur afledt fra MIPS-LLCcm tumor. Den primære kultur udviste stamceller-lignende celler (stjerne i øverst til venstre), der udtrykker GFP (øverst til højre) og fibroblastlignende celler (pil i øverste venstre) uden GFP-ekspression (øverst til højre). Sfæroid celler dyrket fra den primære kultur i suspension (midten til venstre) med GFP-ekspression (midten til højre). De sfæroide celler blev placeret tilbage i adhærerende kultur opretholdt stamceller-lignende celler (stjerne i nederst til venstre) med GFP-ekspression (nederst til højre) og fibroblastlignende celler (pil i nederste venstre) uden GFP-ekspression (nederst til højre). (C) Immunfluorescensfarvning for Nanog og oktober 3/4 i kugleformede celler. Snit af frosset kugleformede celler blev farvet med primære antistoffer (kanin-anti-Nanog eller Mouse anti-oct-3/4) efterfulgt af anti-kanin eller anti-mus sekundære antistoffer mærket med Alexa fluoroforer 555 (rød) eller 488 (grøn). Cellerne blev modfarvet med DAPI (blå). Scale bars: 20 uM. (D) Ekspressionsniveauerne af p53, MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR. MIPS + LIF /-MEF, MIPS celler dyrket med LIF i mediet, men uden MEFfeeder celler; MIPS-LLCcm klumpformet, sfæroiden celler afledt danner MIPS-LLCcm celler; MIPS-LLCcm LMT klumpformet, sfæroiden celler afledt af MIPS-LLCcm celler lunge metastatisk tumor; LLC, Lewis lunge carcinomceller.

MIPS-LLCcm celler havde en kapacitet på selvfornyelse

Tredive til halvtreds procent af cellerne GFP positive i tumorer afledt af MIPS-LLCcm celler, mens mindre end fem procent var positive i den differentierede teratom (fig. S2). Da GFP er designet under

Nanog

promotor til stabilt udtrykke kun i celler, der var udifferentieret og ville blive tavse i differentierede væv [11], de fleste af MIPS celler blev anset for at være differentieret i teratomer. På den anden side, de maligne væv underforstået at indeholde udifferentierede stamceller-lignende celler. Primære kulturer af tumoren bør være en effektiv metode til potentielt eliminere de differentierede celler for at opnå flere stamceller-lignende celler afledt fra MIPS-LLCcm. Således tumorvævet afledt af MIPS-LLCcm celler blev underkastet primær kultur, hvorfra to forskellige former for cellepopulationer blev observeret. En var stamceller-lignende celler, som udtrykte GFP, mens den anden population var fibroblastlignende celler, som undlod at udtrykke GFP (fig. 2B). Eftersom maligne celler med stamceller-lignende egenskaber kan opformeres in vitro som adhærerende kugler [19], [20], blev cellerne overført til ikke-adhærente dyrkningsskåle at lette væksten af ​​sfæroider. I suspension, blev GFP-ekspression (fig. 2B) observeret i disse tumor sfærer, hvorimod fibroblastlignende celler ikke kunne overleve uden vedhæftning til bunden af ​​skålen og var GFP negativ. Sfæroiderne afledt fra MIPS-LLCcm tumor blev gentagne gange trypsiniseret og bekræftet for evnen til at danne sfæroider under non-adhærente tilstand. Indivisual celler fra dissocierede sfærer var i stand til at danne nye sfærer under seriel passage i vævskultur, hvilket viser, at cellerne kunne forny sig selv [21]. Tumor sfærer blev derefter overført til adhærente dyrkningsskåle (fig. 2B) og blev underkastet immunfluorescensfarvning for Nanog og oktober 3/4 (fig. 2C). Den positive farvning af Nanog og oktober 3/4, der er kritiske faktorer for at opretholde den udifferentierede tilstand og selvfornyelse af stamceller [11], [21], bekræftede udtryk for stamcelle markører i disse sfæroider. Et aspekt af kræft tilstand af MIPS-LLCcm sfæroide celler var rettet til ekspression af p53-genet ved RT-qPCR. Som resultat blev ekspressionen fundet nedreguleret til niveauet i LLC-cancerceller (fig. 2D). Denne nedregulering kan indikere malignitet af cellerne. Til bedømmelse tumorigeniciteten af ​​cellerne i tumoren sfærer, 1 × 10~4 × 10

