PLoS ONE: Korrelation af Kromosomal ustabilitet, telomer længde og telomer vedligeholdelse i mikrosatelitter Stabil endetarmskræft: En Molekylær underklasse af Rektal Cancer

Abstrakt

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) tumor DNA er karakteriseret ved kromosomskader betegnes kromosomal ustabilitet (CIN) og overdrevent forkortede telomerer. Op til 80% af CRC er mikrosatellit stabil (MSS), og er historisk set anses for at være kromosomalt ustabile (CIN +). Men tumor fænotypebestemmelse skildrer nogle MSS CRC med ringe eller ingen genetiske ændringer, således er kromosomalt stabil (biografstørrelse). MSS biografstørrelse tumorer er ikke blevet vurderet for telomer nedslidning.

Eksperimentel Design

MSS rektal kræft fra patienter ≤ 50 år med fase II (B2 eller højere) eller trin III sygdom blev vurderet for CIN, telomer længde og telomer vedligeholdelse mekanisme (telomerase aktivering [ ,,,0],TA] alternativ forlængelse af telomerer [ALT]). Relativ telomerlængde blev målt ved qPCR i somatisk epitel- og cancer DNA. TA blev målt med trapez assay og tumorer blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​C-kredse indikerer ALT. p53 mutation status blev vurderet i alle tilgængelige prøver. DNA-kopier nummer ændringer blev evalueret med Spectral Genomics aCGH.

Resultater

Tumorer blev klassificeret som kromosomalt stabil (biografstørrelse) og kromosomalt ustabilt (CIN +) ved graden af ​​DNA kopital ændringer. Biografstørrelse tumorer (35%, n = 6) havde færre kopital ændringer ( 17% af deres kloner med DNA kopital ændrer) end CIN + tumorer (65%, n = 13), der havde høje niveauer af kopital ændringer i 20% til 49% af klonerne. Telomere længder var længere i biografstørrelse sammenlignet med CIN + tumorer (p = 0,0066) og i dem, hvor telomerase ikke aktiveret (p = 0,004). Tumorer, der udviser aktivering af telomerase havde kortere tumor telomerer (p = 0,0040); og tendens til at være CIN + (p = 0,0949).

Konklusioner

MSS endetarmskræft synes at repræsentere en heterogen gruppe af tumorer, der kan kategoriseres både på grundlag af CIN status og telomer vedligeholdelse mekanisme . MSS biografstørrelse rektale cancere synes større telomerer end hos MSS CIN + rektale cancere og for at udnytte ALT snarere end aktivering af telomerase.

Henvisning: Boardman LA, Johnson RA, Viker KB, Hafner KA, Jenkins RB, Riegert-Johnson DL, et al. (2013) Korrelation af Kromosomal ustabilitet, telomer længde og telomer vedligeholdelse i mikrosatelitter Stabil endetarmskræft: En Molekylær underklasse af endetarmskræft. PLoS ONE 8 (11): e80015. doi: 10,1371 /journal.pone.0080015

Redaktør: Michel M Ouellette, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 30. maj 2013; Accepteret: 27. september 2013; Udgivet: November 21, 2013 |

Copyright: © 2013 Boardman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Cancer Institute (R01 CA132718 og P50 CA102701 Mayo Clinic SPORE i kræft i bugspytkirtlen); National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme (P30 DK084567 Mayo Clinic Center for Cell Signaling i Gastroenterology); den Lustgarten Foundation for kræft i bugspytkirtlen; og af Mayo Clinic Center for Individualized Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) kan opdeles i tumorer udviser versus dem med intakt karyotype og kromosomal stabilitet (CIN) kromosomal ustabilitet (CIN +). Konventionelt, kun tumorer med defekt DNA mismatch repair (dMMR), også kendt som mikrosatellitmarkørerne ustabile tumorer, (MSI (H)), blev anset for at være biografstørrelse, og CIN + tumorer blev anset for at have intakt dMMR og være mikrosatellit stabil (MSS) . Imidlertid har flere undersøgelser vist, at op til 50% af MSS tumorer er biografstørrelse, og en betydelig, men mindre del af MSI (H) kolorektale tumorer er CIN + [1,2]. Selvom MSI (H) kolorektale cancere er forbundet med en bedre prognose end MSS tumorer, har nylige undersøgelser indikerede, at niveauet af kromosomal ustabilitet, snarere end mikrosatellit status, er de nyttige prognostisk markør [3]. Specifikke fænotyper associeret med MSS biografstørrelse subtype omfatter dårlig tumor differentiering, mucinøs histologi og en lavere p53-mutationer [1,4]. Desuden CRC, der opstår i en yngre alder ( 50 år) er mere tilbøjelige til at være MSS diploid, med diploidi er et surrogat foranstaltning af kromosomal stabilitet. Kromosomalt stabil (biografstørrelse) mikrosatellit stabil (MSS) CRC er en forholdsvis ny klassifikation af CRC, der giver en anden ramme at forstå de veje underliggende denne kræft.

