PLoS ONE: Kræft stamcelle-lignende celler fra malignt perifer nerve kappe tumorer

Abstrakt

Denne undersøgelse har til formål at undersøge, om der findes cancer stamceller i maligne perifere nerve kappe tumorer (MPNST). Celler af etablerede linjer, primære kulturer og frisk dissekerede tumorer blev dyrket i serumfrit betingelser suppleret med epidermale og fibroblastvækstfaktorer. Fra en etableret human MPNST cellelinie, S462, celler, der opfylder kriterierne for cancer stamceller blev isoleret. Klonale sfærer blev opnået, hvilket kunne passeres flere gange. Berigelse af stamcelle-lignende celler i disse områder blev også støttet af øget ekspression af stamcelle markører såsom CD133, Oct4, Nestin og NGFR og nedsat udtryk for modne cellemarkører såsom CD90 og NCAM. Endvidere celler af disse klonale S462 sfærer differentieret i Schwann-celler, glatte muskelceller /fibroblast og neuroner-lignende celler under specifikke differentieringsinducerende kulturelle forhold. Endelig subkutan injektion af kuglerne i immundefekte nøgne mus førte til tumordannelse på en højere sats i forhold til forældrenes adhærente celler (66% mod 10% ved 2,5 × 10

5). Disse resultater beviser for eksistensen af ​​cancer stamceller celle-lignende celler i maligne perifere nerve kappe tumorer

Henvisning:. Spyra M, Kluwe L, Hagel C, Nguyen R, Panse J, Kurtz A, et al. (2011) Cancer Stem Cell-lignende celler Afledte fra malignt Perifere nerver Skede tumorer. PLoS ONE 6 (6): e21099. doi: 10,1371 /journal.pone.0021099

Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: December 22, 2010; Accepteret: 20 maj 2011; Udgivet: 13 juni 2011

Copyright: © 2011 Spyra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev delvist understøttet af en bevilling fra det amerikanske forsvarsministerium neurofibromatosis program (W81XWH-07-0359 til SDR) og “Bundesministerium für Bildung und Forschung” (BMBF) (01GM0480 til AK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ondartede perifere nerve kappe tumorer (MPNSTs) er bløddelssarkomer skyldes perifere nerver og har høje lokalt recidiv og hæmatogen metastaser [1]. De tegner sig for 10% af alle bløddelssarkomer. Halvdelen af ​​disse maligniteter forekomme hos patienter med neurofibromatosis type 1, et tumorsuppressorgen syndrom med en incidens på ca. 1 i 3000. MPNST, specielt i forbindelse med neurofibromatosis type 1, er en af ​​de mest aggressive maligniteter hos mennesker med en yderst dårlig prognose [2].

Resultaterne af nyere undersøgelser tyder på, at mange maligne tumorer indeholder celler med egenskaber af stamceller, herunder selvfornyelse, klonalitet, multipotency, og høje tumordannelse i immunsvækkede mus [3], [4 ]. Ligesom embryonale stamceller, er cancer stamceller postuleret, at lægemiddelresistente [5], [6]. I vores seneste kliniske forsøg ved hjælp imatinibmesylat, en tyrosinkinasereceptor inhibitor, flere patienter med MPNST viste oprindeligt lovende reaktioner som deres tumorer skrumpet til meget små kerner. Men tilbagefald forekom i alle tilfælde, og de tilbagevendende tumorer svarede ikke til den oprindelige terapi flere (upublicerede observationer). Muligvis, en lille del af stamcellelignende celler undgik terapi og førte til tilbagefald

Mens cancerstamceller er blevet rapporteret og omfattende undersøgt i en række faste tumorer [7] -. [9], de endnu ikke er blevet identificeret i MPNSTs. I den foreliggende undersøgelse testede vi den hypotese, at MPNSTs også indeholde stamcellelignende celler, som kan beriges

in vitro

. De stamceller celle-lignende celler fra en etableret human MPNST cellelinie, S462, blev yderligere karakteriseret

in vitro

,

in vivo

og molekylært.