6 af disse celler blev subkutant transplanteret i nøgne mus (tabel 2). Efter 4 uger, tumorer dannet og udstillet omfattende angiogenese (fig. 3A), hvilket svarede til MIPS-LLCcm afledte tumorer. Men disse tumorer forekom mere aggressiv grund af den høje væksthastighed. For at undersøge metastatisk potentiale, 1 x 10

5 sfæroide celler blev injiceret i mus halevene. En måned senere blev flere metastatiske noduler udtrykker GFP fundet i lunger viser, at de blev afledt af kugleformede celler (fig. 3B og 3C). Og ekspressionsniveauet af MMP-2 blev fundet signifikant opreguleret i de sfæroide celler afledt fra MIPS-LLCcm celler lunge metastatisk tumor (MIPS-LLCcm LMT sfæroide) (fig. 2D), hvilket indebar, at MIPS-LLCcm celler besidder den metastatiske potentiale forårsaget ved induktion af MMP-2-ekspression, og befolkningen af ​​meget metastatiske celler kan isoleres fra MIPS-LLCcm celler gennem in vivo panorering.

(A) Histologi tumor stammer fra kugleformede celler. Tumoren viste nogle kirtel struktur (asterisk) med flere patologiske mitotiske tal (pilespidser, indsat) (til venstre), høje mitotiske priser (pilespidser i midten), og hypervascularization (højre) af HE farvning. Scale barer: 100 um. (B) lungemetastase efter haleveneinjektion af kugleformede celler. Lunger blev besat af metastatiske tumor knuder. (C) De metastaser viste nogle kirtel struktur (asterisk) med flere patologiske mitotiske figurer (pilespidser i øverst til venstre); hypervascularization (øverst til højre); invasion i lunge parenkymalt væv (nederst til venstre) af HE farvning. Ekspressionen af ​​GFP (Polyklonalt antistof, brun) blev fundet i disse metastatiske knuder ved IHC-farvning (nederst til højre). T, tumor; L, lungevæv. Scale barer: 100 um. (D) Immunhistokemi af CK og GFP lokalisering i tumorer afledt af MIPS, MIPS-LLCcm og sfæroide celler. Serielle snit blev farvet med CK (monoklonalt muse-antistof, brun) og GFP (Polyklonalt antistof, brun), og modfarvet med hæmatoxylin. Glandulær region var CK positive men GFP negativ i tumorer. Scale barer:. 100 um

Tumoren afledt MIPS-LLCcm celler blev sammensat af adenokarcinomer og rigelige udifferentieret tumorceller

Vi derefter undersøgte typen af ​​ondartet svulst ved IHC. Pan-cytokeratin (CK, et epitel tumorceller markør), vimentin (en markør for mesenkymale tumor), α-actin (en markør for myogene tumor), CD31 (en markør for vaskulogenese), NF-M og GFAP (markører for neurogen tumor) blev anvendt til at farve tumorerne (data ikke vist). CK viste sig at være stærkt farvet i tumorerne. Ekspressionen af ​​CK og GFP blev derefter vurderet i flere serielle sektioner. Glandulær regioner var CK positive men disse celler var GFP negativ i tumorerne (fig. 3D). Tredive til halvtreds procent af tumorcellerne var GFP positive i tumorerne, der var blevet afledt fra begge MIPS-LLCcm og primærbatterier sfæroide celler, mens ingen regioner var GFP positive i teratom. Derfor blev disse tumorer dømt adenokarcinomer blandet med rigelige udifferentierede tumorceller.

