PLoS ONE: Hypoxi Aktiverer K-Ras protooncogen at stimulere angiogenese og hæmme apoptose i Colon Cancer Cells

Abstrakt

KRAS

proto-onkogen spiller en central rolle i udviklingen af ​​mange humane tumorer og er almindeligt aktiveres ved somatisk mutation eller signalering gennem specifikke vækstfaktorreceptorer. Men interaktionen mellem mikromiljø og K-ras aktivitet ikke er blevet defineret,. Hypoxi uvægerligt udvikler sig som tumorer vokser fra deres tilførsel af ilt. En række veltilrettelagt cellulære tilpasninger forekommer at stimulere angiogenese og forbedre overlevelse af tumoren i hypoxiske betingelser. Vores tidligere undersøgelser viste, at mutant

KRAS

alleler kan interagere med hypoxi at inducere vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) i coloncancer. Vi har forsøgt at bestemme, om tilsvarende hypoxiske responser er også til stede i tumorer uden en

KRAS

mutation. Hypoxi konsekvent øgede niveauer af aktiverede, GTP-bundne K-ras i colon cancercellelinier med en vildtype

KRAS

gen, og dette afhang af aktiveringen af ​​c-Src. Inhibering af c-Src af PP2 behandling eller siRNA knockdown blokeret hypoxiske aktivering af K-ras. Denne aktivering af K-ras ikke afhænge EGFR og resulterede i phosphorylering af Akt og induktion af VEGF-ekspression. Desuden aktivering af K-ras signifikant blokeret apoptose i hypoxiske betingelser. Disse undersøgelser afslører en unik adaptive mekanisme i hypoxi, der aktiverer K-ras signalering i fravær af en mutant

KRAS

onkogen

Henvisning:. Zeng M, Kikuchi H, Pino MS, Chung DC ( 2010) Hypoxi Aktiverer K-Ras protooncogen at stimulere angiogenese og hæmme apoptose i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 5 (6): e10966. doi: 10,1371 /journal.pone.0010966

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: April 27, 2010; Accepteret: 12. maj 2010; Udgivet: 4 juni 2010

Copyright: © 2010 Zeng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health tilskud CA92594; Kate J. og Dorothy L. Clapp Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​vævshypoxi karakteristisk observeret som maligne tumorer hurtigt stige i størrelse. Sådanne hypoksiske betingelser udøver selektivt tryk på cancerceller, og evnen hos tumorceller at overleve i en hypoxisk mikromiljø er blevet forbundet med en dårlig prognose og modstand mod behandling [1]. En af de mest kritiske og bedst karakteriserede reaktioner på hypoksi er induktionen af ​​vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), og hypoxi-inducerbar faktor-1 (HIF-1) er et veletableret mediator af denne proces. Imidlertid har tidligere undersøgelser vist, at HIF-uafhængige mekanismer også kan inducere VEGF i hypoxi, og onkogene K-ras spiller en central rolle i denne proces [2], [3], [4].

K- ras er en lille GTPase som cykler mellem inaktive Guanosindifosfat (BNP) -bundet og aktiv guanosintriphosphat (GTP) -bundet konformationer (Ras-BNP og Ras-GTP, henholdsvis) [5]. Det tjener som et signal switch molekyle, par receptor-aktivering af specifikke vækstfaktorer med nedstrøms effektor veje herunder Ras-MEK-ERK og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt kaskader, der styrer flere cellulære reaktioner. Onkogene mutationer i

KRAS

forringe evnen af ​​K-Ras at hydrolysere bundet GTP i en vækstfaktor-uafhængig måde, og konstitutive signalering gennem disse effektor veje resultater. Tumormikromiljøet kan have en stor indflydelse på cellulær adfærd, og hypoxi er blevet vist at interagere med mange onkogene signalveje. Især hypoksisk aktivering af PI3K-Akt, MEK-ERK, NF-KB, og hypoxi-inducerbar faktor (HIF) signalveje er blevet beskrevet [6], [7]. Selvom K-ras er et centralt regulator i alle disse veje er det uvist, om K-ras selv er specifikt aktiveret ved hypoxi. Tidligere undersøgelser har påvist en stærk synergistisk vekselvirkning mellem hypoksi og mutant K-ras i reguleringen af ​​flere målgener, herunder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), IL-8, og osteopontin [2], [8], [9]. Men færre end 50% af kolon tumorer havnen

KRAS

mutationer, og forholdet mellem Ras signalering og hypoxi i tumorer med vildtype

KRAS

forbliver udefineret.

