PLoS ONE: IGF-IR Fremmer Prostata Cancer Vækst ved at stabilisere a5p1 integrinprotein Niveauer

Abstrakt

Dynamisk krydstale mellem vækstfaktorreceptorer, celleadhæsionsmolekyler og ekstracellulær matrix er essentiel for kræft cellemigration og invasion. Integriner er transmembrane receptorer, som binder ekstracellulære matrixproteiner og muliggør celleadhæsion og cytoskeletorganisation. De medierer også signaltransduktion at regulere celledeling og overlevelse. Den type 1 insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF-IR) medierer tumorcellevækst, adhæsion og inhibering af apoptose i flere typer af kræft. Vi har tidligere vist, at β

1 integriner regulerer forankringsuafhængig vækst af prostatacancer (PRCA) celler ved kontrol af IGF-IR-ekspression og androgen receptor-medierede transkriptionelle funktioner. Desuden har vi for nylig rapporteret, at IGF-IR regulerer ekspressionen af ​​β

1 integriner i PRCA celler. Vi har dissekeret den mekanisme, gennem hvilken IGF-IR regulerer β

1 integrin udtryk i PRCA. Her rapporterer vi, at IGF-IR er afgørende for PRCA cellevækst og at β

1 integriner bidrager til reguleringen af ​​spredning af IGF-IR. Vi viser, at β

1 integrin regulering af IGF-IR ikke forekommer på mRNA niveau. Exogen udtryk for en CD4 – β

1 integrin cytoplasmatisk domæne kimære ikke interfererer med denne regulering, og undlader at stabilisere β

1 integrin udtryk i fravær af IGF-IR. Dette synes at være på grund af manglende samspil mellem β

1 cytoplasmatisk domæne og IGF-IR. Vi viser, at IGF-IR stabiliserer β

1 underenhed ved at beskytte den mod proteasomalaktivitet nedbrydning. Den α

5 underenhed, en af ​​de bindende partnere β

1, er også nedreguleres sammen med β

1 ved IGF-IR knockdown mens der ikke observeres nogen ændring i ekspressionen af ​​α

2 , α

3, α

4, α

6 og α

7 underenheder. Vores resultater viser en afgørende mekanistisk rolle for α

5β

1 integrin, nedstrøms af IGF-IR, i reguleringen af ​​kræft vækst

Henvisning:. Sayeed A, Fedele C, Trerotola M, Ganguly KK , Languino LR (2013) IGF-IR Fremmer Prostata Cancer vækst ved at stabilisere α

5β

1 integrinprotein Levels. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10,1371 /journal.pone.0076513

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Juli 3, 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 9 okt 2013

Copyright: © 2013 Sayeed et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kontrakt tilskud sponsor: NIH; Kontrakt tilskud nummer: R01 CA-89.720 og CA-109.874 (til LRL), P01 CA-140.043 (til LRL); American Cancer Society (ACS) -IRG-08-060-04 (til AS); Kontrakt tilskud sponsor: Pennsylvania Department of Health. Dette projekt er også finansieret, delvist under en Commonwealth University Research Enhancement Program tilskud med Pennsylvania Department of Health (H.R.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Languino, den tilsvarende forfatter, er en redaktionel bestyrelsesmedlem for PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Adhæsion af celler til ekstracellulære matrix (ECM) er primært medieret af integriner og er afgørende for cellevækst og overlevelse. Integriner er heterodimere transmembrane receptorer, der består af a- og p-underenheder, som er ikke-kovalent associeret; de fysisk forbinder ECM til det intracellulære actin cytoskeleton men er også i stand til at transducere signaler bidirektionalt over plasmamembranen [1]. Ved binding til ECM ligander, er integriner aktiveret og i stand til at regulere cellulære funktioner ved at indlede intracellulære kaskader af signalering. Hidtil 24 integrin heterodimerer, 18 α og 8 β underenheder og fem β

1variantsubunits β

1Aβ

1Bβ

1Cβ

1C-2 og β

1D, genereret af alternativ splejsning , er blevet beskrevet [2], [3]. Integriner er kritiske regulatorer af vækst, differentiering, overlevelse, migration og invasion [4], [5]. Det er blevet rapporteret, at progression af prostatakræft (PRCA) til fremskredne stadier er forbundet med ændringer i integrin udtryk profiler [6], [7], [8].