Forkortede telomerer har været knyttet til kromosomalt i fastsættelsen af ​​aldersrelaterede sygdomme forbundet med genetisk forstyrrelse og carcinogenese ustabilitet (CIN) [5]. Telomerer består af gentagne TTAGGG sekvenser, der beskytter enderne af lineære kromosomer fra efterlades sårbare over for skader, og dysfunktionelle afkortning af telomerer er blevet impliceret som forstadiet til kromosomal ustabilitet. Kritisk korte telomerer afsløre kromosomale ender, engagere DNA skade responset, og bundfald end-to-end fusioner og rekombination begivenheder. Primære mammae epitelceller med kortere telomerer er oftere involveret i mis-segregation begivenheder og udviser ikke kun kromosomale rearrangementer men også numeriske kromosomale ændringer [6], hvilket indikerer, at kortere telomer længde kan muliggøre udviklingen af ​​CIN. Telomer længde i DNA fra MSS biografstørrelse tumorer er ikke blevet vurderet.

Telomerer kan forlænges ved aktivering af ribonucleoprotein revers transkriptase navngivet telomerase [7] .. Telomerase aktivering er til stede i mange cancere. Kritisk forkortede telomerer normalt initiere celleældning og apoptose og stoppe proliferation af celler indeholdende betydeligt beskadiget DNA. Telomerase aktivering kan effektivt immortalisere cancerceller ved at genskabe nok telomerlængde at beskytte den numerisk /og strukturelt ændret DNA fra at blive neutraliseret af DNA beskadigelse respons og undergår celleældning. En anden vej af telomer vedligeholdelse hvorigennem telomerer kan omdirigeres fra senescens er via alternativ forlængelse af telomerer (ALT), som er en homolog rekombination mekanisme, der bruger en DNA-template til at bevare telomerlængde [8].

Vi forsøgt at bestemme, om distinkt telomer vedligeholdelse pathway (s) ville korrelere med tilstedeværelsen eller fraværet af CIN i MSS rektal cancer. For yderligere at klarlægge fænomenet MSS biografstørrelse forhold til CIN + endetarmskræft, vi udnyttet vifte CGH (aCGH) at vurdere tumorer for strukturel kromosomal og sub-kromosomale genetiske ændringer.

Som vores tidligere undersøgelse viste, at næsten 50% af unge debut MSS CRC sager, der opstod i den proksimale colon eller i endetarmen var diploide ved flowcytometri [9], vi studerede kun unge alder debut sager og fokuseret på rektale cancere i tilsvarende. Vi målte telomer længde i tilsvarende perifert blod leukocyt, normal tilstødende colon, og endetarmskræft DNA og vurderede endetarmskræft DNA for telomerase aktivering og ALT for at afgøre, om en af ​​de to vigtigste mekanismer for telomer vedligeholdelse vil korrelere med niveauet af CIN i unge debut MSS endetarmskræft.

Metoder

Model udvælgelse og forarbejdning

Denne undersøgelse blev godkendt af Mayo Clinic Board Institutional Review. Vi inkluderet rektal kræftpatienter fra tre kilder: (1) Biobank for Gastrointestinal Health Research, en potentiel repository består af kommenterede biospecimens fra individer med CRC, der havde evaluering på Mayo Clinic i Rochester, MN fra april 2000 til august 2005, og som accepterer at være i lageret; (2) rektal kræfttilfælde fra en fremadrettet samlet serie af CRC patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på Mayo Clinic (Rochester, MN) mellem december 1995 og frem til april 1997 [10] og (3) en potentiel serie af CRC patienter, som gennemgik kirurgi fra 1987 gennem 1988 [11]. Vi valgte 19 deltagere med MSS rektal kræft med debut i en alder ≤ 50 år, og som var enten fase II (B2 eller højere) eller fase III. Kun deltagere med blod og /eller normale tyktarmsepitelet og tumorprøver indsamlet forud for enhver kemo eller strålebehandling blev udvalgt til denne undersøgelse. DNA blev ekstraheret fra perifere blodleukocytter hjælp af Gentra AutoPure udsaltning kemi (Gentra, Minneapolis, MN) og kvantificeret ved UV-absorbans. DNA kvalitet blev vurderet ved 260/280 optisk tæthed ratio. MSI status blev målt under anvendelse af en kombination af immunohistokemi og PCR analyse af MSI. Immunohistokemisk farvning for MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2, og mikrosatellit instabilitet test blev udført som tidligere beskrevet [12]. Mikrosatellitmarkører BAT26, D17S250; D5S346; ACTC, BAT40, BAT 25, BAT 34C4, D10S197, MYCL, og D18S55 blev udnyttet til at vurdere MSI status, og en tumor blev kaldt MSS hvis ingen af ​​markører viste MSI og alle immunostains viste intakt udtryk for MMR-proteiner [13].