Vi søgte at fastlægge den rolle, K-ras i hypoxisk mikro-miljø i tyktarmskræft, en tumor type, der ofte huser

KRAS

mutationer. Vildtype-K-ras var stærkt aktiveret ved hypoxi, og c-Src var nødvendig for denne hypoxisk aktivering af K-ras. Dette resulterede i phosphorylering af Akt og induktion af VEGF-ekspression. Desuden hypoksisk aktivering af vildtype K-ras blokeret apoptose. Kollektivt, disse fund fremhæve en ny mekanisme for hypoxiske aktivering af onkogene overlevelse veje i mangel af et onkogen mutation.

Resultater

Hypoksisk aktivering af K-Ras i tyktarmscancerceller

for at afgøre, om hypoxi aktiverer Ras, vi målte GTP-bundet Ras i normoxisk og hypoxiske betingelser i et panel af tyktarmskræft cellelinjer. Niveauer af GTP-bundne Ras var knap påviselige i Caco2, HT29, Colo320DM og Colo205 celler i normoksiske betingelser (Fig. 1A). Alle disse linjer har en vildtype

KRAS

gen. Men når disse celler blev inkuberet i hypoxiske betingelser (1% O

2), var der en dramatisk stigning (fra 3 til 6.8 gange) i niveauerne af aktiverede Ras (fig. 1A). I modsætning hertil basale aktiviteter Ras i DLD1, HCT116 (både heterozygote for

KRAS

D13

mutation), og SW480 (homozygote for

KRAS

V12

mutation) celler i normoxi var høj, og der var ingen efterfølgende stigning i hypoxi (fig. 1A, højre panel). SW480-celler havde de stærkeste niveauer af Ras-aktivering i normoxiske betingelser. Hypoxi er således en stærk aktivator af Ras i tyktarmen kræftceller, men denne induktion blev kun observeret i disse celler med en vildtype

KRAS

gen.

Niveauerne af GTP-bundet Ras ( A) og GTP-bundne K-ras (B) blev evalueret i vildtype (venstre felt) og mutant (højre panel)

KRAS

cellelinjer dyrkes enten i normoxisk (N) eller hypoksiske (H) betingelser i 4 timer. To milligram celleekstrakter blev anvendt til en Ras-aktivering assay, efterfulgt af Western blotting med de angivne antistoffer. Densitometri-værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. C, Caco2-celler blev dyrket i DMEM med pH indstillet til 7,5 eller 6,5 i 4 timer. Cellelysater blev anvendt til en Ras-aktivering assay efterfulgt af Western blotting med et Ras-GTP-specifikt antistof. Densitometri værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1.

For at kontrollere, at K-ras isoform blev aktiveret ved hypoxi, en K-ras specifikt antistof blev udnyttet. Som illustreret i figur 1B, blev niveauer af GTP bundet-K-ras induceret af hypoxi i kolon kræftceller med vildtype

KRAS

(Caco2, HT29), mens der ikke var nogen ændringer i cellelinjer med en mutant

KRAS

onkogen (DLD1, HCT116, SW480). En rolle for N-ras i reguleringen af ​​apoptose er blevet foreslået i tyktarmskræft, men en N-ras specifikt antistof ikke har kunnet påvise GTP-bundet-N-ras i Caco2, DLD1, og HCT116 cellelinjer i enten normoksiske eller hypoxiske betingelser (fig. S1) [10].

Tumor hypoxia er ofte ledsaget af et skifte til anaerob glykolyse og en lavere pH, så vi undersøgt, om den hypoxiske regulering af Ras aktivitet blev medieret gennem ændringer i pH. Inkubation af Caco2 celler i sure betingelser (pH 6,5) i 4 timer forøgede ikke aktiviteten af ​​Ras, hvilket antyder, at ændringer i pH ikke regulere niveauerne af GTP-bundet Ras (fig. 1C).

opregulering af Ras aktivitet ved hypoxi kræver c-Src

c-Src ligger opstrøms for K-ras, og vi næste forsøgt at undersøge, om c-Src også aktiveres ved hypoxi. En tidsafhængig aktivering af c-Src, som målt ved phosphorylering på Tyr

