PLoS ONE: Effektiv behandlingsmetode til hoved- og halscancer, som en Engineered minibody Målretning EGFR receptor

Abstrakt

Cetuximab, en kimære monoklonalt antistof udviklet til at målrette epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), er blevet intensivt anvendt til behandling af kræftpatienter med metastatisk kolorektal cancer og hoved- og halskræft. Intakt immunoglobulin G (IgG) antistof som cetuximab har imidlertid nogle begrænsninger, såsom høje produktionsomkostninger og lav dækningsgrad fra vaskulatur til fast tumormasse på grund af sin størrelse. I forsøg på at overvinde disse begrænsninger, vi manipuleret cetuximab at skabe enkelt kæde variable fragmenter (scFv-CH3, minibody), der blev udtrykt i bakteriel system. Blandt tre manipulerede minibodies, fandt vi, at MI061 minibody, som er sammensat af den variable tunge (V

H) og lette (V

L) region forbundet ved en 18-rest peptidlinker, viser højere opløselighed og bedre ekstraktion egenskaber fra bakterielysat. Desuden har vi valideret at oprenset MI061 signifikant interfererer ligandbinding til EGFR og blokerer EGFR s phosphorylering. Ved anvendelse af et protein microarray består af 16,368 unikke humane proteiner, der dækker omkring 2.400 plasma membranassocierede proteiner, såsom receptorer og kanaler, vi også vist, at MI061 kun genkender EGFR men ikke andre proteiner i forhold til cetuximab. Disse resultater viste, at manipuleret MI061 bevarer både bindende specificitet og affinitet af cetuximab til EGFR. Selv om det havde relativt korte halveringstid i serum, blev det vist at være yderst signifikant antitumorvirkning ved inhibering ERK pathway i A431 xenograft model. Tilsammen vores nuværende undersøgelse giver overbevisende dokumentation for, at manipuleret minibody er mere effektiv og lovende middel til

in vivo

målretning af solide tumorer

Henvisning:. Kim YP, Park D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et al. (2014) Effektiv behandlingsmetode til hoved- og halscancer, som en Engineered minibody Målretning EGFR-receptoren. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10,1371 /journal.pone.0113442

Redaktør: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: Juli 9, 2014 Accepteret: 23. oktober 2014 Udgivet: December 1, 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT Future Planning (nr 2011 til 0.030.043 2012-R1A1A1013558). Dette arbejde blev også delvist understøttet af en bevilling fra National R molekylstørrelse markering, 1; rå ekstrakt, 2; opløselige proteiner, 3; pellet, 4; strømme gennem, 5; vask med 50 mM imidazol, 6; eluering med 400 mM imidazol, WB; western blot.

Aktivitet og specificitet manipuleret minibodies

Baseret på opsving udbyttet af hver minibody fra bakterielysat, både MI053 og MI061 blev udvalgt til yderligere undersøgelse. For at måle deres aktivitet afhængig af domæne orientering af variable regioner, vi oprindeligt vurderet deres bindende aktivitet til EGFR. A431-celler, der udtrykker højt niveau af EGFR blev inkuberet med antistoffer, og den efterfølgende ændring i fluorescenssignal blev målt med en laserbaseret flowcytometrianalyse. Følgelig alle behandlede antistoffer fremkaldte et skift i fluorescenssignalet større end den for den ubehandlede kontrol (Fig 2A). Blandt dem viste cetuximab den højeste bindingsaktivitet til EGFR. Især vi bekræftet, at MI061 og MI053 også bevaret høj affinitet og var i stand til stærk binding til EGFR. Affiniteten mellem MI061and EGFR var stærkere end affiniteten mellem MI053 og EGFR. Disse data viste, at domænet rækkefølge af variable kæder er forbundet med affinitet minibody. En alternativ fremgangsmåde til opnåelse af specificitet blev kompetitivt assay udført under anvendelse af et FITC-mærket EGF-ligand med koncept at interferens for interaktion mellem EGF og EGFR kunne inhibere EGFR aktivering og dens nedstrøms signalvej. Som et resultat blev cetuximab helt konkurrerede med EGF, hvorimod behandling af MI061 delvist inhiberet binding med EGFR (fig 2B). For at bekræfte inhiberende evne af MI061, analyserede vi relative phosphorylering på EGFR (fig 2C). Phosphoryleringshastighed af EGFR induceret af EGF blev analyseret i A431-celler i nærvær af enten cetuximab Fab-fragment (CT Fab), EGFR bindende regioner af cetuximab eller MI061. Behandlingen af ​​EGF med CT Fab undertrykt relative phosphorylering til ca. 50%. Tilsvarende behandling af EGF med MI061 viste også samme virkning i sammenligning med CT Fab. Selvom deres bindingsaffinitet og specificitet relativt lavere sammenlignet med cetuximab, MI061 kunne kraftigt genkende EGFR og undertrykke EGFR s phosphorylering i cellen systemet. For at validere antigenbindingsspecificitet af MI061, anvendte vi det humane protein microarray chip, som indeholder 16,368 unikke GST-mærket fuld længde humane proteiner (Fig 3A). Proteinchippen behandledes parallelt med enten MI061 eller cetuximab i lige molforhold i 1 time ved stuetemperatur. Proteinerne binder med antistof blev påvist ved hjælp af Alexa-Fluor konjugeret sekundært antistof. Chippen blev derefter scannet under anvendelse af en GenePix 4100A scanner. At normalisere Alexa-Fluor-signalet blev proteinet chip derefter probet med et anti-GST-antistof, efterfulgt af scanning. I hvert protein microarray chip, både MI061 og cetuximab udviste tilsvarende bindingsmønster i to eksemplarer med samme intensitet, (fig 3B). Også i en høj powered visning, de kun bundet EGFR protein bortset kontrol proteiner, såsom GST (fig 3B, nedre panel).