tumor vævsbehandling og DNA-ekstraktion for vifte CGH

Frosne tumor prøver blev anvendt til CGH array-studier. Fuld tykkelse tumor og normale colon-epiteliale væv blev udskåret fra kirurgiske prøver, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70 ° C. Vævssektionering blev udført i en kryostat ved -20 ° C. Tumorvæv var makro-dissekeres at berige for tumor densitet ( 70% tumor kerner). Kort fortalt blev en 6 mikron tyk frosne tumor sektion farvet med hematoxylin og eosin og markeret som en vejledning dias ved vores patolog (TCS) for at identificere områder, der indeholder ≥ 70% tumor kerner. Dette dias blev derefter anvendt til at identificere det område af tilsvarende frosne tumor blok med kun det areal afsat med 70% tumor densitet sektionsopdelt til anvendelse som tumorvævet kilde til DNA. Tilhørende normal tyktarmsslimhinde, mindst 8 cm fra tumoren margen, blev mikrodissekeres til epitelvæv. Snit blev anbragt i ekstraktionspuffer og genomisk DNA blev ekstraheret fra tumor eller normal colon epitel DNA ved phenol /chloroform-ekstraktion og kvantificeret ved UV-absorbans, og DNA kvalitet blev vurderet ved 260/280 optisk densitet ratio. I alle tilfælde blev DNA ekstraheret fra kemostråleterapi naiv endetarmskræft.

Array CGH

aCGH blev udført ved hjælp af Spectral Chip ™ 2600 (Spectral Genomics, Houston, TX), som indeholder 2600 BAC kloner spottet in duplo. Fremadgående og tilbagegående eksperimenter mærkning blev udført for hver tumor prøver. Mærkning og hybridisering blev udført i overensstemmelse med producentens protokol for Spectral Chip ™ 2600. Ultra-rent deioniseret H

2O blev anvendt til fremstilling af alle reagenser; Promega Mand Genomisk DNA (Madison, WI) blev anvendt som reference DNA; dye-vending forsøg, hvor blev udført 2 mikroarrays for hver prøve med gensidig mærkning af testen og reference-DNA. Testen og reference-DNA blev vilkårligt primet mærket ved at kombinere 2 ug genomisk DNA og ddH

2O til et samlet volumen på 50 pi og lydbehandling i en omvendt kop horn sonikator for at opnå fragmenter 600 bp til 10 kb i størrelse. DNA oprydning blev udført med Zymo Clean-up Kit (Orange, CA) i henhold til protokollen. Elueringsmidlet blev delt ligeligt mellem 2 rør og, til hver, 20 pi 2,5 × vilkårlige primere fra Invitrogens (Carlsbad, CA) BioPrime DNA Labeling Kit blev tilsat, blandet godt, kogt 5 minutter, og umiddelbart anbragt på is i 5 minutter. Til hver blev tilsat 0,5 pi Spectral Labeling Buffer (Spectral Genomics), 1,5 pi Cy3-dCTP eller 1,5 pi Cy5-dCTP respektive til hver dye-vending eksperiment (PA53021, PA55021; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og 1 pi Klenow fragment (BioPrime DNA Labeling Kit, Invitrogen). Indholdet blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Rørene blev derefter genopvarmet til kogning i 5 minutter og returneres til is i 5 minutter. En anden 5 ul alikvot af mærkning puffer blev tilsat til blandingen, og rørene blev inkuberet ved 37 ° C i endnu en time. Ved afslutningen af ​​den anden time, tilsætte 5 pi 0,5 M EDTA, pH 8,0, og inkubering af rørene i et tørt bad i 10 minutter ved 72 ° C standsede reaktionen mærkning. Prøve- og kontrol-DNA-blandinger blev derefter kombineret i prøverøret, 45 ul af Hyb I (blokering DNA og laksesperm bærer-DNA) blev tilsat til hvert rør og 5 M NaCl og 100% isopropanol blev tilsat til rørene til udfældning af DNA. DNA-pellets blev vasket med 70% ethanol X1 og derefter tørret i mørke. Efter fornyet hydrating pelleterne med vand blev HYBII (hybrisol) tilsat til blandingen, og DNA’et blev denatureret i ti minutter ved 72 ° C, derefter præhybridiseret i 30 minutter, inden det bringes på arrayet og dækket med en 24X60mm dækglas . Objektglas blev inkuberet natten over i en 37 ° C varm ovn.