De afledte celler udtrykte embryonale stamceller markører

embryonale stamceller markører og de fire transkriptionsfaktorer, der blev transduceret blev derefter kontrolleret ved revers transkription-PCR (RT-PCR) og kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR). MIPS-LLCcm celler og sfæroide celler viste ekspression af de embryonale stamceller cellemarkører (fig. 4A), men ekspressionsniveauer var noget anderledes mellem disse tumorceller og de oprindelige MIPS celler (fig. 4C). Konkret ved RT-qPCR

Nanog

Rex1

var signifikant forhøjet i MIPS-LLCcm tumorceller, i primære kulturer afledt af disse tumorer eller i de sfæroide kulturer i forhold til MIPS celler dyrket i fravær eller nærvær af fødeceller. I modsætning hertil fandtes ekspressionen af ​​de fire transkriptionsfaktorer, der skal reduceres i varierende grad i begge MIPS-LLCcm celler og sfæroide celler sammenlignet med MIPS celler, som blev opformeret på fødeceller (fig. 4B og 4D).

(A) RT-PCR-analyse af embryonale stamceller markørgenekspression. (B) RT-PCR-analyse af de fire MIPS transkriptionsfaktorer. PCR-produkterne blev de kodende regioner (Total), endogene transkripter kun (Endo.) Og transgene transkripter kun (TG). (C) Ekspressionsniveauer af embryonale stamceller markørgen blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR. (D) Expression niveauer af de fire MIPS celle transkriptionsfaktorer blev analyseret ved kvantitativ real-time PCR.

Diskussion

MIPS-LLCcm celler viste klumpformet dannelse i suspension kultur, en høj tumorigent potentiale ved begrænsede fortyndinger og en høj metastatisk potentiale, som alle var i overensstemmelse med de grundlæggende karakteristika for CSCS [19], [22], [23]. Rapid tumorvækst kræver de novo-angiogenese, hvor den vaskulære niche giver vækstfremmende signaler. Tumorerne afledt fra MIPS-LLCcm celler, herunder de sfæroide celler viste også en høj grad af angiogenese, som ikke blev observeret i de teratomer afledt fra MIPS celler. Tætte associering i CSCS og blodkar er tidligere blevet dokumenteret i nervesystemet og disse vaskulære nicher medvirke til vedligeholdelse af CSCS [24]. IFNy, en større negativ regulatorisk molekyle af angiogenese, er blevet vist at nedregulere ekspressionen af ​​MMP’er, inhiberer endothelcellemigration samt fremkalde den angiostatiske faktor IP-10 gennem aktivere af JAK-STAT signalvej [25]. Microarray vurdering sammenligne MIPS celler og MIPS-LLCcm celler viste nedregulering af IFNγR i MIPS-LLCcm celler (Materialer og metoder S1, tabel S1), som kan være ansvarlig for angiogenese i MIPS-LLCcm celler afledt tumor. Højere udtryk af MMP-2 i MIPS-LLCcm LMT celler giver det metastatiske potentiale til MIPS-LLCcm celler kan være et resultat af IFNγR reduktion, selv om der kræves yderligere analyse. Tager nedregulering af MMP-9 genekspression i både MIPS-LLCcm og MIPS-LLCcm LMT celler i betragtning, synes ansvarlig for angiogenese og metastase i denne undersøgelse MMP-2.

Self-fornyelse er ofte nævnt som karakteristisk for CSCS. Men der er tekniske begrænsninger til nøje vurdere selvfornyelse. For normale væv stamceller, standard test af selvfornyelse kræver klonal in vivo demonstration af selvfornyelse og multi-slægt differentiering i primære transplantationer af stamceller, efterfulgt af demonstration af de samme egenskaber i serielle transplantationer af de samme celler. Self-fornyelse i tumorgene cancerceller er generelt blevet evalueret af demonstration af serielle transplantability af polyklonale tumorer og ved demonstration af en tilsvarende fænotypisk heterogenitet i forældrenes og afkom tumorxenoplantater [26]. Rækkefølgen af ​​forsøg med MIPS-LLCcm celler, der blev afledt af primære tumorer og deres gentagne subkultur som sfæroider demonstrerede kapacitet selvfornyelse i MIPS-LLCcm celler opnår sekundære tumorer udviser samme histologi og fænotype som de primære tumorer [21] .

