PLoS ONE: PSMA Ligand Konjugerede PCL-PEG Polymere Miceller Målrettede til prostatakræft Cells

Abstrakt

I dette indhold, en lille molekylær ligand af prostataspecifikt membran-antigen (SMLP) konjugeret poly (caprolacton) (PCL) -b-poly (ethylenglycol) (PEG) copolymerer med forskellige bloklængder blev syntetiseret til at konstruere en tilfredsstillende lægemiddelafgivelsessystem. Fire forskellige docetaxel-loaded polymermiceller (DTX-PMS) blev fremstillet ved dialyse med partikelstørrelser mindre end 60 nm som karakteriseret ved dynamisk lysspredning (DLS) og transmissionselektronmikroskopi (TEM). Optimering af de fremstillede miceller blev gennemført på grundlag af kortsigtede stabilitet og narkotika-indlæsning af indhold. Resultaterne viste, at optimerede systemer var i stand til at forblive stabil over 7 dage. Sammenlignet med Taxotere, DTX-PM’er med det samme forhold af hydrofil /hydrofob kædelængde vises lignende adfærd med langvarig frigivelse. Cytotoksicitet den optimerede målrettet DTX-PCL

12K-PEG

5K-SMLP miceller (DTX-PMS2) og ikke-målrettede DTX-PCL

12K-mPEG

5K miceller (DTX-PMS1-) blev vurderet ved MTT-assays under anvendelse prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) positive prostataadenokarcinomceller (LNCaP). Resultaterne viste, at de målrettede miceller havde en meget lavere IC50 end deres ikke-målrettede modparter (48 h: 0,87 ± 0,27 vs 13.48 ± 1.03 pg /ml; 72 h: 0,02 ± 0,008 vs. 1,35 ± 0,54 ug /ml).

In vitro

cellulære optagelse af PMS2 viste 5 gange højere fluorescensintensitet end PMS1- efter 4 timers inkubation. Ifølge disse resultater, romanen nanostørrelse drug delivery system baseret på DTX-PCL-PEG-SMLP tilbyder meget lovende for behandling af prostatacancer

Henvisning:. Jin J, Sui B, Gou J, Liu J, Tang X, Xu H, et al. (2014) PSMA Ligand Konjugerede PCL-PEG Polymere Miceller Målrettede til Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 9 (11): e112200. doi: 10,1371 /journal.pone.0112200

Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA

Modtaget: Juli 14, 2014 Accepteret: 13. oktober 2014 Udgivet: 11. november 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

Polymermiceller har fået betydelig opmærksomhed som lovende anticancer lægemiddelbærere grund af deres bemærkelsesværdige fordele, såsom lille størrelse, smal størrelsesfordeling, høj biokompatibilitet, og solubilisering af hydrofobe lægemidler [1], [2], [3], [4], [5]. Selvsamlede polymere miceller med kerne /skalkonstruktioner sætte systemet i stand til at inkorporere dårligt vandopløselige lægemidler i den hydrofobe kerne og beskytte dem mod nedbrydning i fysiologiske medier [6]. For eksempel den hydrofobe kerne af micellerne sammensat af PCL-PEG tilbyder et reservoir til inkorporering af lægemidler, mens det pegylerede shell sammen med sin nanoskopisk størrelse garanterer transportøren fortsat un-genkendt af det reticuloendotheliale system og gennemgå en lang omløbsperiode i blodet [7], [8], [9].

Selvom polymere miceller udstillet en række fordele, en stor udfordring er deres site-specifikke lægemiddeladministration. Ligand-modificerede polymere micelle lægemiddeladministrationssystemer er i stand til stedspecifik lægemiddelafgivelse. For nylig har adskillige aktive målretning afgivelsessystemer blevet designet ved at konjugere NP’er med ligander, der binder specifikt til biomarkører for ekstracellulære domæner af cancerceller. PSMA som folat hydrolase I og glutamat carboxypeptidase II, er et velkendt transmembranprotein [10] overudtrykt på prostatacancer epitelceller [11], [12] og er blevet vist at have et stort potentiale for prostatacancer (PSA) terapi. PSMA har en lav ekspression i normale prostata epitelceller og benign prostatahyperplasi. Det udtrykkes også i neovaskulatur af de fleste andre faste tumorer, men ikke i vaskulaturen af ​​normalt væv [13], [14]. Alle disse egenskaber gør PSMA et attraktivt biomarkør til påvisning, diagnosticering og behandling af PCa [15], [16]. En hidtil ukendt lille molekylær ligand ((S) -2- (3 – ((S) -5-amino-1-carboxypentyl) ureido) pentandisyre, SMLP) binde specifikt til PSMA har vist sit potentiale til behandling af cancer i de seneste år [17]. Den ureabaseret PSMA inhibitor, SMLP, har en høj affinitet for PSMA grund af stærk hydrogenbinding [10]. Hrkach og Langer

et al.