416, blev observeret i begge Caco2 og HT29-celler efter inkubering i hypoxiske betingelser (fig. 2A). For at bestemme om c-Src medvirkede til aktivering af Ras af hypoxi, vi forbehandlet Caco2-celler med PP2, en potent og selektiv Src tyrosinkinaseinhibitoren. En reduktion i hypoxisk induktion af Ras 50% blev påvist i Caco2 celler, mens der ikke var nogen effekt på niveauerne af total Ras (fig. 2B, venstre panel). Denne virkning var dosisafhængig, med en maksimal virkning set ved 20 uM (data ikke vist).

A blev Caco2 og HT29-celler inkuberet i hypoxiske betingelser i de angivne tidsrum, og Western blotting for phospho-Src

416 og total Src blev udført. β-actin bekræftede lige belastning. Densitometri værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. B blev Caco2 celler forbehandlet med Src inhibitor PP2 (20 uM) eller DMSO i 1 time (venstre panel) eller forbigående transficeret med c-Src specifikke siRNA-konstruktioner eller en ikke målretning kontrol (højre panel), før inkubering i hypoxiske eller normoksiske betingelser i 4 timer. Aktiveret Ras blev trukket ned og SDS-PAGE blev udført under anvendelse af en Ras-GTP-specifikt antistof. Total Ras bekræftede lige belastning. Densitometri værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. C, blev Lysater af Caco2pEVX og Caco2SrcY527F celler immunfarvet for p-Src

416 og total Src og også til en Ras aktivering assay. Densitometri værdier for Ras-GTP er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. D, venstre panel, Kontrol celler og celler forbehandlet med NAC (20 mM) i 20 minutter blev udsat i 10 minutter for H

2O

2 (5 mM). Lysater blev derefter immunblottet for p-Src

416 og total Src. β-actin bekræftede lige belastning. Midterste og højre paneler, Kontrol Caco2-celler og celler forbehandlet med NAC (20 mM) i 1 time blev inkuberet i hypoxi i 4 timer. Western blotting for phospho-Src

416 (midterste panel) og en Ras aktivering assay (højre panel) blev derefter udført. Densitometri-værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. E, blev lysater af kontrol Caco2-celler og celler inkuberet i hypoxi i de angivne tidsrum underkastet Western blotting til påvisning af p-EGFR (Tyr

1068) og total EGFR-proteinniveauer. Behandling med EGF (100 ng /ml) fungerede som en positiv kontrol.

For at mere direkte vurdere, hvilken rolle af c-Src, vi bankede ned endogene c-Src i Caco2 celler via RNA-interferens. Knock-down af c-Src førte til en reduktion i den hypoksiske aktivering af GTP-bundne Ras (fig. 2B, højre panel) 33%. Endvidere Caco2-celler udtrykker et konstitutivt aktiv c-Src-vektoren (SrcY527F) udviste en stigning i niveauet af GTP-bundne Ras (fig. 2C) 70% sammenlignet med tom vektor (pEVX). Western blotting bekræftet K-ras isoform blev aktiveret ved ekspression af Src (fig. S2).

reaktive oxygenarter (ROS) dannet af hypoxi er tidligere blevet vist at aktivere Src. Eksogen administration af H

2O

2 (5 mM) potent induceret fosforylering af Src på Tyr

416 i Caco2 celler (Fig. 2D, venstre panel). Denne virkning var signifikant reduceret med NAC (20 mM), en antioxidant, som hæmmer ROS. Vi derefter forsøgt at afgøre, om NAC kunne blokere hypoxiske aktivering af endogene Src og Ras. NAC behandling reducerede induktionen af ​​p-Src

416 i hypoxi med ca. 30% med en ledsagende reduktion 17% af GTP-bundet Ras (fig. 2D). Disse resultater tyder på, at generation af ROS kan delvist bidrage til hypoxiske aktivering af c-Src i colon cancerceller.