Desuden

Nanog

, en markør bredt forbundet med ‘stemness «var stadig udtrykt ved højere niveauer i MIPS-LLCcm celler og sfæroide celler sammenlignet med MIPS celler.

Nodal

Cripto1

er embryonale morfogener, der er ansvarlige for maintaince af pluripotens /selvfornyelse i embryonale stamceller og udføre en kritisk rolle i at bevare den udifferentierede tilstand af celler [7]. I MIPS-LLCcm celler,

Nodal

Cripto1

ekspressionsniveauerne var signifikant højere sammenlignet med MIPS celler, som bekræftede den relativt udifferentierede tilstand MIPS-LLCcm celler. Faldet i Nodal ekspression med 70% i kugleformede celler sandsynligvis demonstreret differentieringen af ​​sfæroide celler fra pluripotente stamceller til unipotente stamceller som CSCS. blev observeret en signifikant nedregulering af stamceller markører i teratomer, der blev afledt af MIPS celler som disse tumorer indeholder blandede populationer af forskellige differentierede celletyper. I modsætning hertil i tumorer afledt af MIPS-LLCcm celler og kugleformede celler, ekspressionsniveauerne af disse markører også faldet, men forblev langt højere end i teratomer. Disse resultater, som var i overensstemmelse med de af IHC, indebærer, at der var en vis mængde af de CSCS i de maligne tumorer, mens næsten alle cellerne blev differentierede i teratomer.

tumorceller udviklet i dette studie fra MIPS-celler voksede som sfæroider i suspensionskultur, viste en høj tumorigen og metastatisk potentiale og angiogenese in vivo. Hertil kommer, som evnen til selvfornyelse og vedligeholdelse af en udifferentieret tilstand vurderes af ekspression af markører, der er forbundet med embryonale stamceller tyder på, at disse primære MIPS-LLCcm celler og de sfæroide celler, som blev afledt fra MIPS-LLCcm celler indeholder en høj andel af CSCS. Scaffidi og Misteli har for nylig rapporteret produktionen af ​​CSC-lignende celler fra fibroblast, som kan spores til somatiske stamceller [27]. De transducerede onkogene gener af hTERT, H-Ras V12 og SV40 T-antigenerne at producere CSC-lignende celler ved omprogrammering. Det bør være bemærkelsesværdigt, at vores CSC model blev udviklet uden brug gentransduktion. Dette er den første rapport at påvise udviklingen af ​​en CSCS population fra MIPS celler, der kan opnås ved faktorer, der udskilles af tumorceller selv om identiteten af ​​disse opløselige faktor (er) er stadig ukendt. Eksogent introduceret

C-myc

i MIPS celler kan bidrage til udvikling siden reaktivering af

C-myc

båret af en retrovirus blev anset for at være forbundet med tumordannelse i 20% af kimære mus [11]. Desuden kan utætte ekspression af disse transgener inhiberer også komplet MIPS celledifferentiering og modning, hvilket fører til en større risiko for umodne teratom dannelse [28]. Imidlertid viste vore resultater, at transgenerne, der blev brugt til at generere MIPS-celler var næsten fuldstændig lydløs i MIPS-LLCcm celler og sfæroide celler sammenlignet med MIPS celler dyrket på fødeceller og at de to onkogener,