Udviklet ACUPA (PSMA ligand) konjugeret DTX NP’er sammensat af PEG-b-PLGA eller PEG-b-PLA ved anvendelse af en nano-emulgering metode til at målrette PSMA og evaluerede antitumoreffektiviteten af de nationale parlamenter

in vitro

in vivo

[18]. Den fremragende muligheder, som køretøj-ligand rettet mod PSMA foreslår nødvendighed i at udvikle mere diversificerede forberedelse processer og carrier-materialer på dette område.

I denne undersøgelse, en nanostørrelse selv-samlet drug delivery system baseret på ligand -konjugeret PEG-b-PCL miceller blev fundet at meget lovende med hensyn til målrettet lægemiddeladministration. Copolymerer af PCL og PEG er både kendte bionedbrydelige og biokompatible materialer almindeligt anvendt i biomedicinske område [19], [20], [21], [22], [23]. Som følge af indførelsen af ​​glycolsyre (GA) og mælkesyre (LA), som afbrød den ordnede struktur af de molekylære kæder, viste PLGA lav krystallinitet. Som et resultat, miceller med kerner af PCL som viste højere krystallinitet er mere stabile end dem med PLGA kerner. Desuden, på grund PLGA er en randomiseret copolymer, er det relativt svært at styre forholdet mellem GA til LA netop i storskalaproduktion. Imidlertid er forholdet mellem de to monomerer er en nøglefaktor for at påvirke egenskaben af ​​PLGA [24]. Så PCL blev anvendt som kernedannende blok på grund af sin bedre stabilitet og let at fremstille. PCL-mPEG eller PCL-PEG-COOH blev syntetiseret ved ringåbningspolymerisation af ε-caprolacton initieret af mPEG-OH eller HOOC-PEG-OH [25], [26]. PCL-mPEG og PCL-PEG-SMLP miceller blev fremstillet under anvendelse DTX som model lægemiddel til at undersøge de cytotoksiske virkninger på LNCaP-celler. Desuden er en skematisk illustration af forberedelse og endocytose proces med DTX-PCL-PEG-SMLP vist i figur 1.

Materialer og metoder

Materialer

L -glutaminsyre di-tert-butyl-hydrochlorid og H-Lys (Z) OT-Bu hydrochlorid blev opnået fra En lai bioteknologi Co, LTD (Chengdu, Folkerepublikken Kina). mPEG-OH (Mw: 2 kDa) og mPEG-OH (Mw: 5 kDa) (Aladdin Agent Co, Shanghai, PR China) og OH-PEG-COOH (Mw: 2 kDa), OH-PEG-COOH (Mw : 5 kDa) (Shanghai Seebio Biotechnology Co., shanghai, PR China) blev dehydreret ved azeotropdestillation med toluen før brug. DTX (Shanghai Sanwei Pharma Ltd, Co, Shanghai, P R Kina) og celluloseesteren dialyse taske med en molekylær afskæring på 7000 Da (Bioscience Ltd, Co, Shanghai, P R Kina) blev anvendt som modtaget. ε-caprolacton (ε-CL, Aladdin Agent Co, Shanghai, P R Kina) blev tørret over CaH

2 ved stuetemperatur i 48 timer og destilleret under reduceret tryk. Stannooctoat blev købt fra Aladdin Agent Co (Shanghai, P R Kina). Alle organiske opløsningsmidler, der anvendes i syntesen procedurer blev købt fra National Medicine Chemical Reagent Ltd Co (Shanghai, Folkerepublikken Kina).

prostata LNCaP og PC3 cellelinjer blev opnået fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). LNCaP Celler blev dyrket ved hjælp af celle-binder kultur flasker (Corning, USA).

Metoder

Syntese af PCL-mPEG (PMS1-) og PCL-PEG-SMLP (PMS2) copolymerer.

copolymerer med en række bloklængder blev fremstillet ved ringåbnende copolymerisation af ε-CL initieret af hydroxyl af PEG. Kort beskrevet blev en forudbestemt mængde af ε-CL og stannooctoat tilsættes til en reaktionsbeholder indeholdende mPEG-OH eller OH-PEG-COOH under en tør argonatmosfære (stannooctoat /ε-CL i 1:1000 molforhold). Derefter blev reaktionsbeholderen anbringes i et oliebad og holdt ved 120 ° C i 24 timer. Så de rå copolymerer blev opløst i DCM og præcipiteret i kold diethylether for at fjerne uomsat monomer og oligomer. Derefter blev produktet filtreret og tørret til opnåelse af et hvidt bundfald.