De veje for integrin og vækstfaktor signalering er menes at være mekanisk forbundet, fordi celleadhæsion til ECM er afgørende for celler til at reagere på visse vækstfaktorer [9]. Vækstfaktorsignalering kan forstyrre fokale adhæsioner, de formodede lokaliteter af integrin-medieret signalering [9] og dermed modulere integrin-medieret celleadhæsion og motilitet. Fysiske og funktionelle interaktioner mellem integriner og komponenter i vækstfaktor signalveje, herunder insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1) eller dens downstream signalproteiner [10], [11], er blevet rapporteret. Vores laboratorium har vist, at β

1 integriner selektivt at modulere type 1 insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF-IR) -medieret signalering og funktioner i PRCA [10], [12]. IGF-1 er også blevet rapporteret at inducere adhæsion og migration i humane myelomatoseceller dels via aktivering af β

1 integriner [13]. Endvidere konstitutivt aktiv p

1 integriner fremmer malign fænotype i PRCA celler og målrette dem blev rapporteret at inhibere PRCA metastase [14].

IGF-1 er en enkelt kæde polypeptid, der ud over sine mere klassiske endokrine rolle, medierer autokrin eller parakrin vækst og virker således som en potent vækst og overlevelse faktor. IGF-1 fremkalder sine handlinger på celler ved at binde til sin receptor, IGF-IR. IGF-IR er et heterotetramere transmembran-glycoprotein med tyrosinkinaseaktivitet [15]. Insulinreceptoren substrat (IRS) proteiner fungerer som specifikke docking proteiner til IGF-IR og insulinreceptoren (IR) [16]. IRS1 og IRS2 ikke indeholder iboende kinase aktivitet, men snarere fungerer ved at rekruttere proteiner til overfladen receptorer, hvor de samler signalering komplekser. Signalering fra IRS proteiner resulterer i aktiveringen af ​​veje, herunder phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) [17], [18]. Interessant er begge veje også kendt for at blive aktiveret af integrin indgreb [19], [20]. Associationen mellem integriner og IRS1 er blevet foreslået som en mulig mekanisme for synergistisk virkning af vækstfaktor og ekstracellulære matrix-receptorer [21]. IGF-1-signalering er blevet rapporteret at være reguleret af en negativ feedback-mekanisme via ubiquitin /proteasom-medieret nedbrydning af IRS2, hvorved størrelsen og varigheden af ​​respons på insulin eller IGF-1 reguleres [22]. Vores laboratorium har for nylig vist, at β

1 integriner regulerer IGF-IR-ekspression og er kritiske for IGF-1-medieret forstærkning af androgen receptor (AR) aktivitet [23]. Vi har også rapporteret, at IGF-IR stramt regulerer β

1 integrin udtryk i PRCA celler [24], men den mekanisme bag denne regel er endnu ikke karakteriseret.

På trods af den begrænsede enighed om niveauet af IGF IR udtryk i benigne og maligne prostata epitel, flere kliniske forsøg rettet mod IGF-IR i forskellige tumorer, herunder PRCA, er undervejs. Identificere og forstå de nedstrøms effektorer af IGF-IR ville hjælpe med en bedre definition af funktionelle rolle af IGF-1-aksen i PRCA. I betragtning af den rapporterede tegn på stærk fysisk og funktionel interaktion mellem β

1 integriner og IGF-IR, dette studie undersøgte den mekanisme, gennem hvilken IGF-IR regulerer β

1 integriner. Vi rapporterer en ny vej for krydstale mellem IGF-IR og β

1 integriner, som fremmer cancer celleproliferation, og vise, at IGF-IR stabiliserer α

5β

1 integrin ved at beskytte den mod proteasomalaktivitet nedbrydning.

