PLoS ONE: Brain-neurotrofisk faktor (BDNF) -induceret tropomyosin-relaterede kinase B (Trk B) signalering er en potentiel terapeutisk Mål for peritoneal carcinomatose Foranlediget af kolorektal Cancer

Abstrakt

tropomyosin-relateret receptor kinase B (TrkB) signalering, stimuleret af hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) ligand, fremmer tumorprogression, og er relateret til dårlig prognose af forskellige maligniteter. Vi søgte at undersøge den kliniske relevans af BDNF /TrkB udtryk i kolorektal cancer (CRC) væv, dets prognostisk værdi for CRC patienter, og dets terapeutiske potentiale

in vitro

in vivo

. To hundrede og treogtyve CRC patientprøver blev brugt til at bestemme både BDNF og TrkB mRNA-niveauer. Ekspressionen af ​​disse proteiner i deres primære og metastatiske tumorer blev undersøgt ved immunohistokemi. CRC cellelinier og rekombinant BDNF og K252a (en selektiv farmakologisk pan-Trk-inhibitor) blev anvendt til

in vitro

cellelevedygtighed, migration, invasion, anoikis modstand og

in vivo Salg peritoneale metastase assays. Tissue BDNF mRNA var forbundet med leveren og peritoneal metastase. Tissue TrkB mRNA blev også forbundet med lymfeknudemetastaser. Co-ekspression af BDNF og TrkB var forbundet med leveren og peritoneal metastase. Patienter med højere BDNF, TrkB, og co-ekspression af BDNF og TrkB havde en signifikant dårlig prognose. BDNF øget tumor cellelevedygtighed, migration, invasion og hæmmede anoikis i TrkB-udtrykkende CRC cellelinier. Disse effekter blev undertrykt af K252a. I mus injiceret med DLD1 co-udtrykker BDNF og TrkB, og efterfølgende behandlet med K252a blev peritoneale metastatiske knuder viser sig at blive reduceret i forhold til kontrol mus. BDNF /TrkB signalering kan således være et potentielt mål for behandling af peritoneal carcinomatose skyldes kolorektal cancer

Henvisning:. Tanaka K, Okugawa Y, Toiyama Y, Inoue Y, Saigusa S, Kawamura M, et al. (2014) Brain neurotrofisk faktor (BDNF) -induceret tropomyosin-relaterede kinase B (Trk B) signalering er en potentiel terapeutisk Mål for peritoneal carcinomatose Foranlediget af kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (5): e96410. doi: 10,1371 /journal.pone.0096410

Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: 15 oktober, 2013; Accepteret: April 7, 2014; Udgivet: 6. maj 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (KAKENHI 24.591.972 til YI, og 25.462.051 til SS). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den enestående fremskridt i behandlingen af ​​metastatisk kolorektal cancer (mCRC) er i dag baseret på seneste multi-drug kombination kemoterapi, som nu producerer median overlevelse på mere end 20 måneder [1]. Men peritoneal carcinomatose (PC) kan opstå, fra CRC. PC er forbundet med meget ringe overlevelse, og meget få terapeutiske eller palliative behandlinger er tilgængelige [2]. Således er en bedre forståelse for de molekylære og biologiske adfærd af PC der følger af CRC presserende behov for at fremme udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier.

Brain neurotrofisk faktor (BDNF) er et medlem af neurotrophin ( NT) familie. BDNF spiller en vigtig rolle i udviklingen og reparation af nervesystemet [3]. Det binder til sine to store receptorer, den tropomyosin-relateret receptor kinase B (TrkB) med høj affinitet og specificitet, og den pan-NT-receptor p75 (p75

NTR) med lav affinitet [4]. Binding af BDNF til TrkB fører til autophosphorylering af tyrosiner i det intracellulære domæne med aktivering af downstream signalveje såsom RAS /MAPK og PI3K /AKT [4], [5]. BDNF binder også lav affinitet p75

NTR som udøver forskellige funktioner såsom regulering af cellens overlevelse og differentiering under neuronal udvikling [6].