Post-hybridiseringsbetingelser vaske blev udført med hvert objektglas i individuelle dybe petriskåle i en vuggende inkubator. Efter fjernelse af dækglasset blev objektglassene kortvarigt gennemvædet i 0,5% SDS ved stuetemperatur. Hvert objektglas blev derefter overført til 2 X SSC, 50% deioniseret formamid pH 7,5 i 20 minutter; derefter 2XSSC, 0,1% IGEPAL CA-630, pH 7,5 i 20 minutter efterfulgt af 0,2 x SSC, pH 7,5 i 10 minutter, hver opvarmet til 50 ° C og omrøres i en inkubator ved 50 ° C. Endelig hvert dias var kortvarigt skyllet i to bade i stuetemperatur Hedeselskabet

2O og straks blæst tør med komprimeret N

2 og scannes.

Array dataanalyse

Scanning blev udført med Axon s GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og billederne blev analyseret med GenePix Pro 3.0 til at forberede datafiler for plot analyse med Spectralware software V2.2. (Spectral Genomics, Houston, TX). Steder blev defineret af den automatiske gitter funktionen af ​​softwaren og manuelt justeres, når det er nødvendigt. Steder viser intet signal eller åbenlyse mangler blev udelukket fra dataanalyse, lokal baggrund blev subtraheret, og totale intensiteter samt fluorescensintensiteten forhold af de to farvestoffer, blev beregnet for hver plet. Plot analyse blev udført ved hjælp af den online tilgængelige version af SpectralWare software (Spectral Genomics) ved hjælp af den globale middeltemperatur normalisering af dataene. Desuden blev de datasæt analyseret under anvendelse af Microsoft Excel. Efter udførelse globale gennemsnitlige og globale median normalizations, det gennemsnitlige forhold mellem fire fluorescerende signaler (to signaler fra det dublerede klon på arrayet og to signaler fra farven omvendt eksperiment) for hver klon blev beregnet. Alle analyser blev udført på log

2 nøgletal. For at reducere falske positive resultater, kloner viser test /reference-forholdet værdi højere end 1,2 blev anset erfaringer og kloner viser test /reference-forholdet lavere værdi end 0,8 blev anset tabt, men kun hvis resultaterne af alle fire fluorescerende signaler var konsistente. Kloner blev udelukket fra analysen, hvis forholdet værdier af de fire hybridiserede pletter af hver klon oversteg grænseværdierne (0,8-1,2) i en ikke-samstemmende sag.

Kvantitativ PCR vurdering af telomer længde

telomer længde blev vurderet i tumor DNA fra alle endetarmen kræfttilfælde og fra dem med tilstrækkelig normal colon epitel DNA ved hjælp DNA som forberedt array CGH-analysen [14 ]. I en del af tilfældene, PBL DNA var tilgængelige og ekstraheret under anvendelse af de Gentra AutoPure kemiske som beskrevet ovenfor.

To master blandinger af PCR-reagenser blev fremstillet, en med T-primerparret, den anden med S primerparret. Femten mikroliter af T masterblandingen blev sat til hver prøvebrønd, styre godt og standardkurve brønd i den første plade og 15 pi af S masterblandingen blev sat til hver prøvebrønd, styre godt og standardkurve brønd i den anden plade.

For hver prøve analyseret, tre identiske 5 pi prøver af DNA-prøven (15 ng /aliquot) blev tilsat til pladen 1 og en anden 3 portioner blev tilsat til den samme brønd position i pladen 2. For hver standardkurve blev en reference-dna-prøve serielt fortyndet i TE med 1: 2 gange pr fortynding til at producere seks koncentrationer af DNA spænder fra 0,78 til 25 ng /pl.