C-myc

og

Klf4

blev dramatisk reduceret i MIPS-LLCcm celler og sfæroide celler. Dette antyder, at transgenerne ikke kan være de vigtigste faktorer, der er ansvarlige for transformation af MIPS celler i denne aktuelle model. Hertil kommer, på grund af ingen tumordannelse blev observeret i tilfælde af MIPS-P19c, -B16c, og ingen overlevende af MIPS-LLCc, som alle var i “co-kultur gruppen”, bør der være ringe mulighed for overførsel eller bidrag mus tumor virus i tumorgenicitet af MIPS celler dyrket i konditioneret medium. I betragtning af den manglende tumorgenicitet i disse celler i co-kultur gruppe, bør den ikke-optimale tilstand iPS kultur være svært at forklare omdannelsen af ​​MIPS celle mens muligheden for viral transfektion stadig i sagerne MIPS-MC.E12 cm og -MC.E12c [29]. Endvidere fire selvstændige værker rapporterer om genomiske analyser af iPS og afslører en bekymrende tilstedeværelse af mutationer i disse celler [30] – [33], som kan være cue MIPS er lettere at blive påvirket af den opløselige faktor (er) eksisterede i tumormikromiljøet . Exosomer er 40-100 nm bilipid membranvesikler, der udskilles af de fleste celletyper. De menes at mediere celle-celle-kommunikation og lette biologiske processer, såsom cellevækst og malign transformation [34], [35]. Baseret på de seneste beretninger om tumor exosomer [36], [37], er det værd at tydeliggøre den betydelige rolle exosomer udskilles fra LLC celler i omdannelsen af ​​MIPS celler til CSCS. Desuden er vores fund af downregluration af p53 genekspression i MIPS-LLCcm celler indikerer, at den forstyrrede p53 netværk er en af ​​mekanismerne i omdannelsen af ​​MIPS celler til CSCS. Det er blevet rapporteret, at tumorceller kan inhibere p53 induktion i tilstødende fibroblast [38]. Det er værd at bemærke, at en mekanisme af denne undertrykkelse bør afhænge af den faktor secerneres fra tumorceller, men ikke på direkte celle-til-celle-interaktion. Definition og karakterisering af de genetiske ændringer og de udskilte faktorer i tumor mikromiljø, som konverterer MIPS celler til en CSC vil være virkningsfuldt for udvikling af nye anti-behandlinger mod kræft.

ekspression af specifikke celleoverflademarkører har været meget anvendt til at identificere CSCS. Nogle af disse overflade markører er kendt for at være fælles for forskellige CSCS befolkning. Disse markører kan stadig være forbundet med normale stamceller [1]. Differentielt udtrykt overflademarkører der kan skelne normale stamceller fra CSCS er stort set ukendte [19]. Det er bydende nødvendigt at identificere markører, der kan skelne mellem CSCS og normale stamceller. Denne cellulære model i dette papir bør tjene som et brugbart redskab til at identificere potentielt bona fide markører for CSCS. Sådanne markører kunne være potentielle mål i udviklingen af ​​nye behandlingsformer mod CSCS uden at påvirke normale stamceller funktioner.

Materialer og metoder

Cell kultur

Mus induceret pluripotente stamceller (MIPS; celle navn: iPS-MEF-Ng-20D-17, Lot No. 012) blev erhvervet fra Riken Cell Bank (Japan) og blev opretholdt i medium (DMEM indeholdende 15% FCS, 0,1 mM NEAA, 2 mM L- glutamin, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 1000 U /ml LIF, 50 U /ml penicillin og 50 U /ml streptomycin) på fødelag af mitomycin-C-behandlede muse embryonale fibroblast (MEF) celler (Reprocell, Japan). Muse Lewis lungecancer (LLC) -celler blev indkøbt fra ATCC (USA) og blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% FCS; muse embryonal carcinomceller (P19) blev indkøbt fra Riken Cell Bank (Japan) og blev opretholdt i aMEM indeholdende 10% FCS; musemelanomceller (B16 /BL6) (ATCC, USA) og muse-brysttumor-celler (BALB-MC.E12) (Riken Cell Bank, Japan) blev holdt i MEM indeholdende 10% FCS.