De seneste rapporter har foreslået, at hypoxi kan øge niveauet af EGFR og at phosphorylering af EGFR kan være et mellemliggende skridt i signaleringen fra Src til Ras [11], [12]. For at bestemme om EGFR kan spille en sådan rolle, vi målte totale EGFR og phospho-EGFR niveauer i Caco2-celler inkuberet i hypoxi. Der var en lille stigning i den samlede EGFR i hypoxi. Men der var ingen stigning i EGFR-phosphorylering hos Tyr

1068 (fig. 2E). Samlet set antyder dataene, at opregulering af c-Src-aktivitet ved hypoxi medieres delvist gennem ROS men at aktivering af K-Ras ved c-Src i hypoksi ikke afhænger EGFR.

Aktivering af Akt af hypoxi er nedstrøms for c-Src og K-ras

Vi næste forsøgt at bestemme hvilke nedstrømseffektor pathways blev aktiveret ved C-Src og K-ras i hypoxi. Udsættelse for hypoxiske betingelser inducerede phosphorylering af Akt ved Ser

473 i begge Caco2 og HT29-celler, mens der ikke blev detekteret nogen aktivering af ERK under samme betingelser (fig. 3A). Akt blev aktiveret i en tidsafhængig måde og nåede et maksimalt niveau på 12 timer. For at bestemme om Src var involveret i hypoxisk aktivering af Akt, vi forbehandlet Caco2 celler med det specifikke Src inhibitor PP2 i 12 timer før eksponering for hypoxi. Som vist i figur 3B, blev den hypoxiske aktivering af Akt reduceret med PP2 behandling på en dosis-afhængig måde. I overensstemmelse med disse resultater, banke ned af c-Src også helt blokeret den hypoxiske aktivering af Akt sammenlignet med celler transficeret med en kontrol siRNA (fig. 3C).

A, Protein ekstrakter fra Caco2 og HT29-celler dyrket i normoxiske eller hypoxiske betingelser i de angivne tidsrum blev underkastet immunoblotting for phospho-Akt og phospho-ERK1 /2. Blottene blev derefter strippet og testet igen med antistoffer mod total Akt og total ERK. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Densitometri-værdier for p-Akt udtrykkes som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. B, blev Caco2-celler inkuberet i 1 time med PP2 ved de angivne koncentrationer, før overførsel til normoxiske eller hypoxiske betingelser i 12 timer. Western blotting blev udført for at bestemme niveauerne for phospho-Akt, total Akt, phospho-Src

416, og total Src. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Densitometri-værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. C blev Caco2-celler transficeret med kontrol siRNA, K-ras siRNA eller c-Src siRNA oligoer (hver ved 20 nM) før udsættelse for normoxisk (N) eller hypoxiske (H) betingelser for 12 timer. Immunoblotting med de angivne antistoffer blev derefter udført. Densitometri værdier for p-Akt udtrykkes som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1. D blev Caco2 celler stabilt overeksprimerer K-RASV12 (Caco2pCSGWK-ras V12) transficeret med c-Src siRNA oligoer. Otteogfyrre timer senere blev cellerne inkuberet i hypoxi eller normoxi i 12 timer og Western blotting med de angivne antistoffer blev derefter udført. Densitometri værdier for p-AKT udtrykkes som fold ændring i forhold til kontrolværdier normaliseret til 1.

Fordi Akt er kendt for at være nedstrøms K-ras, vi testede, om Akt er også et specifikt mål for K-ras under hypoxiske betingelser ved at anvende K-RAS siRNA oligoer. Silencing af K-ras reducerede niveauerne af Akt i hypoxi sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (fig. 3C). Disse data indikerer, at hypoxisk aktivering af Akt medieres gennem både Src og K-ras. Ingen ændringer i phospho-Src

416 og totale Src proteinniveauer blev observeret, når K-ras blev stille (fig. 3C), hvilket indikerer, at Src er faktisk opstrøms for K-ras i denne hypoxisk-signalvejen.

at selvstændigt kontrollere, at K-ras var neden for Src i denne hypoxi-induceret fosforylering af Akt, vi udførte eksperimenter i en Caco2 cellelinje stabilt udtrykker mutant onkogen

KRAS

V12

(Caco2 /pCSGWK- RASV12). Den hypoxiske induktion af p-Akt blev ikke blokeret af silencing af c-Src med siRNA (Fig. 3D). Disse resultater indikerer, at c-Src funktioner opstrøms af K-ras i hypoxiske aktivering af Akt.