Fem mikroliter af hver koncentration blev fordelt til standardkurven brønde på hver plade. Pladerne blev derefter forseglet med et transparent klæbemiddel dæksel, centrifugeret kort ved 800 g og transporteret på is til ABI 7900HT instrument til analyse.

T og S PCR’er blev fremstillet identisk med undtagelse af oligonukleotidprimerne. De endelige koncentrationer af reagenserne i PCR var 20 mM Tris-HCI, 0,2 mM af hver dNTP, 2,0 mM MgCl², 1% DMSO, 150 nM ROX dye, 0,2X Sybr Green I (Molecular Probes), 5 mM DTT, 1,25 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). De endelige telomer primerkoncentrationer var tel 1b, 600 nM; tel 2b 900 nm. Styringen genet (B2-globin på kromosom 11) koncentrationer var HBB1 300 nm; HBB2 700 nm. Primersekvenserne (skrevet 5 – 3′) var tlf 1b: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT;

tlf 2b: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT;

HBB1: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC;

HBB2: CACCAACTTCATCCACGTTCACC.

Alle PCR’er blev udført på ABI Fast Real-Time 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). De termiske betingelser cyklus for begge primere par begyndte med en 95 ° C inkubation i 10 minutter for at aktivere AmpliTaq Gold DNA-polymerase. For telomer PCR, var dette efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder, 54 ° C i 2 minutter. På HBB PCR, var dette efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder, 58 ° C i 60 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. Dataene blev derefter analyseret med ABI SDS software til at generere standardkurve for hver plade.

Metode til ABI 7900HT hjælp SYBR Green Dye 1

SYBR Green 1 dobbeltstrenget Binding Dye binder ikke-specifikt til dsDNA og genererer en excitation emissionsprofil. Til kvantitativ PCR, blev SYBR Green 1 anvendes med en passiv henvisning farvestof (ROX). Den 7900HT instrument analyserede cyklus til cyklus ændring i fluorescenssignal som følge af amplifikation under et PCR. Under normal amplifikation af PCR-produktet tre regioner karakterisere progression af PCR.

telomer længde analyse

telomer længder målt ved PCR ofte rapporteret som et forhold mellem telomer (T) og standard gen (S) målinger (T /S). Som basepar længde er intuitivt lettere at forstå, blev forholdene omdannet til basepar længde anvendelse af en tidligere valideret formel rapporteret med teknikken ved Cawthon beskrevet ovenfor [14]. Resultaterne af statistiske tests sammenligner grupper er ens om der anvendes T /S-forhold eller telomer længde. Som basepar længde er intuitivt lettere at forstå, blev Southern blots udført for at bestemme telomer restriktionsfragment (TRF) længde på en delmængde af deltagere (n = 16) og en lineær regression blev anvendt til at sammenligne TRF længde til T /S-forhold , hvilket resulterer i følgende ligning: bp = [T /S] * 1470,8 + 7674,5 hvor 1470,8 repræsenterer hældningen af ​​linien sammenligne den relative T /S-forhold på måling af telomer længde i basepar ved den gennemsnitlige TRF og 7674,5 er y-aksen.

p53 mutation analyse

Tilstrækkelige mængder af tumor-DNA var tilgængelig fra 17 af de 19 tumorer at teste for somatiske p53 mutationer.

PCR-amplifikation blev udført i et totalt volumen på 12,5 pi indeholdende 5 ng af genomisk DNA, hver primer ved 0,2 mM, dNTP 0.2 mM, 2,0 mM MgCl

2, 0,5 U Taq-polymerase (AmpliTaq guld, Applied Biosystems, CA) med PCR reaktion buffer tilvejebragt af producenten. Denaturering HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (DHPLC) analyser efterfulgt af direkte sekventering af PCR-produkterne blev udført som tidligere beskrevet (14). Salg

kodende sekvens, og splice junction lokaliteter af

TP53

exoner 5-8 var PCR-amplificeret ved hjælp 4 par intron primere som følger:

Exon5F 5’GCC GTC TTC CAG TTG CTT 3 ‘

Exon5R 5′ CAA CCA GCC CTG TCG TCT CT 3 ‘

Exon6F 5 ‘GGG GCT GGA GAG ACG ACA 3’

Exon6R 5 ‘TCC TCC CAG AGA CCC CAG TT 3’

Exon7F 5’CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA 3 ‘

Exon7R 5’AGG GGT CAG CGG CAA GCA GA 3′

Exon8F 5 ‘AAA TGG GAC AGG TAG GAC 3’