Materialer og metoder

reagenser og antistoffer

følgende reagenser blev anvendt. Opti-Mem og oligofectamine (alle fra Invitrogen, CA), syntetisk androgen R1881 (Perkin-Elmer, CA), proteinaseinhibitorer (Sigma, MO), rekombinant IGF-1 (R at a

2 integrin (Abcam, Cambridge, UK); at a

7 integrin (8G2, EMD, NJ). Rotte mAb mod CD4 blev indkøbt fra Santa Cruz, CA. De følgende polyklonale kaninantistoffer (pAb’er) blev anvendt: til IGF-IR (IGF-IR-β sc713), til AKT og ERK1 /2 (fra Santa Cruz, CA); til survivin (Novus Biologicals, CO). Kanin pAb’er til a

3, α

4, og α

5 specifikt for den C-terminale domæne af hver underenhed, var en venlig gave fra Dr. E. Ruoslahti, University of California, Santa Barbara, Sanford -Burnham Medical Research Institute, CA. Den α

6 Ab (AA6A) specifikt for det C-terminale domæne af humant α

6 integrin var en venlig gave fra Dr. Anne Cress, University of Arizona, AZ. SiRNA oligonukleotider, der anvendes i denne rapport, er blevet beskrevet før [24].

Celler

LNCaP og C4-2B celler blev indkøbt fra ATCC. Celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i RPMI-1640 suppleret med 5% FBS og 1% hver af natriumpyruvat, HEPES og ikke-essentielle aminosyrer. At evaluere virkningen af ​​agonister, efter transfektion blev celler sultet med 2% trækul-strippet serum (CSS) indeholdende medium i 24 timer efterfulgt af ligand stimulation for yderligere 24 timer. PC3-celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS. PC3-CH1, PC3-CH2- og PC3-Ch β

1C celler anvendt til inducerbar ekspression af kimære konstruktioner er blevet beskrevet tidligere [25], [26]. Celler blev serum-udsultet i 24 timer og behandlet med 75 pM ZnSO

4 i 6 timer. CH1 kimære konstrukt indeholder det ekstracellulære domæne af murine CD4 og de transmembrane og cytoplasmatiske domæner af β

1A integrin; Ch β

1C konstruktion (anvendt som en kontrol) er den samme som Ch1 bortset fra at β

1A integrin-kodende region erstattes af β

1C kodende region. CH2-konstruktionen udgør en anden kontrol og bærer det ekstracellulære domæne af murin CD4 forbundet til det transmembrane domæne af β

1 integrin subunit. Alle konstruktionerne er udtrykt under kontrol af muse-metallothionein-1-promotoren og ekspressionen af ​​kimære varianter induceres ved tilsætning af ZnSO

4 til vækstmediet.

Transient siRNA transfektion

Transient transfektion af celler med siRNA oligonukleotider blev udført som beskrevet [23]. Inverteret-IGF-IR siRNA har en invers målsekvens af IGF-IR siRNA tjente som kontrol.

Proliferationsassay

LNCaP og C4-2B celler blev transient transficeret med kontrol eller IGF-IR siRNA . Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og analyseret for effektiviteten af ​​IGF-IR og β

1 integrin nedregulering. Transficerede celler blev talt og re-udpladet i tre eksemplarer på plader med 6 brønde ved 3 × 10

4 celler per brønd i 2% CSS-holdigt medium i nærvær af 1 nM R1881. Levende celler blev talt for næste tre dage i træk ved hæmocytometer. Billeder af levende celler blev taget på dag 2 og 3, før de høstes til tælling.

Anchorage-uafhængig vækst assay

LNCaP celler blev belagt og transficeret med kontrol eller IGF-IR siRNA i kombination med enten vektor alene, pBJ1, eller en pBJ1-β

1 konstrukt [27]. Fireogtyve timer senere blev celler trypsinbehandlet og udpladet i blød agar i 6-brønds skåle ved 5000 celler /brønd. Cellerne fik lov at vokse i to uger og kolonier optalt. Kolonistørrelsen blev målt ved hjælp af et okular udstyret med en måle- reticle og kolonier med størrelse på 0,1 mm blev talt i forskellige prøver. Kolonierne blev fikseret og farvet med krystalviolet og billeder af kolonier blev fanget af stereomikroskop.