K-ras og Src mægle resistens mod apoptose i hypoxi

Akt spiller en central rolle i reguleringen apoptose og cellecyklusprogression. Da Akt er en nedstrøms mål for K-ras i denne hypoxi-udløst intracellulær signalvej, søgte vi at bestemme, om silencing af K-ras ville påvirke celleoverlevelse. Knock-down af K-ras nedsat levedygtighed celle selv i normoxiske forhold med 20% i HCT116 celler, men der var ingen væsentlige ændringer i DLD1 eller Caco2 celler. I modsætning hertil K-ras knockdown i hypoxiske betingelser reducerede celletal i langt højere grad: en reduktion på 40% i HCT116 (

P

0,05) og 50 reduktioner i DLD1 og Caco2 celler (%

P

0,01) blev observeret (figur 4A).. Silencing af K-ras i Caco2-celler resulterede i en overlevelsesrate i hypoxi sammenlignelig med DLD1 og HCT116 celler, der huser en mutant

KRAS

gen, hvilket antyder, at vildtype-K-ras-protein spiller også en vigtig rolle i den adaptive mekanisme i hypoxi.

A blev DLD1, HCT116 og Caco2-celler transficeret med kontrol siRNA eller K-ras siRNA, og derefter inkuberet i hypoxi i 48 timer. Celleantal blev bestemt ved anvendelse af et hæmacytometer efter farvning med trypanblåt, og resultaterne er udtrykt som procentdele af levedygtige celler sammenlignet med siRNA kontrol transficerede celler i normoxi. Dataene er fra tre uafhængige forsøg og vist som middelværdi ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01. B, Colo320DM celler dyrket på sterile dækglas blev transficeret med siRNA kontrol oligoer (vist i øverste rækker) eller siRNA oligoer til K-ras (vist i nederste rækker) i 24 timer efterfulgt af inkubation i hypoxi i 48 timer. Tidlig apoptotiske (FITC + PI-) og sene apoptotiske /nekrotiske celler (FITC + PI +) blev påvist. Venstre paneler: 20x fasekontrast og 20x fluorescens grøn og rød kanal fusionerede billeder. Højre paneler: 20x og 40x fluorescens grøn og rød kanal fusionerede billeder. C, Caco2-celler blev transficeret med K-ras siRNA eller kontrol siRNA, og derefter inkuberet i normoxi eller hypoksi i 48 timer. Celledød blev bestemt ved FACS som beskrevet i Materialer og Metoder. D, Tidlig apoptotiske (Annexin V + PI-) og sene apoptotiske /nekrotiske (Annexin V + PI +) celler blev bestemt ved FACS-analyse. Middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg er vist. *, P 0,05. **, P 0,01. E, DLD1, HCT116 og Caco2-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller c-Src siRNA oligoer (20 nM) i 24 timer og derefter udsat for hypoxi i 48 timer. Celler undtagen trypanblåt blev talt, og resultaterne er udtrykt som procentdelen af ​​levedygtige celler i forhold til siRNA kontrol transficerede celler i normoxi. Middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg er vist. *, P 0,05. **, P. 0,01

Vi derefter mærkede celler med FITC-konjugeret annexin V og propidiumiodid (PI) til at måle satser for apoptose. En anden vildtype

KRAS

cellelinje, Colo320DM, blev undersøgt, fordi dens vækst mønster som enkelte celler tillader visualisering af apoptotisk membran ændrer mere tydeligt. Silencing af K-ras resulterede i ændringer i cellemorfologi, herunder blæredannelse, krympning, og nuklear fragmentering, samt reduceret vedhæftning til vævskulturskål og forøget flydende. Silencing af K-ras steg også antallet af Annexin V-positive celler sammenlignet med kontrol siRNA (fig. 4B). At kvantificere de anti-apoptotiske virkninger af K-ras i hypoxi, analyserede vi apoptotiske cellepopulationer ved flowcytometri (FACS). Caco2-celler transficeret med en ikke målrettet bekæmpelse eller K-RAS siRNA oligoer blev inkuberet i normoxi eller hypoksi i 48 timer. Celler uden nogen behandling tjente som en negativ kontrol, og celler eksponeret for UV-lys i 10 minutter og dyrket med TNF-α og cycloheximid (CHX) tjente som en positiv kontrol (fig. 4C, venstre panel). Et histogram af Annexin V-FITC positive celler afslørede, at knock-down af K-ras i normoxi ændrede ikke signifikant satser af apoptose. Men under hypoxiske betingelser, tab af K-ras markant øget satser for celledød fra 22% til 57% sammenlignet med kontrol siRNA behandling (fig. 4C, midterste og højre panel). Vi analyserede yderligere apoptotiske celler som to subpopulationer: tidlige apoptotiske celler (Annexin V +, PI-) og sene apoptotiske /nekrotiske celler (Annexin V +, PI +). Først når K-ras blev slået ned under hypoxiske betingelser var en signifikant induktion af apoptose observeret af FACS-analyse; var der en 1,3 gange stigning i antallet af tidlige apoptotiske celler (