Til fremstilling konditioneret medium (CM) fra de forskellige muse cancercellelinier, medium blev opsamlet fra konfluerende retter og filtreres med 0,45 um filter (Millpore, Irland). Derefter 3 ml CM blev sat i 3,5 cm skål natten over for at bekræfte der var ingen overlevende kræftceller i CM. For det konditionerede medium forsøg blev MIPS-celler (uden MEF fødeceller) opretholdt i beskrevet ovenfor uden LIF medium. Halvdelen af ​​mediet blev udskiftet hver dag med CM i 4 uger. MIPS celler uden behandling med CM, blev anvendt som kontrol. For cokultur eksperimenter blev de muse tumorcellelinjer behandlet med 0,4 ug /ml mitomycin C (Sigma, USA) og blev derefter anvendt som fødeceller og samdyrket med MIPS-celler (uden MEF fødeceller) i 4 uger. MIPS-celler blev passeret hver 3 dage og cellemorfologi blev fotograferet under anvendelse af et Olympus IX81 mikroskop udstyret med en lys fluorescens anordning (Olympus, Japan).

I primær kultur blev muse allografter skåret i små stykker (ca. 1 mm

3) i HBSS. Efter vask tre gange blev vævene overført til et 15 ml rør med 0,25% trypsin på 5-6 folds volumen ved 37 ° C i 40 min. Fem mikroliter DMEM indeholdende 10% FCS blev tilsat derefter at afslutte fordøjelsen. Den cellulære suspension blev derefter placeret i et nyt rør og centrifugeres ved 1000 rpm i 10 min. Cellepelleten blev resuspenderet i 5 ml HBSS og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min. Cellepelleten blev derefter placeret i en passende volumen af ​​MIPS medium uden LIF og cellerne blev podet i en skål med en tæthed på 5 x 10

5 /ml. Celler blev passeret hver 3. dag og celler morfologi blev observeret og fotograferet ved anvendelse af Olympus IX81 mikroskop udstyret med en lys fluorescens anordning (Olympus, Japan). Salg

Suspensionskulturer at generere sfæroider blev udført som beskrevet i Dontu et al [39 ]. Kort fortalt blev enkelte celler udpladet på ikke-overtrukne skåle (bakteriekultur skål) med en densitet på 2 x 10

4 /ml i primær kultur. Celler blev dyrket i serumfrit MIPS medium uden LIF. Sfæroider celler blev opsamlet ved forsigtig centrifugering (500 rpm) efter 7-10 dage og dissocieret enzymatisk (0,025% trypsin /EDTA).

Dyreforsøg

nøgne mus (Balb /c Slc

-nu /nu

, kvindelige, 6~8 uger) blev købt fra Charlesriver, Japan. Planen for dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af den etiske komité for dyreforsøg i Okayama University under id’er OKU-2008211, OKU-2009144, OKU-2010179 og OKU-2011-305.

For transplantationsstudier, celler (vist i tabel 1 og 2) blev suspenderet i 100 pi DMEM indeholdende 10% FCS og injiceret subkutant i nøgne mus. Efter 4 uger blev tumorer udskåret og fikseret i 10% neutral formalin pufferopløsning (Wako, Japan).

I micrometastases studier, 1 x 10

5 i MIPS-LLCcm sfæroide celler blev suspenderet i 100 pi DMEM indeholdende 10% FCS og injiceret i nøgne mus halevene (n = 6).

Histologisk analyse og immunhistokemisk (IHC)

Tumorer blev fikseret i 24 timer og derefter behandlet på en rutinemæssig voks -embedding procedure for histologisk undersøgelse. Tre mikrometer tykke snit blev farvet med hematoxylin og eosin (HE).

IHC for GFP, pan-cytokeratin, vimentin, α-Actin, CD31, NF-M, blev GFAP udført under anvendelse formalinfikseret paraffinindlejret væv sektioner og standardprocedurer. Kort fortalt blev 3 um vævssnit afparaffineret og antigen hentes blev udført under anvendelse mikrobølgeovn eksponering ved 95 ° C i 5 minutter i en citratbuffer (pH 6,0) eller inkubering i proteinase K (40 ug /ml) ved 37 ° C i 30 minutter.