Immunopræcipitation og immunblotting

Immunopræcipitation af PC3-celler blev udført som beskrevet tidligere [28]. Cellelysater blev anvendt til immunoblotting som beskrevet [12]. For at analysere PC3 cellelysater transficeret med kimære konstruktioner blev PC3-CH1 og PC3-CH2- celler transficeret med kontrol eller IGF-IR siRNA og 24 timer senere blev cellerne dyrket i serum-frit medium i 24 timer efterfulgt af behandling med 75 pM ZnSO

4 i 6 timer og derefter, høstet til immunblotting. Intensiteten af ​​hvert bånd blev evalueret ved ImageJ analyse og normaliseret med lastning kontrol.

FACS-analyse

PC3-CH1 og PC3 -CH2 celler blev behandlet som ovenfor og høstet for FACS-analyse. Cellerne blev farvet med 1 ug /ml Ab til CD4 eller rotte IgG som negativ kontrol, efterfulgt af farvning med FITC-konjugeret sekundært Ab. Udtryk profiler blev erhvervet under anvendelse af FACS Calibur-instrument (BD) og data blev analyseret ved Flowjo software (Tree Stjerne Inc., OR).

proteasomalaktivitet inhiberingsassay

LNCaP-celler blev transficeret med kontrol eller IGF -IR siRNA og 24 timer senere blev cellerne udsultet i 2% CSS-holdigt medium i 24 timer. Cellerne blev behandlet med 1 nM R1881 med eller uden 10 pM MG132 i 6 timer. PC3-2 celler blev transficeret på samme måde som LNCaP-celler og 24 timer efter transfektion behandlet med 10 pM MG132 til enten 6 eller 24 timer og analyseret ved immunblotting. For specifik inhibering af proteasomet funktionen ved hjælp epoxomicin blev LNCaP-celler transficeret som ovenfor, sultet med 2% CSS-holdigt medium i 24 timer, efterfulgt af behandling med 1 nM R1881 sammen med 0, 100, 250 eller 500 nM epoxomicin i 18 timer og høstet. Lysater blev analyseret ved immunblotting. Relative båndintensiteter af β

1 integrin underenheder

Kvantitativ realtids-PCR

Real time PCR-analyse blev udført som beskrevet tidligere [23]. Hver reaktion blev udført, i mindst tre eksemplarer; standardafvigelser og signifikans blev beregnet ved anvendelse Excel (Microsoft) software. Sekvenserne af oligoer anvendes, er som følger: β

1 integrin, (forstand: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, antisense: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, fornuft: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, antisense: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (forstand: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, antisense: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-actin, (sense: TCCATCATGAAGTGTGACGT, antisense: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans (P-værdi og t-test) mellem datasæt blev beregnet ved anvendelse Excel (Microsoft) software. En to-sidet P-værdi på ≤0.02 blev betragtet som statistisk signifikant. Resultaterne blev afbildet på en graf ved hjælp DeltaGraph 4.5 (Rockware) software.

Resultater

Tab af IGF-IR og β

1 integriner hæmmer proliferation af PRCA celler

Vi har tidligere vist, at β

1 integriner er afgørende for IGF-IR-medieret c ancer celleproliferation [10]. Da IGF-IR stramt regulerer β

1 integrin udtryk, vi vurderet den direkte virkning af IGF-IR udtømning på celleproliferation. LNCaP og C4-2B celler blev transient depleteret for IGF-IR og genudpladet i 2% CSS-holdigt medium i nærvær af 1 nM syntetisk androgen (R1881). Tab af IGF-IR påfaldende inhiberer celleproliferation i begge cellelinier (

* P 0,02) (fig 1A, toppaneler.). Reduceret ekspression af IGF-IR og β

1 integrin-underenheder for begge cellelinier blev bekræftet ved immunoblotting (fig. 1A, underpanel). R1881 blev anvendt til at forbedre ekspressionsniveauerne af IGF-IR og β

1 og at øge virkningerne af disse receptorer på proliferation. Væsentlige virkninger på celleproliferation blev også observeret i fravær af R1881 i LNCaP- og C4-2B celler efter IGF-IR udtømning (data ikke vist). Reduceret celledensitet i dyrkningsbetingelser er klart observeret ved analyse af C4-2B celler med reducerede IGF-IR og p

1-niveauer sammenlignet med celler med endogen ekspression af begge receptorer (fig. 1B). Repræsentative celle tæthed billeder af dag 2 og dag 3 proliferationsassays er vist. Disse data viser, at IGF-IR og β

1 integriner er afgørende for proliferation af PRCA celler.