Selv om både TrkB og p75

NTR involveret i proliferation, differentiering, overlevelse og apoptose af neuronale og ikke-neuronale tumorer [7], [8], p75

NTR fortrinsvis fungerer som et interagerende partner for TrkB, modulerer TrkB aktivering med BDNF, og påvirkninger prosurvival virkning af BDNF /TrkB signalering [ ,,,0],9].

BDNF /TrkB signalering er blevet rapporteret at være forbundet med tumor progression, metastase, og respons på kemoterapi i flere humane maligniteter såsom neuroblastom [10], i æggestokkene [11], hoved og hals [12 ], lunge [13], hepatocellulær [14], pancreas [15], blære [16], prostata [17], myelomatose [18], og brysttumor [19]. TrkB har også vist sig at fremme resistens mod anoikis (en form for frigørelse apoptose) [20], og derved at bibringe metastatiske egenskaber eller epithelial-mesenchymal overgang (EMT) [21], [22]. I modsætning til rollen som TrkB i cancer, p75

NTR synes at have enten tumor-fremme eller tumor-undertrykke funktioner i henhold til tumortyper [8]

Tidligere har studier i vores laboratorium afsløret.: en sammenhæng mellem TrkB niveauer tumor progression og patient prognose i gastrisk kræft [23]; sammenslutningen af ​​TrkB med kemoterapi modstand i kræft i spiserøret [24]; og TrkB involvering i EMT af kolorektal cancer [25]. Senere har vi vist, at inddragelse af BDNF /TrkB pathway i tumorudvikling i gastrisk cancer [26].

Med hensyn til BDNF /TrkB signalering i CRC, blev BDNF eller TrkB overudtrykt i både klinisk tumor prøver og forbundet med aggressive tumor fænotyper [27] – [30].

In vitro

undersøgelser viste, at BDNF /TrkB signalering var involveret i proliferative eller invasive egenskaber [27] – [30], og effektivitet eller modstand af anti-epidermal vækstfaktor receptor monoklonalt antistof cetuximab [31] eller gastrin- frigivende peptid-receptor [32]. Disse linjer af beviser viste, at BDNF /TrkB signalering fremmer tumor progression, hvilket fører til en dårlig prognose for forskellige menneskelige maligniteter, og at det har vist sig som et potentielt terapeutisk mål [33], [34].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge: sammenhængen mellem BDNF /TrkB udtryk og klinisk-patologiske variabler i en række humane CRC væv; den prognostiske værdi af BDNF /TrkB signalering i CRC patienter; og dets terapeutiske potentiale in vitro og in vivo.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev revideret og godkendt af Institutional Review Board og den lokale etiske komité for den Mie University Graduate School of Medicine (nr 2126). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter (voksne og forældre til børn) indskrevet på studiet.

De eksperimentelle protokoller af in vivo studier blev gennemgået og godkendt af Animal Care og brug Udvalg ved Mie University Graduate School of Medicine.

patienter

i alt 223 patienter med CRC, der blev behandlet på Institut for Mave og Pediatric Surgery i Mie University Graduate School of Medicine 2000-2008, var inkluderet i denne undersøgelse. Patienter med ufuldstændige kliniske data, utilstrækkelig opfølgning eller utilstrækkelig væv prøveudtagning blev udelukket fra undersøgelsen. Alle patienter havde histologisk bekræftet adenocarcinom i colon eller rectum. Den mediane alder af patienterne var 67 år (spændvidde: 12-91 år). Den mediane follow-up tid var 30,6 måneder (interval: 1,5 til 107,2). I alt 49 patienter døde af CRC-relaterede årsager i denne periode.

Iscenesættelse var baseret på klinisk vurdering og histopatologisk analyse hjælp Den Internationale Union Against Cancer (UICC) TNM. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle de deltagende patienter på studiet, i henhold til lokale etiske retningslinjer. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board.

Sample samlinger

Kræft væv blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk resektion og opbevaret ved -80 ° C indtil brug. Diagnosen CRC blev bekræftet for alle 223 patienter baseret på clinicopathologic fund.