P

0,05) og 2,0-fold stigning i antallet af sene apoptotiske celler (

P

0,01) sammenlignet med kontrolpatienter siRNA i hypoxi (fig. 4D). Disse undersøgelser viser, at K-ras kan inhibere apoptose i hypoxi.

Vores data tydede på, at Src også kan regulere overlevelse veje, der blokerer apoptose i hypoxi. Vi definerede forholdet mellem Src og celleoverlevelse direkte ved at tælle levedygtige celler, som udelukkede trypanblå. Knock-down af Src i DLD1 og HCT116 celler ændrede ikke celle overlevelse i normoxi (1% og 9% reduktion i celletal, henholdsvis), mens der i hypoxi, celletal faldt med 36% og 45%, henholdsvis (fig. 4E ). Ligeledes knockdown af c-Src i Caco2 celler reduceret celletal med 20% i normoxi sammenlignet med en mere markant reduktion i hypoxi 58%. Derfor aktivering af K-ras eller Src under hypoxiske betingelser forbedrer overlevelsen af ​​tyktarmskræft celler.

Hypoksisk regulering af VEGF ved K-ras

Hypoxi er også en potent stimulus for angiogenese gennem induktion af VEGF. Vi har tidligere påvist, at hypoksi og oncogene K-ras synergistisk kan opregulere VEGF [2]. Mens sådanne undersøgelser giver uvurderlig indsigt i onkogen K-ras-funktion, de ikke giver indsigt i mekanismer, tyktarmskræft celler med en vildtype

KRAS

kan benytte. Vi hæmmede derfor det endogene vildtype

KRAS Salg In Caco2 celler med siRNA oligoer at definere forholdet mellem K-ras-aktivering og VEGF-produktion. I Caco2-celler transficeret med en kontrol siRNA, hypoksi forøgede VEGF mRNA niveauer 4,9-fold. Knockdown af K-ras resulterede i et fald i VEGF-mRNA-ekspression med 60% og 76% i normoxiske og hypoxiske betingelser, når det blev sammenlignet med celler transficeret med en kontrol siRNA (fig. 5A). Dernæst anvendes en VEGF-promotor reporterkonstruktion (fig. 5B). Hypoxiske betingelser inducerede VEGF promotoraktivitet med 2,2 fold. Overensstemmelse med vores QRT-PCR resultater, silencing af K-ras dramatisk reduceret den hypoxiske induktion af VEGF-promotor-aktivitet med 72%. I normoxi, var der en reduktion på 38% i VEGF-promotoraktivitet efter K-ras silencing. Dette fald i VEGF promotoraktivitet korreleret med de ændringer, der ses i K-ras-aktivering. Endelig et ELISA-assay demonstrerede, at udskilt VEGF protein niveauer opreguleret 2,6 gange af hypoxi. Knockdown af vildtype

KRAS

i Caco2-celler faldt VEGF proteinniveauer af 8% i normoxi men nedsat VEGF protein niveauer mere markant i hypoksi med 51% (fig. 5C). Disse resultater antyder, at en vildtype

KRAS

gen er også et kritisk regulator af VEGF i hypoxiske betingelser.