(A) LNCaP og C4-2B celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller IGF-IR siRNA og 24 h senere blev celler trypsiniseret og talt. Celler blev genudpladet i triplikater på 3 × 10

5 celler per brønd i 6-brønds plader med 2% CSS-holdigt medium i nærvær af 1 nM R1881, høstet og talt på dag 1, 2 og 3 efter fornyet udpladning . Hver forsøgsgruppe assay blev udført tredobbelt og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse fra tre uafhængige værdier (

* P 0,01) i forhold til respektive kontrol siRNA behandlinger. En parallel sæt af LNCaP og C4-2B cellelysater blev analyseret for effektiviteten af ​​IGF-IR og β

1 integrin subunit nedregulering af immunoblotting (lavere paneler). (B) Repræsentative billeder af relative C4-2B celledensiteter på dag 2 og dag 3 vises.

Eksogen udtryk for β

1 integrin subunit genopretter nedsat forankringsuafhængig vækst af PRCA celler efter IGF-IR nedregulering

resultaterne at IGF-IR regulerer β

1 integrin udtryk, og at ophævelsen af ​​IGF IR kompromitteret væksten af ​​kræftceller, fik os til at undersøge, om β

1 integriner spiller en rolle i IGF-IR-medieret vækstregulering. For at bestemme, om β

1 integrin ekspression ville vende inhiberingen af ​​forankringsuafhængig vækst induceres af IGF-IR udtømning, blev LNCaP-celler transficeret med IGF-IR siRNA, med eller uden β

1 integrin cDNA og lov til at vokse og danne kolonier i blød agar i to uger. IGF-IR udtømning reducerer væksten af ​​kolonier i blød agar (

** P 0,01) (fig. 2). Exogen ekspression af β

1 subunit dog delvis opvejer den vækstsuppression induceret af IGF-IR knockdown som målt ved antallet af kolonier med størrelse ≥100 um (

* P 0,02). Repræsentative billeder af levende kolonier blev opfanget på et omvendt mikroskop og er vist i det nederste panel (fig. 2). Disse data understreger den rolle, β

1 integriner i IGF-IR-medieret regulering af vækst i PRCA celler.

LNCaP-celler blev co-transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA og med enten pBJ1 -β

1 konstruktion eller kontrol vektor pBJ1. Celler blev udpladet i blød agar og lades vokse i 2 uger. Størrelsen af ​​kolonierne blev målt under anvendelse af et inverteret mikroskop udstyret med et okular indeholdende en 25 mm reticle og totale kolonier med størrelsen ≥100 um blev talt. De viste i grafen tal repræsenterer de gennemsnitlige tællinger fra tre uafhængige prøver (

* P 0,02;

** P 0,001). Repræsentative billeder af levende kolonier afspejler variationen i kolonistørrelse med eller uden exogent β

1 er vist i de nedre paneler. De måler søjler repræsenterer en størrelse på 100 um.

IGF-IR regulering af β

1 integrin udtryk forekommer ikke på mRNA niveau

Cooperative effekt af disse receptorer på væksten af ​​kræftceller førte os til at undersøge den mekanisme, hvormed IGF-IR regulerer β

1-ekspression. Vi har vist tidligere, at IGF-IR regulerer ekspressionen af ​​β

1 integrin-underenheder i PRCA celler [24]. Denne regulering kan forekomme på det transskriptionelle, posttranskriptionelle, translationel eller post-translationelle niveau. mRNA regulering af β

1 integriner efter IGF-IR blev analyseret i LNCaP-celler ved at reducere ekspressionen af ​​IGF-IR ved RNA-interferens, efterfulgt af behandling med R1881 og /eller IGF-1. Tidstro analyser af mRNA-transkripter indikerer, at IGF-IR-mRNA induceres 8-fold upon R1881 og 2,5 gange ved IGF-1-behandling (fig. 3). Men der ikke detekteres nogen væsentlige ændringer i β

1 integrin mRNA-niveauer på begge behandlinger. Udtømning af IGF-IR ekspression resulterer i fire gange reduktion af IGF-IR-mRNA efter ligand behandlinger. Dataene indikerer, at β

1 integrin transkriptniveauer ændrer ikke væsentligt ved IGF-IR knockdown. Analyse af GAPDH udtryk profil i dette eksperiment fungerede som en yderligere reference kontrol. Resultaterne indikerer klart, at IGF-IR ikke regulerer p

1 integrin-underenheder på mRNA-niveauet.