Exon8R 5 ‘AAG TGA ATC TGA GGC ATA AC 3 ‘

Alle PCR-reaktioner blev udført i et 25 pi reaktionsvolumen bestående af 10X PCR-buffer II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2 mM MgCl2, 2,5 mM hver dNTP, 10 pM af hver primer, 0,75 enheder Taq-DNA-polymerase AmpliGold (Applied Biosystems, Foster City, CA), og 10 ng template-DNA. PCR blev udført under anvendelse af en Tetrad thermocycler (MJ Research, Waltham, MA) med følgende betingelser: indledende denaturering ved 94 ° C i 9 minutter, efterfulgt af 35 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, (58 ° C i 30 sekunder exonerne 5,6,7) og (55 ° C i exon 8), 72 ° C i 45 sekunder, og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter. PCR-produkterne blev kørt på en 2% agarose kontrol gel. PCR-produkter blev fremstillet til DNA-sekventering som følger: 5 pi PCR-produkt med 1 pi hver exonuklease og 10X reje-alkalisk phosphat TUF-buffer, og modtog en Tetrad termisk cyklusapparat med følgende betingelser: 37 ° C i 15 minutter, 80 ° C i 15 minutter. 1,6 pmol af primer sammen med skabelonen blev sekventeret på ABI PRISM ™ 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA 94404) i Core Facility. Mutation Surveyor Software (SoftGenetics LLC, State College, PA) blev anvendt til at analysere resultaterne.

Vurdering af telomerase aktivering i CRC

Telomerase aktivitet blev målt ved hjælp af trapez

TM telomerase afsløring kit. (Chemicon International). Macrodissected tumorvæv blev homogeniseret i 200 pi 1x CHAPS lyseringsbuffer, derefter inkuberet i 30 minutter på is og centrifugeret ved 4 ° C og 12000 g i 20 minutter. Til 2,0 pi af denne supernatant, 5,0 pi 10X TRAP-buffer, 1,0 pi af en blanding af 10x d-NTP’er, blev 1,0 pi TS primerblanding og 0,4 pi TaqDNA polymerase tilsat til et totalvolumen på 50 pi. Telomer forlængelse ved 30 ° C i 10 minutter blev efterfulgt af 30 PCR-cykler ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. 10 pi af PCR-produktet blev kørt på en 12% polyacrylamidgel og farvet med SYBR

TM guld (Molecular Probes, Eugene, OR). Gelen blev fotograferet med en UV-transilluminator og stigen. Telomerase-aktivitet blev udtrykt som bandet forholdet mellem stigen af ​​PCR-produktet og intern kontrol.

Vurdering af ALT

telomert C-Circle-DNA er delvist enkeltstrengede telomer DNA kredse specifikke for celler udstiller ALT [15]. C-kredse blev vurderet i tumor-DNA ved hjælp af isotermisk forstærkning af C-cirkel komplementære streng og hybridisering med

32P (CCCTAA)

3 sonde af Capital Biosciences (Capital Biosciences, Maryland, USA). En DNA-prøve blev kaldt ALT + hvis der blev detekteret C-kredse. C-cirkler er ekstrakromosomalt telomert DNA består af delvist dobbeltstrengede telomere cirkler med en delvis dobbeltstrenget telomert DNA med en kontinuerlig C rig streng og ufuldstændig G rige streng. C-kredse er stærkt forbundet med tilstedeværelsen af ​​ALT [15].

Analytisk tilgang

At etablere CIN status baseret på kromosomale gevinst eller tab, blev analyseret i R ved hjælp af aCGH pakke fra biologisk leder [16].

Filtrering skete med at fjerne unmapped kloner, kloner kortlægning til Y-kromosomet, og kloner mangler i mere end 25% af forsøgspersonerne. Vi derefter imputerede manglende observationer ved hjælp af en LOWESS tilgang. Fraktionen af ​​deltagere med gevinster eller tab af hver klon blev afbildet ved kromosom nummer og placering ved CIN status (fig S1).

Desuden blev Wilcoxon test anvendes til at vurdere forskellen i CRC tumor telomerlængde mellem: 1) CIN + og biografstørrelse rektal cancer, 2) ALT + og Alt- prøver, og 3) telomerase + og telomerase- prøver [17]. Chi-squared test eller Fishers eksakte test blev anvendt til at evaluere associationen mellem ALT status og CIN status, og mellem telomerase aktiveringsstatus og CIN status. Spearman korrelation mellem endetarmskræft tumor telomer længde og procentdelen af ​​klon med gevinst eller tab blev beregnet.