Total RNA ekstraktion, blev cDNA syntese

Kræft væv hakket og homogeniseret med en Mixer Mill MM 300 homogenisator (Qiagen, Chatsworth , CA, USA). Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et RNeasy mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret ud fra 5 ug totalt RNA med en tilfældig hexamer-primer og Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Real-time kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (RT -PCR) og relative genekspressionsniveauer

Kvantitativ PCR (qPCR) analyse blev udført ved anvendelse af en TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ekspressionsniveauerne af målgenet udskrifter, målt ved hjælp af TaqMan prober til BDNF (Assay ID, Hs00380947_m1) og TrkB (Assay ID, Hs00178811_m1), blev normaliseret til GAPDH (Assay ID, Hs02758991_g1) og evalueres ved hjælp af Applied Biosystems StepOne Software (v2. 1).

Den relative BDNF og TrkB genekspression blev bestemt ved anvendelse af en standardkurve. Den standardkurve blev genereret ved anvendelse af en 5-gange seriefortynding af vilkårligt primet qPCR Humant referencenummer cDNA (TAKARA BIO INC., Clontech, Japan). Alle standard kurver blev lineær inden for det område, der anvendes til analyse, med en acceptabel tilsvarende korrelationskoefficient (R

2). Niveauet af ekspression af målgenet blev beregnet ud fra standardkurven, og normaliseret mod GAPDH. Endelig blev målgenet mRNA-niveauet udtrykt som et forhold i forhold til GAPDH mRNA-niveauet. Real-time kvantitativ PCR assays blev udført tre gange for hver prøve, og middelværdien blev anvendt ved beregningen af ​​mRNA ekspressionsniveauer. Salg

Amplified PCR-produkter blev separeret elektroforetisk, visualiseret og fotograferet under UV-lys efter farvning med ethidiumbromid.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført som tidligere [25] beskrevet. §§ 2-3 um tykke blev skåret fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) eksemplarer af CRC patienter. Efter afparaffinering og dehydrering blev prøverne kogt i 10 mM natriumcitrat-buffer i 15 min for at afsløre antigenerne. Snit blev derefter blokeret med normalt gedeserum (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) i 60 minutter og inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C. Antistofbinding blev påvist under anvendelse Envision reagenser (Envision kit /HRP, Dako Cytomation, Danmark). Alle snit blev modfarvet med hematoxylin. Et primært polyklonalt kanin-antistof mod BDNF (H-117, 1:350; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og et primært muse-monoklonalt antistof mod TrkB (1:100; R Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ved en 1:100 fortynding, og muse monoklonale anti-actin (klon C4) antistof (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) ved en 1:400 fortynding i 5% skummetmælk i TBS-T natten over ved 4 ° C. Efter vask tre gange i TBS-T, blev blottene inkuberet med alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti- muse-IgG (Promega, Madison, WI, USA) ved en 1:200 fortynding i 5% skummetmælk i TBS-T. Efter behandling med en forbedret kemiluminescensdetektion løsning blev kemiluminescerende signaler visualiseres i en CS Analyzer og AE-6962 lys capture (ATTO Corp., Tokyo, Japan).

Cell levedygtighed assay

For at vurdere blev brugt effekten af ​​BDNF på cellelevedygtighed, migration, invasion, og anoikis modstand, rekombinant humant BDNF og K252a, en selektiv farmakologisk pan-Trk-hæmmer,.

Cell levedygtighed, migration, invasion, og anoikis modstand var sammenlignet blandt ikke-behandlede celler (kontrol), BDNF-behandlede celler, K252a-behandlede celler og K252a efterfulgt af BDNF-behandlede celler.

Cytotoksicitet blev evalueret under anvendelse af en WST-8 [2- (2-methoxy -4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] kolorimetrisk assay. Kræftceller (5000 celler /brønd) blev podet på 96-brønds celleplader (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) i 100 pi kulturmedium i 24 timer. Efter præinkubation blev cellerne behandlet med K252a (100 nM) eller serumfrit medium i 2 timer og derefter behandlet med enten rekombinant humant BDNF (100 ng /ml) eller serumfrit medium. 48 timer senere blev mediet fjernes og erstattes med 90 pi frisk medium efterfulgt af tilsætning af 10 pi WST-8 reagensopløsning (Cell Counting Kit, DOJINDO Laboratories, Japan) og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en inkubator .