LNCaP-celler blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA. Fireogtyve timer senere blev celler dyrket i medium indeholdende 2% CSS til yderligere 24 timer og behandlet med vehikel, 1 nM R1881 eller 100 ng /ml IGF-1 i yderligere 24 timer. RNA isoleret fra disse celler blev bedømt for transkriptniveauer af IGF-IR, β

1 integrin og GAPDH ved brug af kvantitativ realtids-PCR. Ekspressionssystemer værdier blev normaliseret i løbet transkriptniveauer af β-actin og dataene er vist som relative ekspression. Hver reaktion blev kørt i tre eksemplarer og fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (

* P 0,01) i forhold til ubehandlede prøver

inducerbar ekspression af CD4-β

1A integrin cytoplasmatisk domæne kimære gør. ikke beskytte den endogene β

1 integrin subunit fra nedbrydning fremkaldt af IGF-IR udtømning

for at undersøge, om den exogene udtryk for det cytoplasmatiske domæne af β

1A ændrer IGF-IR-medieret regulering af endogene β integrin-underenheder, kimære konstruktioner sammensat af transmembrane og cytoplasmatiske domæne af β

1A integrin med CD4 ekstracellulære domæne (CH1) blev anvendt

1. Det cytoplasmatiske domæne af β

1 underenheden findes i fem forskellige splejsede former; den mest udtrykte form kræft, β

1A, regulerer β

1 lokalisering, celleproliferation og migration [2]. Vi spekuleret på, at binding af det cytoplasmatiske domæne af β

1 integriner til IGF-IR ville føre til en vis konkurrence om binding af IGF-IR til forskellige former for β

1 og resultere i en β

1 beskyttende virkning i henhold udtømte IGF-IR betingelser. Ekspression af CH1 kimæren (CH1-celler), eller Ch2 kimæren, hvilket svarer til det transmembrane domæne af β

1 plus CD4 ekstracellulære domæne (CH2 celler), i PC3-celler blev induceret ved ZnSO

4 behandling. IGF-IR udtømning i stabilt transficerede celler blev bekræftet ved immunoblotanalyse (fig. 4A, øverste venstre panel). Induktion af den cytoplasmatiske β

1 variant blev bekræftet ved FACS (Fig. 4A, nedre paneler). Efter induktion, ville IGF-IR forventes at omfordele og binde til både den endogene β

1 og eksogen cytoplasmatisk variant. Exogen induktion af β

1 cytoplasmatiske domæne imidlertid ændrer ikke IGF-IR-medieret regulering af endogen β

1 integrin niveauer (Fig 4A, øverste højre panel). For at undersøge, om β

1A cytoplasmatisk variant fysisk interagerer med IGF-IR, immunfældning af CD4 i PC3-Ch1 og PC3-Ch β

1C celler (stabilt transficeret med cytoplasmatisk domæne af β

1C integrin plus CD4 ekstracellulære domæne [29]), blev foretaget efter inkubering af cellerne med ZnSO

4. De immunoblot viser (øverste panel) tilstedeværelsen af ​​IGF-IR i cellelysat, men ikke i CD4 immunopræcipiterede prøver. Det nedre panel viser, at CD4 blev effektivt immunopræcipiteret; et irrelevant bånd blev også påvist i de IgG immunopræcipiterede prøver. Dataene indikerer, at det cytoplasmatiske domæne af β

1A integrin variant interagerer ikke med endogen IGF-IR (fig. 4B).