Materialer og metoder

Patienter og tumorer

diagnosen neurofibromatosis type 1 blev foretaget ifølge National Institute of Health diagnostiske kriterier [10]. MPNST tumorer (n = 12), plexiform (n = 3) og kutane neurofibromer (n = 3) opnået det meste fra de kirurgiske og Maxillofacial kirurgiske afdelinger af University Medical Center Hamburg-Eppendorf og nogle fra neurofibromatosis Clinic, München. Den opnåelse af tumorer blev godkendt af den lokale Review Board (Hamburg Ärztkammer, OB-011/07), og alle patienter gav skriftligt samtykke. Umiddelbart efter kirurgisk fjernelse, prøverne blev placeret i Hanks saltvand (Gibco, Paisley, UK). En del af hver prøve blev anvendt til at bekræfte den patologiske diagnose af tumoren (Institute of Neuropathology, University Hospital Hamburg-Eppendorf). En anden del blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Det resterende væv blev anvendt til celledyrkning.

Cellekultur

Celler af etablerede MPNST cellelinier S462 og S1507-2 blev dyrket under standardbetingelser med serum [11]. Dissociation og dyrkning af celler fra frisk resektion MPNSTs var som beskrevet tidligere [11].

Berigelse af stamceller celle-lignende celler

Celler af etablerede linjer, primære kulturer og frisk dissocierede tumorer blev dyrket under stilken celle forhold i stamcellemedium (SCM) består af Neurobasal medium (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) med human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF, 20 ng /ml, R hvis væsentligt, blev post-hoc sammenligninger bruger Dunns test. Stigningen i antallet af proliferative celler over tid blev analyseret ved anvendelse af en ikke-parametrisk gentagne målinger ANOVA; hvis væsentligt, blev post-hoc sammenligning i Tukeys test udført. Den samme test blev udført for at sammenligne en stigning i proliferation af CD133 positive og negative kugler over tid. Forskelle i den relative mængde af cDNA analyseret ved RT-PCR, og ændringer i procentdelen af ​​positive celler i parentale adhærente celler og kugler analyseret ved flowcytometri, blev testet under anvendelse af ikke-parametriske Mann-Whitney U-test. Forskelle i frekvensen af ​​tumordannelse mellem mus injiceret med adhærente celler og kugler henholdsvis blev beregnet ved Chi-square test. Alle midlede værdier er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Værdier blev betragtet som signifikante, når p. 0,05

Resultater

Sphere dannelse fra MPNST celler

For at undersøge, hvorvidt MPNSTs indeholder stamceller-lignende celler, celler fra 2 etablerede linier og 12 dissekerede tumorer blev dyrket i serumfrit medium indeholdende EGF og FGF. Kugler eller sfære-lignende aggregater blev opnået fra de to cellelinier og 10 ud af 12 dissekeret friske tumorer. Sfærer dannet ved lav densitet, så lavt som en celle per brønd, og opformeret i mindst 20 passager fra den etablerede MPNST cellelinie S462. Kugler eller kugle-lignende aggregater blev også opnået fra et andet etableret MPNST linje (S1507-2) og fra primære MPNST celler og frisk dissekerede MPNSTs; men de overlevede kun i 2 til 12 passager, og kunne ikke opnås ved celledensiteter under 100 celler pr. Tilsvarende kugler eller sfære-lignende aggregater blev også opnået fra primære kulturer afledt af plexiform neurofibromer og kutane neurofibromer, men kunne ikke passeres mere end to gange. Yderligere eksperimenter således fokuseret på kugler af S462.

In vitro karakterisering af MPNST S462 kugler

Forældrekontrol MPNST S462 celler passage 35, som under standard medium betingelser med serum vokse adhærent, dannet flydende kugler efter 2 dage under stamcellelinjer betingelser (figur 1A, B;. adhærente S462 celler henvise til den parentale S462 cellelinie). Proliferation af celler i sfærerne viste, at disse var ikke blot aggregater (fig. 2A). Når disse primære sfærer blev dissocieret og cellerne udpladet ved ekstremt lav densitet i brønde i en plade med 96 brønde, blev sekundære kugler opnået i 16,7% ± 2,4 af brønde indeholdende enkeltceller. Hyppigheden af ​​kugle-dannelse fra enkeltceller øges, når kuglerne blev passeret yderligere (fig. 2B). Klonale kugler blev også opnået fra vedhængende S462 celler i meget tidlig passage 2, med en højere frekvens af primær sfære dannelse 31,86% ± 2,50, næsten dobbelt så høj som med vedhængende S462 celler passage 35. Til dato har MPNST S462 sfærer været passage under klonede betingelser end 20 gange.