PCL

12k-PEG

5k-COOH (1 g, 0,059 mmol) blev opløst i 5 ml vandfri tetrahydrofuran (THF) med 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] -carbodiimid-hydrochlorid (EDC) (57,4 mg, 0,3 mmol, 5 ækv) og N-hydroxysuccinimid (NHS) (27,6 mg, 0,24 mmol, 4 ækv). Derefter blev opløsningen omrørt ved stuetemperatur i over 12 timer under argonatmosfære. PCL

12k-PEG

5k-NHS-copolymer blev udfældet i iskold diethylether til opnåelse af et hvidt bundfald, som blev opsamlet og tørret til opnåelse af det ønskede produkt som et hvidt pulver (udbytte, 90%). SMLP (300 mg) blev opløst i vandfri THF (20 ml) til fremstilling 10 mg /ml (SMLP /THF) aqua. PCL-PEG-NHS (500 mg, 0,03 mmol) og diisopropylethylamin (0,7 ml) blev tilsat til 5 ml (SMLP /THF) aqua, og reaktionsopløsningen blev omrørt ved stuetemperatur i 20 timer under argon. Efter afslutning af reaktionen blev opløsningen oprenset ved dialyse i 24 timer og tørret ved lyofilisering til opnåelse af et hvidt fnugget pulver (udbytte 90%). Strukturen af ​​den endelige copolymer var præget af

1H NMR-spektroskopi.

PCL

4.8K-mPEG

2K og PCL

4.8k-PEG

2k-SMLP blev forberedt efter samme metode som tidligere anført.

Polymer karakterisering.

1 H-kernemagnetisk resonans (

1H NMR) spektre af alle prøver blev optaget på en Bruker DMX 300 eller 600 spektrometer (Billerica, MA). Kemiske skift (δ) blev givet i ppm under anvendelse af tetramethylsilan som den interne standard. Fourier Transform infrarød spektroskopi spektre blev registreret på et Bruker Tensor 27 spektrometer, og prøver blev fremstillet under anvendelse af KBr-diske (Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Spanien). Gelpermeationskromatografi (GPC) analyse blev udført på et Waters 1515 GPC instrument (Waters Corp., Milford, MA) udstyret med tre Styragel-søjler (Waters Corp; 10

5, 10

4, og 103 Å) i tandem og en 2414 differential brydningsindeksdetektor. DMF blev valgt som elueringsmiddel ved en strømningshastighed på 1,0 ml /min ved 35 ° C. Prøvernes koncentrationer var omtrent 2 mg /ml. De molekylære vægte blev kalibreret ved hjælp af polystyrenstandarder.

Udarbejdelse af polymere miceller.

DTX-loaded miceller fremstilles ved dialyse. Først blev 7 mg DTX og 50 mg copolymer fuldstændig opløst i 2 ml THF. Derefter 4 ml phosphatbufret saltvand (PBS; 10 mM, pH 7,4 eller 10 mM, pH 5,5) blev tilsat dråbevis til opløsningen under kontinuerlig omrøring i en time. Derefter blev THF fjernet ved dialyse mod PBS (10 mM, pH 7,4 eller 10 mM, pH 5,5) i løbet af 24 h under anvendelse af en celluloseester dialysepose (MWCO: 7000 Da). Den ydre medium blev udskiftet tre gange (2, 6 og 12 timer). Endelig blev blandingen ledes gennem et 0,45 um filter membran for at fjerne eventuelle fældningsmidler.

Drug-loading indhold og indkapslingseffektivitet.

For at bestemme lægemiddel-lastning indhold og indkapslingseffektivitet, 500 pi DTX-loaded micelleopløsning og 5 ml THF blev overført til en 25 ml målekolbe, sonikeret ved 180 W i 10 minutter i ultralydsbad, og derefter fortyndet med mobil fase. Koncentrationen i den resulterende opløsning blev derefter bestemt ved HPLC. Kromatografisk analyse blev udført under anvendelse af et Hitachi L-2130 pumpe og en Hitachi L-2400 UV-Vis detektor drives ved en bølgelængde på 230 nm, ved anvendelse af en Unitary C18-søjle (5 um, 150 x 4,6 mm). En mobil fase af acetonitril og vand (60/40, vol /vol) blev udvalgt. Strømmen blev sat til 1 ml /min. Svaret topareal versus DTX koncentrationen var lineær i intervallet 0,5-30 pg /ml (r

2 = 0,9999).