(A) PC3-Ch1 (udtrykkende ekstracellulære domæne af murine CD4 og de transmembrane og cytoplasmatiske domæner af β

1) og kontrol-PC3-CH2- celler (som udtrykker det ekstracellulære domæne af murin CD4 forbundet til det transmembrane domæne af β

1) blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne høstet for at vurdere effektiviteten af ​​IGF-IR knockdown (øverst til venstre paneler). PC3-CH1 og PC3-CH2- celler blev udsultet i serum-frit medium i 24 timer og hvor det er angivet, induceret med 75 pM ZnSO

4 for yderligere 6 timer for at fremme ekspressionen af ​​kimære proteiner. Celler blev høstet til analyse af β

1 underenhedsekspression (øverste højre paneler). Et parallelt sæt prøver blev bearbejdet for at bekræfte den inducerbare ekspression af kimærerne ved FACS-analyse under anvendelse af en Ab til CD4 (lavere paneler). 10.000 celler i hver prøve blev erhvervet og data er vist i histogrammer med x-aksen repræsenterer middelværdi relative CD4-ekspression og y-aksen repræsenterer antallet af celler. (B) PC3-Ch1 og PC3-Chβ

1C (kontrol celler, der udtrykker ekstracellulære domæne af murine CD4 og de transmembrane og cytoplasmatiske domæner af β

1C) inkuberet med 75 pM ZnSO

4 at inducere ekspressionen af det cytoplasmatiske domæne af β

1A eller β

1C integriner hhv. Lysater blev immunfældet med enten kontrol IgG eller Ab mod kimære CD4-domæner. Immunkomplekser blev analyseret for IGF-IR ekspression ved immunblotting. Input lysater blev kørt som kontroller.

Enhanced proteasomalaktivitet nedbrydning af β

1 integrin underenheder i fravær af IGF-IR

Efter at påvise, at IGF-IR regulerer ikke β

1 integrin transkripter, søgte vi at bestemme, hvorvidt IGF-IR-medieret regulering af β

1 integrin niveauer vil forekomme ved posttranslationel niveau. Forbigående udtømning af IGF-IR i LNCaP-celler blev efterfulgt af R1881 behandling alene eller i kombination med en proteasominhibitor, MG132, i 6 timer. R1881 blev anvendt til at forbedre de basale ekspressionsniveauer af IGF-IR og β

1 integrin subunit som rapporteret af vores gruppe tidligere [23] og cellelysater blev analyseret. Reduktionen af ​​β

1 integrin niveauer induceret af IGF-IR depletering blev afskaffet ved celle behandling med denne proteasominhibitor (fig. 5A). Resultaterne af dette forsøg blev bekræftet i PC3-celler efter transfektion med enten kontrol siRNA eller IGF-IR siRNA efterfulgt af behandling med MG132 i enten 6 eller 24 timer (fig. 5B). Vi har desuden bekræftet disse resultater ved anvendelse af forskellige doser af epoxomicin, en anden meget specifik proteasominhibitor [30]. LNCaP-celler blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA som ovenfor og behandlet med stigende koncentrationer af epoxomicin. β

1 integrin underenheder er til stede i enten forstadiet eller modne former (110 og 130 kD) og begge er nedreguleres på IGF-IR tab. Dataene viser, at epoxomicin blokerer nedbrydningen af ​​den modne form af β

1 integrin underenhed (fig. 5C). Det modne β

1 receptor alene synes at følge proteasomalaktivitet nedbrydning efter internalisering. Forløberen form for β

1 (110 kD), som kræver yderligere post-translationelle modifikationer til at gennemgå modning ikke nyttiggøres ved proteasomalaktivitet hæmning. Dataene viser, at IGF-IR stabiliserer β

1 integrin subunit-ekspression ved at inhibere dets proteasomalaktivitet nedbrydning.