Cellelevedygtighed blev bestemt ved kolorimetrisk sammenligning ved at læse absorbansen (OD) værdier fra en mikropladelæser (SoftMax, Molecular Devices Corporation, CA, USA) ved en absorptionsbølgelængde på 450 nm. Cytotoksicitet blev vurderet ved anvendelse af Cell Counting Kit ifølge producentens anvisninger. Dataene blev indsamlet fra lignende resultaterne af mindst tre uafhængige forsøg. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SE).

Migration assay

Sammenflydende cancerceller var serum-berøvet i 48 timer. Sårene blev frembragt under anvendelse af en steril 200-pi pipettespids efter præinkubering med K252a (100 nM) eller serumfrit medium i 2 timer. Rekombinant human BDNF (100 ng /ml) eller serumfrit medium blev tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 46 timer. Sårlukning blev vurderet ved hjælp af et Olympus IX71 mikroskop (Olympus, Center Valley, PA, USA) på 10 × forstørrelse. Cellemigrering afstand blev målt ved hjælp af Adobe Photoshop 9.0.2 software og sammenlignet med baseline-målinger. Hver uafhængigt forsøg blev udført mindst tre gange. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SE.

Invasion assay

Cell invasion blev evalueret ved hjælp BioCoat Matrigel invasion kamre og kontrol indsatser (Becton Dickinson Labware). I alt 50000 celler /brønd blev podet i invasionen og styrekamre, og præinkuberet med 100 nM K252a eller serumfrit medium i 2 timer. Frisk medium alene eller medium indeholdende rekombinant human BDNF (100 ng /ml) blev derefter tilsat til Falcon ledsagende plader (BD Biosciences, San Jose, CA). De Matrigel invasion kamre og kontrol inserter blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Inkubationen medium indeholdende celler blev fjernet fra øverste kammer ved hjælp af vatpinde og serum-frit medium. Membranerne blev fikseret i methanol, farvet med Mayers hematoxylin, dehydreret i ethanol, og monteret på objektglas. Antallet af celler, som invaderede undersiden af ​​membranen blev derefter bestemt. Hver uafhængigt forsøg blev udført tre gange. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SE.

anoikis assay

anoikis, løsrivelse apoptose, er kendt for at blive induceret, når adhærente tumorceller er tvunget til at vokse i en ikke-klæbende måde. Anoikis resistens blev vurderet ved andelen af ​​levedygtige tumorceller, som prolifererede ikke-adhærent i lav-vedhæftede retter.

anoikis assays blev udført i seks-brønds Costar Ultra Low Attachment Mikroplader (Corning, NY, USA). DLD1, LoVo, og SW480 celler blev suspenderet i RPMI-1640 med BDNF (100 ng /ml), K252a (100 nM) eller K252a + BDNF ved en koncentration på 5 x 10

5 celler /ml. Deres cellesuspensioner (2 ml) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 24 timer i en fugtig atmosfære (37 ° C og 5% CO

2).

Efter induktion af anoikis, celler blev podet ved 5 × 10

3 celler /brønd i mikrotiterplader (96 brønde, flad bund) i et slutvolumen på 100 pi kulturmedium per brønd. For at vurdere de levedygtige tumorceller, som prolifererede ikke-adhærent i lav-vedhæftede retter, blev spektrofotometrisk absorbans af hver brønd målt ved anvendelse WST-8 reagensopløsning som beskrevet ovenfor (cellelevedygtighed assay). Hver uafhængigt forsøg blev udført seks gange. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SE

Efter induktion af anoikis, 5 × 10

5-celler blev vasket og resuspenderet i 0,5 ml 1 x bindingsbuffer, og Annexin V:. Fluoresceinisothiocyanat /propidiumiodid ( PI) mærkning udført i overensstemmelse med producentens protokol (Bio Vision, Mountain View, CA, USA). Analysen blev udført ved anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) for at kvantificere andelen af ​​levedygtige eller apoptotiske tumorceller under ikke-adhærerende vækst tilstand ved hjælp lav-vedhæftede retter. Hver prøve indeholdt 5 × 10