Det stof-loading indhold og indkapslingseffektivitet blev beregnet ud fra følgende ligninger :

Partikelstørrelsesmålinger

partikelstørrelse og distribution af miceller blev målt ved DLS bruger NICOMP 380 Submicron Particle Sizer (partikel Dimensionering Systems, Santa Barbara, Californien).. En laserstråle ved en bølgelængde på 632,8 nm blev anvendt. Spredningsvinklen blev indstillet til 90 ° under målingerne blev udført.

overflademorfologi.

Prøver til TEM observation blev fremstillet ved at anbringe en dråbe af prøveopløsningen (2 mg /ml for copolymer) på til et kobbernet belagt med carbon. Overskydende opløsning blev tørres væk med filtrerpapir. Gitteret fik lov at tørre i yderligere 15 minutter. Derefter blev prøverne undersøgt ved hjælp af en Hitachi H-600 TEM betjenes ved en accelererende spænding på 100 kV.

In Vitro

Release.

in vitro

DTX release kinetik lægemiddel fyldte micelleopløsninger eller DTX injektion (Taxotere, Sanofi-Aventis, Paris, Frankrig), der indeholder 300 mg DTX blev udført ved dialyse diffusion. Lægemiddel-loaded micelleopløsning og frit lægemiddel opløsning blev anbragt i dialyseposer (MWCO: 14000). Disse poser blev nedsænket i 15 ml PBS pH 7,4 (10 mM) eller pH 5,5 (10 mM) indeholdende 0,5% vægt /volumen Tween 80. Efterfølgende blev flaskerne placeret i en rysteinkubator ved en rystehastighed på 100 opm under 37 ° C ± 0,5 ° C. Alle medier frigivelse blev erstattet med frisk PBS ved forudbestemte intervaller (1H, 2H, 4H, 8 timer, 12 timer, 24 timer, 36 timer, 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer) for at måle lægemiddelkoncentrationen. Koncentrationen af ​​DTX blev målt ved HPLC.

Celledyrkning og cytotoksicitet.

prostata LNCaP og PC3-cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 medium og Hams F12K (Invitrogen, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, USA), hhv. Kulturerne blev opretholdt i en 95% luft fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

MTT assay blev udført for at evaluere cytotoksiciteten af ​​DTX-PMS1- (nontargeted) og DTX-PMS2 ( målrettet). LNCaP-celler blev suspenderet i dyrkningsmedium og podes ved 5000 celler /brønd i 96-brønds plader i 24 timer. Derefter dispergerede DTX-PMS1-, DTX-PMS2, og DMSO-opløsningen af ​​DTX (DSD) indeholdende fire medikamentkoncentrationer (0,1, 1, 10 og 20 ug /ml) i hver prøve blev inkuberet i LNCaP-celler. Endelig blev bestemt cellelevedygtigheden, efter 48 timer og 72 timer under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Rad imark, USA).

IC50 for hvert system blev derefter beregnet. Alle assays blev udført med fem parallelle prøver.

cellulær optagelse studier.

I denne undersøgelse coumarin 6 blev anvendt som en fluorescens-probe. Androgen-afhængige og androgen-uafhængige prostata cellelinier (LNCaP og PC3, henholdsvis) blev anvendt. Cellulær optagelse af målrettede og ikke-målrettede PM’er (200 pg /ml) der bærer coumarin 6 (100 pg /ml) (PMS1- og PMS2 henholdsvis) blev udført på LNCaP og PC3 cellelinjer til at undersøge indflydelsen af ​​SMLP konjugering på cellulær optagelse. Cellerne blev inkuberet i 96-brønds plader med miceller i 4 timer, vasket med kold PBS tre gange, og derefter fikseret med 70% ethanol i 2 timer ved -20 ° C. En kompetitiv hæmning undersøgelse blev også udført ved hjælp af gratis SMLP at kontrollere, om de PM’er blev transporteret ind i cellerne i en SMLP-medieret måde. Fri SMLP med tre forskellige koncentrationer (4 pg /ml, 20 ug /ml og 100 ug /ml) blev tilsat til mediet sammen med PMS2, inkuberet i 4 timer, vasket tre gange med kold PBS og fikseret med 70% ethanol i 2 timer ved -20 ° C. Cellekerner blev farvet med Hoechst 33342.