A, Relative mRNA-niveauer af VEGF, som vurderet af kvantitativ RT-PCR, i Caco2-celler transficeret med en K-ras-specifik siRNA konstruere eller en ikke målretning kontrol og udsat for normoxi eller hypoksi. Dataene er udtrykt som gange ændring i forhold til siRNA kontrolceller i normoxi, normaliseret til 1. Kolonne, gennemsnit af mindst tre forsøg; barer, SEM. *, P 0,05 sammenlignet med kontrolceller. B, Caco2-celler blev transient transficeret med enten siRNA målretning endogene K-ras eller ikke målretning kontrol siRNA. Efter 24 timer tilsættes 2,3 kb VEGF-luciferase-reporterkonstruktion blev co-transficeret med pRL-CMV, og celler blev inkuberet i normoxi eller hypoksi i yderligere 24 timer. Dataene er udtrykt som gange ændring i forhold til siRNA kontrolceller i normoxi, normaliseret til 1. Kolonne, gennemsnit af mindst tre forsøg; barer, SEM. *, P 0,05 sammenlignet med kontrolceller. C, supernatanten fra cellerne i (A) blev opsamlet, og en ELISA for VEGF blev udført. Dataene er udtrykt som gange ændring i forhold til siRNA kontrolceller i normoxi, normaliseret til 1. Kolonne, gennemsnit af mindst tre forsøg; barer, SEM. *, P. 0,05 sammenlignet med kontrol celler

Hypoksisk induktion af VEGF er også Src-afhængige

Selvom tidligere beviser har indikeret, at c-Src signaltransduktionsveje kan regulere VEGF ekspression, forholdet mellem aktiveringen af ​​Src af hypoxi og produktion af VEGF i colontumorceller er endnu ikke afklaret. Snarere end overekspression v-Src, vi blokeret endogent c-Src med PP2. PP2 behandling i 24 timer i Caco2-celler undertrykte VEGF-mRNA-niveauer med 87% i hypoxi forhold til et fald på 60% i normoxi (fig. 6A). PP2 undertrykte også VEGF-promotor-aktivitet med 85% i hypoxi sammenlignet med en reduktion i normoxi (fig. 6B) 50%.

A og C, relativ mRNA-niveauer af VEGF, som vurderet af kvantitativ RT-PCR, i Caco2 og HT29-celler forbehandlet med 10 pM PP2 (a) eller transient transficeret med en Src-specifik siRNA konstruktion (C), og eksponeret for normoxi eller hypoksi i 24 timer. Dataene er udtrykt som gange ændring i sammenligning med kontrolceller i normoxi, normaliseret til 1. *, P 0,05. B og D, VEGF luciferase reporter assays af Caco2 og HT29-celler, forbehandlet med 10 pM PP2 (B) eller transient transficeret med en Src-specifik siRNA konstrukt (D), og eksponeret for normoxi eller hypoksi i 24 timer. Resultaterne er fra tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer og præsenteres som fold ændring i forhold til kontrol celler i normoxi normaliseret til 1. Data er vist som middelværdi ± SD. *, P 0,05. **, P. 0,01

For at verificere den særlige rolle af c-Src i hypoxisk induktion af VEGF, vi udnyttet Src siRNA oligoer. Med denne fremgangsmåde, mRNA-niveauer af VEGF var uændrede i normoxiske betingelser, men reduceret med 39% i hypoxi (fig. 6C), og VEGF promotoraktivitet faldt 56% sammenlignet med et 33% fald i normoxi (fig. 6D). For at bekræfte denne effekt var ikke enestående for Caco2 celler, blev også analyseret HT29-celler. Behandling med PP2 eller Src siRNA oligoer i HT29 celler under normoxiske betingelser havde ubetydelige virkninger på VEGF mRNA eller promotoraktivitet. I modsætning hertil under hypoxiske betingelser, PP2 undertrykte VEGF-mRNA-niveauer og promotoraktivitet med 67% og 53%, (fig 6A og 6B, højre paneler.); Ligeledes c-Src siRNA oligoer reduceret VEGF-mRNA-niveauer og promotor-aktivitet med 37% og 76% i hypoxi, (fig. 6C og 6D, højre felter). Kollektivt, disse resultater også implicerer c-Src som en kritisk regulator af VEGF i hypoxi.