5 celler. Dataene blev analyseret ved anvendelse CellQuest Pro software (BD Biosciences). Levedygtige tumorceller, der var negative for både Annexin V og PI-farvning (nederste venstre kvadrant) blev betragtet som anoikis-resistente celler med ikke-klæbende vækst. Apoptotiske tumorceller, som var positive for Annexin V-farvning (nederste højre kvadrant + øverste højre kvadrant) blev betragtet som anoikis-inducerede celler. Tumorceller behandlet med 2,5% formalin opløsning blev anvendt som en positiv kontrol for apoptose induceret celler. Flowcytometrisk analyse blev udført for at bekræfte resultaterne af celle levedygtighed assay for anoikis modstand.

In vivo

peritoneal metastaser assay

Mand nøgne mus (BALB /c) ved 8 uger gamle, blev indkøbt fra Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan). De eksperimentelle protokoller blev revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg ved Mie University Graduate School of Medicine. DLD1 celler (5 x 10

7 celler /500 pi PBS) blev injiceret intraperitonealt til peritoneal metastatisk formation. Enten K252a (500 ug /kg) eller PBS (kontrol) blev injiceret intraperitonealt tre gange om ugen for at undersøge effekten af ​​K252a på peritoneale metastatisk formation. Fire uger senere blev musene aflivet, og derefter blev størrelsen og antallet af peritoneale metastatiske knuder blev evalueret (hver gruppe; n = 5). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SE.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af JMP-version 5 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA). Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SE (standard error). Forskelle mellem grupper blev estimeret ved anvendelse af Pearsons chi-square test, repeated-foranstaltninger variansanalyse (ANOVA) analyse eller en uparret t-test. Aktuarmæssige overlevelseskurver blev opnået ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og sammenligninger blev foretaget under anvendelse af log-rank test. Univariate og multivariate analyser blev udført ved hjælp af Cox proportional hazard model til at undersøge virkningerne af de histopatologiske og molekylære faktorer (BDNF og TrkB udtryk status) til stede i den primære tumor prøven på samlet overlevelse (OS). Variable forbundet med overlevelse med en P-værdi mindre end 0,05 i univariat analyse blev anvendt til multivariat analyse. P-værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Tosidet P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Den BDNF mRNA-niveau i CRC væv

BDNF mRNA udtryk ratio, i forhold til. GAPDH, i CRC væv var 0,122 ± 0,230 (gennemsnit ± SD), mellem 0 og 1,357. Til statistiske analyseformål de BDNF mRNA-ekspression værdier blev dikotomiseret så lav eller høj. En cutoff-værdien for BDNF mRNA-niveauet blev bestemt som en maksimal prædiktiv værdi ved anvendelse af en OS baseret på receiver-operating characteristic (ROC) kurve analyse. Et hundrede og to patienter havde høj BDNF mRNA-ekspression ( 0,037), mens 121 patienter havde lav BDNF mRNA-ekspression. Som vist i tabel 1 blev fundet BDNF mRNA ekspressionsniveau i CRC væv, der skal signifikant associeret med synkron levermetastaser (P = 0,007) og synkront peritoneale metastaser (P = 0,026). Ingen signifikant sammenhæng blev observeret mellem BDNF mRNA i CRC væv og andre klinisk-patologiske variabler.

The TrkB mRNA niveau i CRC væv

Ifølge TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA), er sonde af TrkB (Assay ID, Hs00178811_m1) designet til at spænde over exon 6/7 grænser. Tilsvarende primere opformere fragmenterne indeholdende exonerne 6-7 som koder for ekstracellulære del af TrkB receptoren. Derfor er denne primer og probe sæt detekterer både fuldlængde TrkB (TrkB.FL) og den trunkerede TrkB (TrkB.T1) [35].

TrkB mRNA-ekspression ratio, i forhold til GAPDH, i CRC væv var 0,054 ± 0,141 (gennemsnit ± SD), mellem 0 og 1,149. ROC-kurve analyse viste, at cutoff-værdien for TrkB-mRNA var 0,002 (en maksimal prædiktiv værdi for OS). Et hundrede og halvfjerds-én patienter havde høj TrkB mRNA-ekspression, mens 52 patienter havde lav TrkB mRNA-ekspression. Som vist i tabel 1 blev fundet TrkB mRNA-niveauet i CRC væv, der skal signifikant associeret med lymfeknudemetastaser (P = 0,022). Ingen signifikant sammenhæng blev observeret mellem TrkB mRNA niveau i CRC væv og andre klinisk-patologiske variabler.