Cellerne blev undersøgt ved hjælp af en Content ImageXpress Micro XL Widefield Høj Screening System (ImageXpress Micro XL, Molecular Devices, USA) med MetaXpress Software. Billederne af cellerne blev bestemt af forskellen interferens kontrast kanal teknik og billederne af cumarin 6-loaded PM’er og kernerne i celler farvet af Hoechst 33342 blev registreret med følgende kanaler: blå kanal (Hoechst 33342) med excitation ved 350 nm og grønne kanal (coumarin 6) med excitation ved 485 nm. Derefter blev MetaXpress Software anvendes til at kvantificere fluorescensintensiteten per celle.

Statistik.

Alle data blev behandlet ved hjælp af Origin 8.5 software og præsenteres som gennemsnit ± SD, og ​​analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Statistiske analyser blev udført og P. 0,01 blev betragtet som den grad af statistisk signifikans

Resultater og Diskussion

Syntese og karakterisering af PCL-MPEG og PCL-PEG-COOH copolymerer

en amfifil blokcopolymer sammensat af en PCL blok som den hydrofobe del og en PEG-blok som den hydrofile del blev syntetiseret via ringåbningspolymerisation ved hjælp hydroxyl-termineret PEG som en makromolekylær initiator.

molekylvægtene af copolymererne blev beregnet ud fra

1H NMR-data ved at sammenligne topintensiteterne af methylenprotonerne af PEG med methylenprotonerne af PCL, som vist i figur 2E. Forholdene mellem den hydrofobe blok til den hydrofile blok blev bestemt ud fra de relative intensiteter af PCL proton signal ved 2,31 ppm og PEG proton signal ved 3,62 ppm. For GPC-analyse, kun én top optrådte i GPC kurve (figur 2A), hvilket betyder, at ringåbnende copolymerisation af ε-caprolacton med PEG-OH var komplet, og alle rester blev fjernet efter oprensning. Den polydispersitet af copolymer (Mw /Mn) er skitseret i tabel 1.

Syntese og karakterisering af PCL-PEG-SMLP

Surface funktionalisering af copolymer PCL- PEG-COOH med SMLP blev opnået under standard amid koblingsbetingelser i nærvær af EDC og NHS [27], [28]. Koblingseffektiviteten med amin nukleofiler kan forøges ved dannelsen af ​​en NHS-ester mellemprodukt [29].

Syntesen af ​​polymer PCL-PEG-SMLP blev opnået ved den følgende fremgangsmåde. Først blev carboxyl af PCL-PEG-COOH aktiveres med EDC og NHS at opnå mellemproduktet PCL-PEG-NHS. Derefter blev den aktive ester (NHS) i PCL-PEG-NHS omsat med aminen funktionelle gruppe i SMLP at opnå den endelige polymer PCL-PEG-SMLP (figur 3).

Polymeren af PCL

12k-PEG

5k-SMLP blev karakteriseret ved anvendelse af FT-IR, som vist i figur 2F. De vigtigste toppe vist i figur 2F ved 1671 og 1557 cm

-1 blev tilskrevet amid band I (carbonyl gruppe) og amid bånd II (aminogruppe) henholdsvis mens forsvinden af ​​disse toppe (figur 2G) indikerede dannelse af amidbindingen mellem SMLP og PCL

12k-PEG

5k-COOH. Strukturen af ​​konjugatet blev yderligere undersøgt ved

1H NMR. Figur 2C viser

1H NMR-spektret af konjugering af liganden og copolymer PCL

12k-PEG

5k-COOH. Den karakteristiske signal forekommer ved 3,60 ppm (a) fik PEG-enheden. Toppene af PCL enheder vises 4,04-4,08 ppm (b), 2,28-2,33 ppm (c), 1,61-1,70 ppm (d) og 1,35-1,43 ppm (e), som vist i figur 2C. Desuden blev de signaler ved 2,49 ppm og 3,25 til 3,49 ppm henføres til opløsningsmidlets top (DMSO) og peak vand hhv. Ifølge figur 2E, er der ingen SMLP-relaterede signaler, vist i

1H NMR-spektrum af ukonjugeret PCL

12k-PEG

5k-COOH, hvilket indikerer, at der ikke er interferens med SMLP signaler vist i figur 2C .Comparing toppene af PCL-PEG-SMLP i figur 2C og toppene af ligand SMLP i figur 2B, de kemiske skift var identiske. Kæmning resultaterne af FT-IR og