(A) EGFR bindingsassay. Hvert antistof blev inkuberet med EGFR-overudtrykkes A431cells og derefter bindingsaffinitet til EGFR blev analyseret ved FL1-H intensitet ved anvendelse af flowcytometri (FACS) (B) EGFR konkurrence-assay. FITC-mærket EGF blev inkuberet med A431-celler og dets bindingsaktivitet til EGFR blev overvåget ved FACS. Til konkurrencen assayet blev EGF inkuberet celler sammen med enten cetuximab (venstre panel) eller MI061 (højre panel). (C) EGFR phosphorylering assay. Den relative phosphorylering på EGFR induceret af hvert antistof blev bedømt ved ELISA under anvendelse af et anti-EGFR phospho-antistof. EGF blev anvendt som en kontrol for phosphorylering af EGFR som angivet. Kvantificerede data er udtrykt som middelværdi ± s. e. m.

* P 0,05. n.s, ikke signifikant.

(A) Skematisk illustration af protein microarray proces. (B) protein chips blev inkuberet med enten MI061 eller cetuximab, og antigen-antistof-interaktioner blev påvist ved hjælp af Alexa-Fluor konjugeret sekundært antistof. Efter vask blev hver chip scannet af GenePix Scanner ved 532 nm (Cy3) og 635 nm (Cy5). Hver værdi af probesignaler blev opnået ved anvendelse GenePix Pro 6.0 software. Rødt signal indikerer antigenbindende intensitet både MI061 og cetuximab. Alle GST-fusionsproteiner blev påvist ved anti-GST-antistof og visualiseret ved grøn fluorescens som angivet. Hvide rektangler angiver forstørrelsen område for nederste panel.

antitumorvirkningen af ​​manipuleret minibody

For at vurdere og karakterisere plasma farmakokinetik (PK) af MI061 blev farmakokinetiske parametre undersøgt i xenograft dyr. Efter intraperitoneral (ip) injektion af MI061 med 0,3 mg /inj, C (max), T (max), areal under kurven (AUC) og t

1/2 blev målt som 14,4 mg /l, 1 time , 24,8 mg • h /L og 4,3 timer, henholdsvis (figur 4A). Ifølge PK data for MI061 blev antitumorvirkningen af ​​MI061 overvåges i A431 xenotransplantater model. Hver af musene blev behandlet i 22 dage fra 13

th post-transplantation dag gennem i.p. injektion med cetuximab, CT Fab af hver 3 dage, eller MI061 ved daglig base på PK-aktivitet. Injektion af antistoffer påvirkede ikke vægtøgning hos A431 tumor xenotransplanterede mus (Fig S1c). Tumorstørrelsen blev målt med passere ved overfladen tilgang. Tumor størrelse i bilen udviste en lineær stigning i hele perioden 22-dages og nåede størrelse omkring 1200 mm

3 (fig 4B). Injektionen af ​​cetuximab eller MI061 undertrykte tumorvækst til 300 mm

3. Selv MI061 blev injiceret flere gange end andre antistoffer, det viste signifikant antitumorvirkning som cetuximab. Hver tumormassen hævet fra xenograft blev ekstraheret fra musene til at måle relativ tumorvolumen (fig 4C). Interessant injektion af MI061 i xenotransplanterede mus bemærkelsesværdigt undertrykt tumorvolumenet til 25% sammenlignet med vehikel-behandlede gruppe (figur 4D). Viste således MI061 lignende anti-tumor effekt sammenlignet med cetuximab-treat gruppe

in vivo

. Samlet støttet disse data, at oprenset MI061 fra bakterielt system kan anvendes til klinisk anvendelse som et anti-tumormiddel.

(A) Farmakokinetik af MI061 minibody. Blodprøver til farmakokinetik MI061 blev opsamlet ved 1, 3, 6, 24 og 48 timer efter den indledende intraperitoneal injektion (i.p., 0,3 mg /mus) og deres koncentration blev estimeret ved anvendelse af ikke-compartment metoder. (B) Tidsforløb af ændringen i tumorstørrelse. Athymiske nøgne mus blev behandlet med vehikel eller med cetuximab eller med cetuximab Fab hver 3 dage, eller med minibody dagligt i 10 dage efter i.p. injektion (0,25 mg /mus). Behandlingen blev startet, når tumorstørrelsen nåede 100 mm

3 efter xenotransplantat. Tumorstørrelsen blev målt med passere under eksperimentvarianter dage. (C) Repræsentative resultater af A431 tumormasserne. (D). Relativ tumorvolumen. Størrelsen af ​​A431 tumormasser fjernet fra athymiske mus behandlet hvert antistof blev målt med passere og blev angivet som relative volumen sammenlignet med cetuximab behandlede gruppe. Kvantificerede data er udtrykt som middelværdi ± s. e. m.