(A) Forældrekontrol S462 celler under standard dyrkningsbetingelser med serum vokse adhærent (passage 35). (B) Flydende sekundær sfære efter to uger under stamceller vilkår uden serum. Kuglen blev afledt af en enkelt celle og således var klonal. Barer = 20 pm.

bromdeoxyuridin inkorporering assay viste spredning af S462 celler i klonale kugler (sekundære kugler). Stigningen i celle absorbans var signifikant for 8, 10 og 15 dage i SCM versus 3 dage (p 0,01 **). Ændringer i hyppigheden af ​​kugle dannelse i brønde indeholdende enkelte celler oprindeligt fra vedhængende S462, derefter fra dissocierede sfærer forgyldt som enkelte celler og passeret hinanden. Stigningen i hyppigheden af ​​kugle formation med stigende passage var signifikant (passage 1 (primære sfærer) versus passager 10 (10

th kugler) og 12 (12

th kugler), P 0,01 **, passage 2 ( sekundære kugler) versus passager 10 (10

th kugler) og 12

th kugler), P 0,05 *)

opregulering af stamceller markører og nedregulering af moden. cellemarkører i S462 sfærer

Real-Time PCR afslørede opregulering af stamcellemarkører nestin, NGFR, Oct4, Notch4, Sox2, CD133 og Sox9 i S462 sfærer af passager mellem 13 og 16, i forhold til S462 adhærente celler holdes under SCM dyrkningsbetingelser i 14-16 timer (fig. 3A, venstre). I modsætning hertil blev EGF-receptor (EGFR) og NCAM, en markør for umodne Schwann-celler, udtrykt ved lavere niveauer i S462 sfærer end i deres parentale adhærente celler (fig. 3A, højre).

(A) Fast -Time PCR. Ekspression af hver markør i kuglerne blev normaliseret mod udtryk for samme markør i omliggende S462 celler. Spheres på passager mellem 13 og 16. * p 0,05; adhærerende versus sfære transkript ekspression (Nestin, NGFR, Oct4, Sox2, CD133, Sox9, EGFR og NCAM). (B) Flowcytometri. Ændringer i procentdelen af ​​celler, der udtrykker moden og stamceller progenitor markører i adhærente celler og i områder (passager 8 og 13), CD133 og NCAM vedhængende versus sfærer p 0,05 *, CD34 og CD90 vedhængende versus sfærer p 0,01 **, NGFR og Nestin adhærerende versus sfærer p 0,01 ***. EGFR, epidermal vækstfaktor receptor; NGFR, nervevækstfaktorreceptor; NCAM, celleadhæsionsmolekyle.

Flowcytometri afsløret forøget ekspression af neurale crest markører NGFR, CD133 og nestin på områderne i forhold til forældrenes klæbende S462 celler (Fig. 3B). Andelen af ​​celler, der udtrykker CD34 blev også forøget i sfærerne til ca. 50%. Derudover er omkring 60% af NGFR positive population co-udtrykkes-CD133 i adhærerende S462 og i sfærerne (66,84 ± 10,82% adhærente versus 60,81 ± 12,21% kugler, ikke signifikant), (fig. 4). Omvendt blev CD90 og NCAM udtrykt mindre hyppigt i S462 sfærer end i adhærente celler (fig. 3B).

Side og forward scatter analyse af adhærente celler (venstre kolonne) og kugler (ved passage 8, højre spalte) viste forskellige typer af celler. Levende celler blev gated i R1 (øverste paneler), og gatings for NGFR (R2) positive celler (midterste paneler) er vist i orange. NGFR-positive celler (repræsenteret i orange) inden for de CD133-positive celler viser co-ekspression af CD133 /NGFR (lavere paneler). NGFR celler co-udtrykkende CD133 er sjældne i det vedhængende celle befolkning og steg i sfærer. Isotypekontroller for alle antigener blev anvendt til at etablere de kvadranter til negative populationer. NGFR, nervevækstfaktorreceptor.

højere frekvens af S462 sfære dannelse og spredning i CD133 + -celler

Brug magnetisk perle-baserede sortering, vi beriget CD133 positive og negative celler fra serummet -cultured adhærente S462-celler (passage 35) til 90 og 80%, henholdsvis, og dyrket dem separat i SCM ved lav celletæthed. Flere kugler dannet i CD133 + population sammenlignet med CD133- population (35.21% versus 18,35%). Hertil kommer, celler i CD133 + kugler spredt hurtigere end i de CD133- kugler (absorbans ved 405 nm på 0,7 ± 0,047 versus 0,39 ± 0,0312, s 0,001).