1H NMR viste, at liganden SMLP var blevet konjugeret til PCL

12K-PEG

5K-COOH. Renheden af ​​ligand konjugeret polymerer, som er kritisk relateret til

in vitro

udførelsen af ​​micellerne, blev verificeret ved gelpermeationskromatografi. Som vist i figur 2D, blev der ikke spor af fri SMLP observeret i kromatogrammer af enten PCL

12K-PEG

5K-SMLP eller PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP, hvilket indikerer, at overdreven fri ligand blev fuldstændig fjernet.

forberedelse og karakterisering af miceller

i dette arbejde blev dialyse ansat til at forberede docetaxel-miceller, der fører til en vellykket forberedelse af nontargeted [PCL

12K-mPEG

5k (PMS1-), PCL

4.8k-mPEG

2K (PMs3)] og målrettet [PCL

12K-PEG

5K-SMLP (PMS2), PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP (pMS4)] miceller. Desuden nanopartikler med diametre større end 100 nm er mere tilbøjelige til at blive elimineret af det retikuloendoteliale system [30], mens deres kolleger med diametre mindre end 100 nm var mere tilbøjelige til at akkumulere i tumorvæv [31], [32].

De gennemsnitlige diametre af miceller (PMS1-, PMS2, PMs3 og pMS4) udarbejdet af dialyse var 51,4 ± 1,3 nm, 50,5 ± 1,1 nm, 37,1 ± 0,5 nm og 38,6 ± 0,7 nm. Polydispersitetsindekset (PDI) værdier af de fire miceller er vist i tabel 1. De DLS grafer af PMS1- og PMS2 er vist i figur 4 (A, B). Morfologi og lav PDI af miceller blev yderligere bekræftet af TEM billeddannelse. TEM fotografi (Figur 4, A

1 og B2), i PMS1- og PMS2 var i overensstemmelse med resultaterne af DLS. De mindre diametre af PM’er opnået fra TEM tests sammenlignet med DLS kunne tilskrives den krympning af PEG shell induceret af vandfordampning før TEM måling [33]. Som følge heraf er diameteren afgivet DLS var større end den af ​​TEM grund af hydratisering af PEG skallen.

TEM grafer af DTX-PMS1- (A

1) og DTX-PMS2 (B

2).

for at vurdere den maksimale lægemiddel-loading indhold og narkotika-lastning effektiviteten af ​​de fire miceller blev en simpel kortsigtet stabilitet undersøgelse af DTX-loaded indhold udført, og resultaterne er vist i figur 5. først blev overskydende DTX tilsættes under fremstillingen af ​​de fire DTX-PMS. De over-loaded PM’er blev holdt ved stuetemperatur og samples ved forudbestemt tid. Derefter blev indholdet af prøverne DTX-loading målt ved HPLC under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet. Profilen viser, at det oprindelige indhold af de fire PM DTX-loading var 10,4%, 10,8%, 9,6% og 9,8%, henholdsvis. Værdierne af DTX-loading indhold faldt gradvist og forblev konstant efter 12 timer for PCL

12k-PEG

5k og 24 timer for PCL

4.8k-PEG

2k (figur 5, kredsede i kvadrater ). Reduktionen i lægemiddel-loading indhold kan skyldes forekomsten af ​​faseadskillelse mellem DTX og PCL. Det stof-loading indhold efter en 7 dages testperiode kunne betragtes som kapaciteten af ​​PCL til lastning DTX. Også kunne højere kapacitet af PMS1- og PMS2 sammenlignet med PMs3 og pMS4 tilskrives de længere PCL kæder af PMS1- og PMS2. Med det samme forhold af den hydrofile blok længde til den hydrofobe blok længde, er den endelige lægemiddel-loading indhold og indkapslingseffektivitet af de fire PMS vist i tabel 1. Disse resultater viste en god stabilitet på kort sigt af DTX-loading indhold , lægemiddel-lastning indhold og effektivitet, bekræfter, at miceller baseret på PCL

12K-PEG

5K-SMLP og PCL

12K-mPEG

5k copolymerer var optimale formuleringer.

(n = 3).

In vitro

frigive

in vitro

frigivelse adfærd fire DTX-PM’er blev undersøgt ved dialysen diffusion metoden [34]. Opførslen af ​​Taxotere frigivelse blev anvendt som en kontrol, og profilerne DTX frigivelse af de fire PM’er ved pH 7,4 (simuleret miljø af normale væv) og pH 5,5 (simuleret miljø af tumorvæv) er vist i figur 6. Næsten 90% af DTX blev løsladt fra Taxotere inden 24 timer. I modsætning Taxotere, alle miceller udviste en hurtig frigivelse af DTX i den indledende fase (første 24 timer) og en langvarig frigivelse i den følgende 72 timer. Desuden er de tilsvarende profiler af PMS1- og PMS2 release indikerede, at ligand konjugation ikke påvirkede mønsteret udgivelse.