* P 0,05

Effekten af ​​manipuleret minibody på EGFR nedstrøms signal pathway

De ekspressionsniveauerne af EGFR og fosforyleret-EGFR (p-EGFR) blev analyseret fra A431 tumorsnit som vist i fig 5A. I sammenligning med bærer-gruppe blev farvningsintensiteter af både EGFR og p-EGFR bemærkelsesværdigt reduceret i alle grupper behandlet antistof. For at opnå den MI061 effekt på EGFR nedstrøms signal vej, blev hver tumor masser lyseret. De blev analyseret for aktivering status af downstream signalmolekyler efterfulgt af EGFR aktivering. Svarende til immunohistokemi data mod EGFR og p-EGFR, fandt vi, at ekspressionsniveauet af EGFR blev signifikant reduceret i gruppen behandlet enten CT Fab eller MI061 (Fig 5B). Desuden blev niveauerne af både p-EGFR og p-ERK kun fuldstændig undertrykt i MI061-behandlede gruppe, men ikke i den anden gruppe (figur 5B). I modsætning hertil CT Fab kun inhiberede phosphorylering af AKT (Fig 5B). Disse data antydede, at CT-Fab og MI061 kan være involveret i forskellige nedstrøms signalvej, trods en tilsvarende inhibitorisk virkning på phosphorylering af EGFR

in vivo

. Tilsammen disse resultater viste, at højere anti-tumor effektivitet MI061 sammenlignet med cetuximab i A431 xenotransplanteret model, understøtter relevansen af ​​yderligere undersøgelser for brug af MI061 at levere anticancermiddel

in vivo

.

(A) Phosphorylering af EGFR. Det phosphorylerede EGFR frosset sektion af A431 tumorvæv blev analyseret ved immunohistokemi farvning anvendelse af p-EGFR (Tyr 845) antistof. Scale bar = 200 um (B) EFGR nedstrøms signalvej i tumor lysat blev analyseret ved western blot med hvert antistof som angivet. β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

Diskussion

Tumor-målrettede terapier hjælp intakt hele IgG er blevet intensivt undersøgt for kræftpatienter i talrige undersøgelser og førte til en bølge af FDA-godkendte antistoffer [6] – [10]. Derfor er opnået bemærkelsesværdige resultater i cancerterapi, men der er stadig nogle begrænsninger i anvendelse af helt IgG til behandling hos cancerpatienter. Disse omfatter ekstremt høje produktionsomkostninger og farmakokinetik versus væv penetration [17], [18]. For at overvinde disse ulemper har forskere forsøgt at reducere størrelsen af ​​antistof til effektiv produktion i bakterielt system, og forbedre dækningsgraden af ​​antistof til effektiv terapi [16], [19]. I nærværende undersøgelse har vi også skabt tre minibodies afledt af Cetuximab og undersøgt egenskaber og anti-tumor effekt af dem

in vitro

og

in vivo

.

Mange forsøg har været forpligtet sig til at danne antistoffer til human terapeutisk anvendelse i pattedyrceller. Imidlertid er transficerede pattedyrceller foretrækkes ikke som et ekspressionssystem som følge af lave ekspressionsniveauer, langsom vækst og dyre næringsmedier [20]. Disse problemer kan løses ved hjælp af en

E. coli

ekspressionssystem til at producere store mængder af rekombinant protein. Selv om der er nogle begrænsninger såsom intracellulær akkumulering, potentialet for produktet nedbrydning og produktion af endotoksin, det har generelt været anvendt til rekombinant proteinproduktion grund af sin evne til at vokse hurtigt, med høj tæthed på billige substrater og relativt enkel håndtering [20] . Desuden har de forskellige rekombinante teknikker aktiveret produktion af antistoffragmenter med forskellige størrelser [11], [16], [19], [21]. Minibody (scFv-C

H3), en af ​​dem, kan udtrykkes i bakterielle system, og deres lille størrelse og lave molekylvægte tillader hurtig og nem vævsgennemtrængning [22]. Trods forbedrede teknologi og tung forskning, men der er stadig begrænsninger vedrørende produktivitet og termisk stabilitet minibody [22]. Generelt scFv’er viser lav termisk stabilitet og har tendens til at denaturere eller aggregere under betingelserne for kliniske anvendelser på grund af den relativt svage V

H-V

L interaktion [22]. At erobring lav stabilitet, nogle forskere fokuseret på længden af ​​linker, forlængelse af rester i linker lidt øget stabilitet af scFv’er [23]. Vi testede også termiske stabilitet af både MI045 og MI053 og fandt, at MI053, der har 18 rester som en linker, er mere stabil i stedet MI045 løbet af 48 timer (fig. S1D og Materialer og fremgangsmåder S1).