Resultater

Array CGH evinced omfattende variation i DNA-kopi nummer ændrer

Vi studerede 19 unge debuterende MSS rektal kræft for tegn på CIN hjælp aCGH består af omtrent 3000 BACs. Vi viste, at der MSS rektale tumorer, der har meget lave niveauer af DNA-kopital ændringer. Seks tumorer (32%) havde lave niveauer af kromosomal forstyrrelser med 1% til 17% af de kloner med DNA kopital ændringer og blev klassificeret som biografstørrelse af aCGH. Tretten tumorer (68%) havde 20% af kloner, der viser DNA-kopi nummer ændringer og blev klassificeret som CIN + gruppen. MSS biografstørrelse tumorer havde 0 til færre end 5 kromosomale arme, der blev fuldstændig vundet eller tabt, sammenlignet med CIN + gruppe, der havde 8 til 18 kromosomale arme viser komplet gevinst eller tab (Figur S2).

Fraktion af gevinster eller tab i CIN + og biografstørrelse endetarmskræft

brøkdel af deltagere med gevinster og tab pr kromosomal region for patienter med CIN + endetarmskræft sammenlignet med dem med biografstørrelse endetarmskræft vises i figur S1. Forskelle i gevinster eller tab blev observeret i hele genomet, med de mest markante forskelle i kromosomerne 13, 17 og 18. CIN + endetarmskræft havde flere gevinster /tab end biografstørrelse endetarmskræft (gennemsnit: 33,1 vs 9,7, p = 0,0007, tabel 1 ).

CIN +

biografstørrelse

Mean (SD) eller% Middel (SD) eller% p-valueFraction gevinster /tab, betyder (SD) 33,08 (8,76) 9,66 (7,92) 0,0007 telomer længde, gennemsnitlige (SD) 8211 (308) 9178 (1396) 0.0066Telomerase0.0949 Yes80.0% 25,0% No20.0% 75,0% ALT0.2335 Yes50.0% 100,0% No50.0% 0,0% p530.3348 Yes36 0,4% 66,7% No63.6% 33,3% tabel 1. Karakteristik af CIN + og biografstørrelse endetarmskræft

tyktarms kræft tumorer evalueret med vifte CGH blev klassificeret som en) biografstørrelse hvis . 20% af kloner viste DNA-kopi nummer ændringer eller som 2) CIN + hvis ≥ 20% af kloner viste DNA kopi nummer ændringer. CIN + CRC havde et større antal sager, der udstillede gevinster og tab pr kromosomal region i forhold til dem af biografstørrelse CRC. CIN + CRC har betydeligt kortere tumor telomerer (8211 bp) end biografstørrelse CRC (9178 bp; p = 0,0066). CIN + tumorer var mere tilbøjelige til at vise aktivering af telomerase end var biografstørrelse CRC, selvom der var ingen sammenhæng med CIN status af en tumor, og hvor ofte en tumor brugt alternativ forlængelse af telomerer som telomer vedligeholdelse mekanisme (p = 0,2335). Tilstedeværelsen af ​​p53-mutationer korrelerede ikke med CIN status af tumoren (p = 0,3348). CSV Hent CSV

telomer længde i CIN + og biografstørrelse endetarmskræft

endetarmskræft telomer længde var signifikant associeret med CIN status, således at biografstørrelse endetarmskræft havde længere telomerer end CIN + endetarmskræft (p = 0,0066, Figur 1). Telomer længde var også signifikant korreleret med den procentdel af kloner med gevinster eller tab (r = -0,50, p = 0.0310).

Panel A: telomer længde tumor DNA i kromosomalt stabil (biografstørrelse) endetarmskræft er væsentligt længere end for kromosomalt ustabile (CIN +) endetarmskræft (p = 0,0066). CIN status bestemmes som biografstørrelse hvis fra 20% af kloner viser DNA-kopi nummer gevinster eller tab. Endetarmskræft er CIN +, hvis mere end 20% af kloner har gevinst eller tab.

Panel B: Aktivering af telomerase (Telomerase +) i endetarmskræft korrelerer med kortere tumor telomer længde end i tumorer, der ikke udnytter telomerase (Telomerase -) som en telomer vedligeholdelse mekanisme (p = 0,0040)

Blandt biografstørrelse tumorer, telomerer var længere i tumor-DNA sammenlignet med deres tilsvarende normale epitelcelle DNA. I modsætning hertil telomerer i CIN + tumor-DNA var kortere end i tilsvarende normale epitel DNA. (P = 0,0039).