For de fire PMS, fordi poly ester struktur PCL er følsom over for syre, frigivelse af DTX fra miceller var langsommere ved pH 7,4 end ved pH 5,5. Denne virkning fremmes frigivelsen af ​​DTX i tumorvæv og i endosomer, der er mere sure end blod [35]. Mængden af ​​ikke-frigivet DTX var 20-25%. Denne andel af lægemidler eksisterede i micellære kerner; fanget i udfældninger genereret af varme og tween 80 induceret nedbrydning micellar og adsorberet på dialyse taske og glasvarer [36].

Cell cytotoksicitet

PSMA er en valideret molekylær markør overudtrykt af LNCaP celler [37] , [38]. Cytotoksiciteten forstærkende virkning af PSMA ligand (SMLP) konjugeret DTX-PM’er blev vurderet ved in vitro cytotoksiske forsøg under anvendelse LNCaP og PC3-celler, hhv. Den biokompatibilitet PCL

12K-mPEG

5K og PCL

12K-PEG

5K-SMLP blev bekræftet ved at inkubere stoffrie miceller sammensat af disse to polymerer i forskellige koncentrationer med LNCaP celler og PC3 celler , henholdsvis. Cellelevedygtigheden blev ikke påvirket over en 72 h inkubationstid som bekræftede god biokompatibilitet af disse polymerer (figur 7). Resultaterne viste også, at cellerne ikke kan blive forstyrret i overværelse af ligander.

(n = 5).

I denne undersøgelse DMSO-opløsningen af ​​DTX (DSD) var anvendes i stedet for Taxotere som en positiv kontrol, fordi Tween 80 i Taxotere er cytotoksisk, og dette kan påvirke resultatet [39]. Ifølge resultaterne af MTT-assays (figur 8), efter 48 timers inkubation, cytotoksicitet PMS1- var næsten den samme som DSD. Viste imidlertid, PMS2 en signifikant lavere LNCaP cellelevedygtighed ved alle koncentrationer. I PC3-cellelinjer blev imidlertid ingen signifikant forskel observeret i cellelevedygtighed blandt DSD, PMS1- og PMS2 (figur 8). Dette indikerede, at ligand konjugering er fordelagtig til at lette den cellulære optagelse af miceller: som PMS1- og PMS2 viste lignende frigivelsesprofiler, kunne den formindskede cellelevedygtighed tilskrives forøget intracellulær lægemiddelakkumulering via receptor-medieret endocytose. Efter 72 h inkubation, både PMS1- og PMS2 viste signifikante forskelle fra DSD i LNCaP-cellelinje, og PMS2 viste den største cytotoksicitet. Endvidere blev signifikante lavere celle levedygtighed observeret i PC3 cellelinjer behandlet med enten PMS1- eller PMS2 end DSD ved lægemiddelkoncentration på 20 pg /ml, hvilket betyder, at utilstrækkelig cellulære optagelse af miceller kunne kompenseres ved øget inkubationstid og koncentration narkotika. Men der var ingen signifikante forskelle mellem PMS1- og DSD efter 48 timer inkubation i LNCaP celler. Dette fænomen bekræftede den vedvarende adfærd DTX medikamentfrigivelse fra PMS1-

in vitro

(*) signifikant forskellig fra DSD.; (#) Signifikant forskellig fra PMS1-; (N = 5). Bemærk: * P 0,01,

# P 0,01

Cellen levedygtighed PMS2 på 20 pg /ml var næsten halvdelen af ​​PMS1- for LNCaP celler efter enten 48 h eller 72 timer. inkubation. Disse data viste, at DTX-PMS2 var mindre effektiv til at øge cytotoksicitet i PC3 celler, mens det selektivt hæmmer spredning af LNCaP celler. I de andre ord, tyder disse resultater den høje affinitet af SMLP for PSMA kunne øge cytotoksiciteten i LNCaP-celler. Efter 72 h inkubation på LNCaP-celler med mængden af ​​DTX givet ved en fast koncentration på 20 ug /ml, cellevækstinhiberingen på DSD, PMS1- og PMS2 var 58,4%, 67,7% og 83,9%, henholdsvis.