S462 kugler er i stand til afstamning differentiering

for at vurdere potentialet for multilineage-differentiering, kloning afledte sfærer og vedhængende S462 celler fra passage 35 var begge dyrket i medium indeholdende serum, der inducerer differentiering. Efter to til tre uger, blev ekspression af S100 observeret i et lille antal celler fra S462 klonale sfærer, som angiver afstamning differentiering til Schwann-celle-lignende celler. I modsætning hertil blev ekspression af denne markør ikke observeret i de adhærente S462 celler (data ikke vist). Mere end 50% af cellerne fra de klonale sfærer udtrykt Nestin når dyrket i serumholdigt medium, sammenlignet med ingen af ​​de adhærente S462 celler (data ikke vist).

Tilføjelse neuregulin og forskolin inducerede specifik differentiering til S100 + Schwann celler i næsten alle celler af klonale S462 sfærer, men kun en lille del af adhærente S462-celler var virkelig positive for S100 og viste svag forskellig morfologi (fig. 5A). Bi-polar morfologi af S100 + Schwann-celler differentieret fra klonale kugler (fig. 5A, D) var lig med den for Schwann-celler afledt fra en plexiform neurofibroma (fig. 5A insert). Disse differentierede celler fra klonede kugler udtrykte også Schwann cellemarkører neurofilament og NGFR (fig. 5A), klæbende celler udtrykte neurofilament men meget sjældent NGFR (data ikke vist).

klæbende celler (venstre kolonne) og dissocierede sfære celler (højre søjler) blev dyrket med vækstfaktorer inducere differentiering i celler ligner (A) Schwann-celler, (b) SM /Fb og (C) neuroner, som er positivt farvet for S100 /NGFR /neurofilament (Schwann-celler), SMA ( SM /Fb), og MAP-2 (neuroner), hhv. Indsæt i A illustrerer S100 + Schwann-celler afledt fra en plexiform neurofibroma kultur. (D) fase kontrast mikrografer fra differentierede celler under 3 dyrkningsbetingelser at generere Schwann celle, SM /Fb og neuron-lignende celler. Differentierede celler er angivet med pile og ikke-differentierede celler ved pilespidser. Bars = 20 pm. NGFR, nervevækstfaktor; SMA, glatmuskelactin; MAP-2, mikrotubulus-associeret protein-2; PNF, pleksiforme neurofibrom; LC, ligesom-celler.

Ligeledes udsættelse for bFGF og transformerende vækstfaktor-SS1 inducerede specifik differentiering til SM /Fb-lignende celler i en stor del af cellerne fra klonale S462 kugler, mens kun få S462 adhærente celler viste glatmuskelactin ekspression og fibroblastoid morfologi (fig. 5B, D).

Endelig cyklisk AMP og retinsyre induceret neurogen afstamning differentiering i celler fra klonale sfærer, som de udtrykte MAP-2 og udviste neuron-specifik morfologi såsom store cellelegemer og neuritter (fig. 5C, D). I modsætning hertil mens klæbende celler udtrykte MAP-2 under de samme kulturelle forhold (fig. 5C), disse celler ikke udviser neuron-lignende morfologi.

In vivo karakterisering af S462 sfære celler

subkutan injektion af 2,5 x 10

5 celler af klonale S462 kugler (n = 9) førte til synligt fast tumor formation 1 til 3 måneder efter injektion i 66% af nøgne mus. I modsætning hertil kun påviselige faste tumorer dannet i 10% af nøgne mus (n = 10), når det samme antal adhærente S462-celler blev injiceret, at denne tumor nødvendig over tre måneder dannelse (fig. 6A). Histologisk tumorer fra både vedhæftende celler og kugler udviste typiske karakteristika for MPNST:. Spindel formet, stærkt proliferative som vist med høje antal af Ki67-positive celler, og S100 negative tumorceller (figur 6B)