(A) LNCaP-celler blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA. Fireogtyve timer senere blev celler dyrket i medium indeholdende 2% CSS til yderligere 24 timer og behandlet med vehikel, 1 nM R1881 og /eller 10 uM MG132 i 6 timer. Cellelysater blev analyseret for ekspression af β

1 integrin underenhed og IGF-IR ved immunoblotting. AKT blev anvendt som en loading kontrol. Bandet intensiteter af β

1 integrin subunit blev kvantificeret ved ImageJ analyse og normaliseret med de AKT som en loading kontrol. De relative værdier intensitet er udtrykt som procent af kontrolprøven transfekteret med kontrol siRNA alene. (B) PC3-celler blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 10 pM MG132 for 6 eller 24 timer i RPMI-medium indeholdende 10% serum. Cellelysater blev analyseret for ekspression af β

1 integrin underenhed og IGF-IR ved immunoblotting. AKT blev anvendt som en loading kontrol. β

1 integrin underenheder blev kvantificeret ved ImageJ som ovenfor og værdier normaliseret med de lastning kontrol AKT. Relativ intensitet værdier af β

1 er udtrykt som procent af kontrolprøven transficeret med kontrol siRNA alene. (C) LNCaP-celler blev transficeret som ovenfor, og 24 timer senere blev celler dyrket i medium indeholdende 2% CSS i yderligere 24 timer efterfulgt af behandling med 0, 100, 250 eller 500 nM epoxomicin i kombination med 1 nM R1881 i 18 timer. Cellelysater blev analyseret for modne og precursor-former af β

1 integrin underenhed og IGF-IR ved immunblotting. AKT tjener som en loading kontrol. Relative band intensiteter af moden β

1 integrin blev bestemt ved ImageJ analyse som ovenfor.

Analyse af α integrin subunits upon IGF-IR nedregulering

Integriner er heterodimerer bestående af α og p-underenheder. Der er 24 mulige heterodimerer med evnen til at aktivere specifikke signalveje [19]. β

1 integriner blandt andre underenheder, er kendt for at heterodimerisere med α2, α3, α4, α5, α6 og a7 integrin-underenheder, der udtrykkes i LNCaP-celler. Da reduktion af IGF-IR ekspressionsniveauer fører til nedregulering af β

1 integrin subunit, besluttede vi at bestemme hvilken a integrin subunit var påvirket af IGF-IR nedregulering. Vi demonstrerer en signifikant reduktion af α5 integrin underenheden sammen med reduceret IGF-IR og p-niveauer

1 (fig. 6). Ingen ændring blev detekteret i ekspressionsniveauerne af andre a integrin heterodimere partnere (fig. 6 og data ikke vist). Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere observationer i PC3 celler, hvor ophævelsen af ​​β

1 integriner ved shRNA ført til en betydelig reduktion i overfladen udtryk for α5 integrin underenhed [3]. Vore data viser, at det store kompleks reguleret af IGF-IR er α5β

1 integrin.

LNCaP-celler blev transficeret med enten kontrol eller IGF-IR siRNA og behandlet med 2% CSS-holdigt medium i 24 timer efterfulgt af behandling med 1 nM R1881 i 24 timer. IGF-IR og β1 integrin nedregulering blev evalueret ved immunoblots. Lysaterne blev derefter analyseret for ekspressionen af ​​forskellige a integrin subunits. Ab’er mod α

2, α

4, α

5, α

6 og α

7 integrin-underenheder blev anvendt til at identificere α integrin partner for β

1 integrin underenhed, der nedreguleres ved IGF-IR udtynding.

diskussion

Denne undersøgelse beskriver en roman observation, at IGF-IR funktioner i PRCA celler er delvist medieret af β

1 integriner. At dissekere den mekanisme, hvorved IGF-IR regulerer β

1 integrin ekspression, viser vi, at IGF-IR forbedrer β

1 integrin stabilitet ved at reducere dens proteasomalaktivitet nedbrydning. Vi viser også, at α

5 integrin underenhed forbundet med β

1 selektivt nedreguleres på IGF-IR tab.

Væsentlige epidemiologiske og prækliniske data har identificeret IGF-IR vej som en vigtig regulator tumor cellebiologi. De skuffende resultater, men fra flere kliniske undersøgelser havde til formål at hæmme IGF-IR, er at spørge forskerne til at udvikle prædiktive biomarkører for at forbedre patientens valg, der vil drage fordel af behandlinger rettet mod IGF-IR. Desuden er en klarere forståelse af de relative andele af IGF-IR og IR-komplekser i tumorer er nødvendig.