Vi evalueres yderligere, om forskelle i telomer længde eller CIN status kan være relateret til aktivering af telomerase eller ALT. Vi observerede, at tumorer med kortere telomerer var mere tilbøjelige til at have aktivering af telomerase (p = 0,0040, Figur 1, panel B) gjorde, men tumor telomer længde ikke korrelerer med tilstedeværelsen af ​​ALT (p = 0,4923; Tabel 2). CIN + tumorer var mere tilbøjelige til at vise aktivering af telomerase end var biografstørrelse tumorer (p = 0,0949; Tabel 1], men der var ikke en forskel i gevinster /tab mellem CRC med telomerase aktivering og CRC uden telomerase aktivering (p = 0,3168; Tabel 1 .) Det modsatte var tilfældet med hensyn til ALT biografstørrelse tumorer var så sandsynligt som CIN + tumorer at vise tegn på ALT (p = 0,2335;. tabel 1) om disse tumorer, der var ALT- havde flere gevinster /tab end ALT + CRC (betyder : 39,3 vs 22,6, p = 0,0091, Figur 2, tabel 2) tumorer, der forlængede telomerer via udstillet C-Circle dannelse ikke er til stede i Alt- tumorer (figur 3)

telomerlængde

Fraktion Gevinster.. /Tab

Mean (SD)

p-værdi

Mean (SD)

p-værdi

CIN Status0.00660.0007 CIN + 8211 (308) 33,1 (8,8) biografstørrelse 9178 (1396) 9,7 (7,9) Telomerease0.00400.3168 Yes8193 (295) 28,8 (14,3) No9307 (1512) 19,2 (16,4) ALT0.49230.0091 Yes8676 (1208) 19,6 (13,5) No8226 (397) 38,7 (7,9) p530.54140.7726 Yes8443 (370) 26,3 (17,0) No8676 (1281) 22,9 (12,0) tabel 2. telomerlængde og fraktion af klon gevinster /tab ved tumor egenskaber.

endetarmskræft tumorer evalueret med vifte CGH blev klassificeret som en) biografstørrelse hvis 20% af kloner viste DNA kopi nummer ændringer eller som 2) CIN + hvis ≥ 20% af kloner viste DNA kopi nummer ændringer. Tumorer med kortere telomerer var mere tilbøjelige til at være CIN + (p = 0,0066), og at have aktiveret telomerase (p = 0,0040). Hverken tilstedeværelsen af ​​alternative forlængelse af telomerer (ALT) (p = 0,4923), eller tilstedeværelsen af ​​p53 mutation status korreleret med tumor telomer længde (p = 0,5414). CIN + endetarmskræft havde en højere brøkdel af kloner, der viste gevinster og tab end biografstørrelse tumorer (p = 0,0007). Tumorer med eller uden aktivering af telomerase ikke havde en signifikant forskellig brøkdel af gevinster eller tab på kloner (p = 0,3168). Men for tumorer udviser ALT den del af gevinster og tab på kloner var lavere end for tumorer med ingen beviser ALT (p = 0,0091) .Ingen forskel ses i den del af klon eller -tab tumorer med vores uden p53 mutationer ( p = 0,7726). CSV Hent CSV

Tumorer, der var ALT- udstillet betydeligt mere kromosomal gevinster /tab end ALT + endetarmskræft (p = 0,0091).

Panel A. Hematoxylin og eosin vævssnit fra en MSS biografstørrelse , ALT +, Telomerase- endetarmskræft (til venstre) og fra MSS CIN +, ALT-, Telomerase + endetarmskræft. Begge er moderat differentierede adenocarcinomer. Den kirtel-til-stroma-forholdet er højere i ALT + /tele- tilfælde, og det har mindre desmoplastiske stroma.

Panel B. Dot /blot, der viser tilstedeværelse af C-kredse. C cirkler, ekstrakromosomalt telomert DNA, er stærkt forbundet med ALT. Vurderet i tumor-DNA med termostatstyret forstærkning af C-cirkel komplementære streng og hybridisering med

32P (CCCTAA)

3 sonde af Capital Biosciences (Capital Biosciences, Maryland, USA), blev en prøve kaldet ALT + hvis C-cirkler blev påvist. Den ALT +, telomerase negativ tumor i venstre havde 10% af BAC kloner viser afvigende hybridisering og er klassificeret som et biografstørrelse tumor. ALT – ,, telomerase positiv tumor på højre havde 40% af kloner med afvigende hybridisering og er klassificeret som et CIN + tumor.