Co-ekspressionen af ​​BDNF og TrkB i CRC væv

Ninety-fire patienter viste både høj BDNF og TrkB mRNA-ekspression. Denne patientgruppe blev klassificeret som en co-udtrykker både BDNF og TrkB. Som vist i tabel 1, blev co-ekspression af BDNF og TrkB i CRC væv fundet at være signifikant associeret med synkron levermetastaser (P = 0,03) og synkront peritoneale metastaser (P = 0,013). Ingen signifikant sammenhæng blev observeret mellem TrkB mRNA niveau i CRC væv og andre klinisk-patologiske variabler.

Den prognostiske betydning af BDNF, TrkB, og co-ekspression af BDNF og TrkB i kolorektal cancer væv

Figur 1 viser Kaplan-Meier-kurver for BDNF (A), TrkB (B), og co-ekspression af BDNF og TrkB (C), henholdsvis. CRC patienter med højt BDNF mRNA-ekspression (n = 102) havde en signifikant dårligere OS end dem med lav BDNF mRNA-ekspression (n = 121, log-rank test, P = 0,0066). Tilsvarende CRC patienter med højt TrkB-mRNA-ekspression (n = 171) havde en betydeligt ringere OS end dem med lav TrkB-mRNA-ekspression (n = 52, log-rank test, P = 0,0474). CRC patienter, hvis tumorer co-udtrykte BDNF og TrkB (n = 94) havde en signifikant dårligere OS end dem med de andre udtryk mønster (n = 129, log-rank test, P = 0,0348).

(A ): Sammenligning mellem den samlede overlevelse patientgrupper med høj BDNF mRNA-ekspression (n = 102) og dem med lav BDNF mRNA-ekspression (n = 121). (B): Sammenligning mellem den samlede overlevelse patientgrupper med høj TrkB-mRNA-ekspression (n = 171) og dem med lav TrkB-mRNA-ekspression (n = 52). (C): Sammenligning mellem den samlede overlevelse patientgrupper med høj co-ekspression af BDNF og TrkB (n = 94) og dem uden det (n = 129). TrkB mRNA-ekspression indikerer mRNA transkriptniveauer både TrkB.FL og TrkB.T1.

BDNF og TrkB protein udtryk i primære og metastatiske tumorer

Immunhistokemi viste, at BDNF protein ( A, B) blev udtrykt i cytoplasmaet af humane CRC-celler og at TrkB protein (C, D) blev udtrykt i kernen af ​​humane CRC-celler (figur 2). Hos patienter med både primær tumor (A, C) og peritoneal metastatiske knuder (B, D), humane CRC celler ved de peritoneale metastatiske knuder udtrykt både BDNF og TrkB, som gjorde dem i den primære tumor. Vi bekræftede, at anti TrkB antistof (R P. 0,05

Disse resultater antyder, at exogent BDNF øger levedygtighed tumorcelle i TrkB-udtrykkende CRC-celler, og at TrkB receptorblokade kan tilvejebringe en potent middel til inhibering af tumorvækst

BDNF fremmer migration i TrkB udtrykker CRC celler

for at undersøge effekten af ​​BDNF på tumorcellemotilitet blev DLD1 celler anvendt til

in vitro

migration assays. Otteogfyrre timer senere, BDNF forøgede signifikant migrering af DLD1 celler, sammenlignet med de ikke-behandlede kontroller. K252a nedsatte migreringsevnen af ​​DLD1 celler, som var næsten identisk med de ikke-behandlede kontroller. K252a efterfulgt af BDNF inhiberede migreringsevnen af ​​DLD1 celler, sammenlignet med BDNF behandling. De repræsentative billeder af de ovenstående resultater er vist i figur 5A. Kvantitativ analyse af cellemigration blev også vist (figur 5B).