IC50 for hver prøve er vist i tabel 2. for LNCaP-celler, IC50 for DTX-PMS2 var meget lavere end for DTX-PMS1- og DSD efter 48 timer eller 72 timer inkubation. Imidlertid IC50 for DTX-PMS1- var næsten den samme som DSD efter 48 timers inkubation, men var 5 gange lavere efter 72 timers inkubation med LNCaP-celler, dette bekræftes yderligere kompensationsvalsen virkning i cytotoksicitet af miceller ved længere tids inkubationstid. Selvom DTX-PMS2 (målrettet) udstillet den højeste celle-drab effektivitet, DTX-PMS1- vises også en virkning på LNCaP celler. Da de to miceller besad lignende profiler release, blev forskellene i cytotoksicitet relateret til deres anden celle-entry evne, som blev afspejlet af forskelle i tilhørsforhold til PSMA.

Cellular Optagelse

at undersøge virkningen af ​​PSMA målretningsligand på den cellulære optagelse af PMS, blev fluorescensmikroskopi udført på LNCaP-celler med såvel målrettede (PMS2) og ikke-målrettede (PMS1-) miceller mærket med coumarin-6. Efter 4 timers inkubation ved 37 ° C blev HCSS billeder af LNCaP-celler udtaget og vist i figur 9A. Fluorescensintensiteten af ​​celler inkuberet med målrettede miceller (PMS2) var signifikant højere end den af ​​dens ikke-målrettet modpart (PMS1-), og den kvantificerede fluorescensintensitet blev anslået til at være 5-fold (figur 9C). Evnen til SMLP konjugering i styrkelsen cellulære optagelse kunne afspejles i cellelevedygtighedsassays. For yderligere at verificere rolle SMLP i endocytose, blev en ligand konkurrerende eksperiment udført. Som vist i figur 8B, tilsætning af frie ligander ved forskellige koncentrationer nedtrappes optagelsen af ​​PMS2, og mængden af ​​endocytoserede miceller nået et niveau svarende til dens ikke-målrettede modpart ved høj koncentration af SMLP (100 ug /ml, figur 10B) , hvilket indikerede tilstedeværelsen af ​​fri SMLP i mediet hæmmede endocytose af PMS2 ved at binde til overfladen PSMA i et konkurrencepræget måde mod micel-konjugeret SMLP. For yderligere at verificere styrkelse af ligand i mediere endocytose, blev cellulære optagelse studier af begge præparater med /uden SMLP ligand udført i PC-3-cellelinje, som ikke udtrykker PSMA protein [40]. Som vist i figur 9 (B og C), targeted- og ikke-målrettede miceller viste lignende intracellulær fluorescerende intensitet, hvilket betyder konjugation af SMLP er en nøglefaktor i at fremme cellulære optagelse af tilberedte miceller i PSMA udtrykkende celler. De ovennævnte resultater viste også, at PMS2 blev endocytose i LNCaP-celler via flere ruter: en del af micellerne blev taget op af LNCaP-celler i en SMLP-medieret måde, mens der var miceller ind celler gennem andre veje, herunder caveolin endocytose eller clathrin- og caveolin-uafhængig endocytose [41] som den cellulære optagelse af miceller var ikke helt hæmmet af SMLP tilføjelse. Disse resultater forklarede højere cytotoksicitet af de målrettede miceller (PMS2) i MTT-analyser og angivet gavn for PM’er med en målrettet ligand i prostatakræft terapi.

Cellen kerner blev farvet med Hoechst 33342 med den blå kanal, de coumarin 6-loaded PM’er er den grønne kanal. Den cellulære optagelse blev visualiseret ved overlejring af billeder, der vises af kerner kanal og pms-kanal. Fluorescensintensiteten /celle graf over 100 ug /ml coumarin 6-loaded PMS1- og PMS2 med en koncentration på 200 pg /ml efter 4 timers inkubering med LNCaP-celler og PC3-celler (C).

konklusioner

i denne undersøgelse en ny selv-samling af DTX-PEG-PCL-SMLP miceller rettet LNCaP celler blev udviklet. Med den samme hydrofile /hydrofobe blok længdeforhold, en række polymere miceller med diametre under 60 nm blev fremstillet ved dialyse. Stabile ikke-målrettede PM’er og målrettede PM’er med konstant lægemiddel-loading indhold blev opnået ved kortvarige stabilitet analyser. Pålidelig medikamentbelastning og vedvarende frigive adfærd blev opnået på grund af fjernelse af over-loaded narkotika.