Diskussion

Hypoxi er en uundgåelig konsekvens af hurtig tumorvækst, der overgår den eksisterende blodforsyning. Et nøje planlagt sæt af adaptive responser sikrer overlevelse af tumorcellen i disse hypoxiske betingelser. HIF-1 transkriptionsfaktor vides at spille en rolle i denne hypoxisk respons [13], [14], [15]. Vi søgte at afgøre, om yderligere onkogene veje kan forbedre disse adaptive responser. I tyktarmskræft, har tidligere undersøgelser vist en synergistisk vekselvirkning mellem

KRAS

mutationer og iltsvind i reguleringen af ​​flere gener, herunder VEGF [2], [8], [9]. Men

KRAS

mutationer er identificeret i mindre end halvdelen af ​​alle kolon kræft, og den rolle, vildtype

KRAS

i hypoxisk reaktion er mindre sikker. Så vidt vi ved, er dette den første påvisning af hypoxisk aktivering af K-ras i tyktarmskræft.

Vores data viser, at hypoxi er en potent aktivator af vild-type K-Ras i colon cancerceller. Aktivering af K-ras resulterede i nedstrøms aktivering af Akt, induktion af VEGF, og inhibering af apoptose. Disse virkninger på angiogenese samt apoptose er begge kritiske for tumor overlevelse under forhold med vedvarende hypoxi. Rekrutteringen af ​​Akt pathway er i overensstemmelse med tidligere rapporter om hypoxisk signalering ved mutant K-ras i reguleringen af ​​OPN genekspression [9]. K-ras kan aktivere hypoxi-inducerbar faktor-1 (HIF-1) gennem proteinphosphorylering, og nogle af de observerede virkninger på induktionen af ​​VEGF kan potentielt være medieret gennem HIF-1 [16]. Det er imidlertid usandsynligt, at HIF-1 er den eneste mediator af denne proces, som K-ras også kan regulere VEGF gennem HIF-1 uafhængige veje i hypoxi [17].

Aktiveringen af ​​K-ras i hypoxi afhang den opstrøms aktivering af c-Src. Der er præcedens for hypoxiske aktivering af Src, som er blevet påvist både

in vivo

in vitro

i andre celletyper [18]. Der er en række specifikke mediatorer, der linker Src til K-ras, og en rolle for aktivering af EGFR er velbeskrevet [11], [19], [20]. Trods sin faste forbindelse til colon tumorigenese, er EGFR ikke spiller en rolle i den hypoksiske aktivering af K-ras.

cellulære reaktioner på hypoksi søge at bevare overlevelse i et fjendtligt mikromiljø. Aktiveringen af ​​K-ras i hypoxiske betingelser indebærer en nøglerolle i den hypoksiske respons, og vores studier understrege to vigtige funktioner: inhibering af apoptose og stimulering af angiogenese. Rolle K-ras i reguleringen af ​​apoptose er stærkt afhængig af kontekst og celletype. I nogle tilfælde kan K-ras være pro-apoptotisk gennem aktiveringen af ​​RASSF1 eller Nore1, men i andre scenarier det kan tjene anti-apoptotiske funktioner gennem PI3K eller Tiam1 [21]. Vore studier i colon cancerceller demonstrerer en afgørende rolle for aktivering af Akt pathway i hypoxi, som tidligere har vist sig at blokere apoptose i andre cellulære systemer [22], [23], [24]. Interessant nok blev ERK ikke aktiveret af hypoxi i vores system. Rolle ERK-aktivering i colontumorer er ikke ligetil. Selvom ekspression af onkogene K-ras i normale colon-epitelceller kraftigt kan aktivere ERK

in vivo

, blev kun begrænset ERK-signalering observeret i kolon tumorer, der er udviklet i disse dyr [10]. Desuden coloncancer celler, der bærer en K-ras-mutation ikke påvist signifikant aktivering af ERK, og ingen pålidelig korrelation mellem

KRAS

mutation status og ERK-aktivering er blevet observeret i humane coloncancer prøver [10], [ ,,,0],25]. De specifikke mekanismer, der bestemmer hvilke effektor veje er ansat af K-ras i hypoxisk versus normoxiske betingelser endnu ikke defineret og illustrerer plasticitet K-ras funktion afhængig af specifikke mikro-miljø signaler.

kan derfor hypoxiske betingelser skabe et miljø, hvor proto-onkogener, som ikke muterede kan efterligne aktiverede onkogener. Selvom vildtype-K-ras kan aktiveres ved hypoxi, er det sandsynligt, at dens spektrum af aktivitet ikke fuldt overlapper med den for mutant K-ras og der er andre egenskaber specifikke for onkogene

KRAS

alleler.