(A) Frekvens og tidspunkt for tumordannelse med 2,5 × 10

5 adhærerende (n = 10, passage 35) eller klonal sfære S462 (n = 9), CD133

+ (n = 9) og CD133

– (n = 5) celler injiceret subkutant. Alle kugle celler blev opnået mellem passager 8 og 13. Tilhænger versus sfærer og vedhængende versus CD133 + kugler p 0,05 *. (B) Histologi af tumorer afledt af adhærente celler (venstre panel) og sfære celler viste, at disse tumorer ligne MPNSTs. H og højere antal celler (5 x 10

6, n = 7) førte til synlige tumorer i kun 14% af musene og ca. 2 måneder efter injektion.

Når tumorerne fra mus blev frisk dissocierede og forgyldt som enkelte celler i stamcelle-dyrkningsbetingelser, runde kugler dukkede inden for to dage (fig. 6C). Disse kugler kunne dyrkes klonalt i de efterfølgende passager. Hyppigheden af ​​kugle dannelsen af ​​celler fra tumorer dyrket i mus var ca. 32%, højere end den for adhærente S462 celler ved passage 35 (som var ca. 17%), mens der kan sammenlignes med adhærente S462 celler ved passage 2, som var omkring 31%.

diskussion

i denne undersøgelse har vi anvendt dyrkningsbetingelser optimeret til neurale stamceller, til berigelse af cancer stamceller-lignende celler fra MPNSTs. Det lykkedes at opnå og berigende sådanne celler fra en etableret MPNST cellelinie, S462, og dermed vist, at der findes cancer stamceller-lignende celler i MPNST. Kugler kunne opnås fra enkelte MPNST S462-celler, hvilket indikerer, at de er sande prolifererende sfærer og ikke aggregater af celler. Sfærer blev også opnået fra primære S462 ved passage 2, med en endnu højere frekvens. Det er derfor usandsynligt, at stamceller-lignende celler, vi opnåede, beriget og studerede er en artefakt af langsigtede kultur.

Vi kunne ikke skaffe klonale sfærer, der kunne passeret fra en anden MPNST cellelinje, flere primære MPNST kulturer, frisk dissekerede tumorer eller plexiform og kutane neurofibromer [12]. MPNST tumorer er klinisk, genetisk og histopatologisk meget heterogen [1]. Det er muligt, at kun S462 linje, som var afledt af en meget aggressiv og tilbagevendende tumor, indeholder en passende andel af stamcellelignende celler, som er umodne nok til at muliggøre dannelse af klonale kugler under de valgte betingelser. Kugler fra nogle andre MPNSTs kunne passeres ved højere densiteter op til 12 gange, hvilket indikerer en vis stamcelle-lignende potentiale. næppe vil være optimalt for cancer stamceller-lignende celler i MPNST Dyrkningsbetingelserne vi anvendte i dette studie. Dette kan også afspejle sig i vanskelighederne med at etablere permanente kulturer fra friske tumorer, selv i standard dyrkningsbetingelser med serum ([14].

S462 celler udtrykte en række stamceller eller stamceller markører, herunder Nestin, NFGR CD133 og CD34 i varierende grad, hvilket tyder på, at disse celler er mindre differentieret og mere umoden. Angivelse af disse markører blev væsentligt forøget i klonede sfærer understøtter vores hypotese om, at stamceller-lignende celler beriget med sfærer. CD133 + S462 kugler havde en højere frekvens af dannelse sfære

in vitro

og tumordannelse i mus sammenlignet med CD133- sfærer. Denne markør således markerer cancer stamceller-lignende celler i MPNST til en vis grad, men ikke udelukkende.

crista neuralis stamceller celler har evnen til at forny sig selv og differentiere til en række slægter, herunder neuroner, glia, og myofibroblasts [15], [16]. i nærvær af respektive vækstfaktorer, celler af MPNST S462 klonale kugler differentierede til celler ligner Schwann celler, SM /Fb og neuroner. En sådan afstamning differentiering var langt mindre dybtgående og mindre hyppige i omliggende MPNST celler. Disse resultater tyder på, at udifferentierede eller dedifferentierede celler, som besidder et højere potentiale for differentiering end differentierede celler, er beriget med klonede S462 sfærer. Faktisk CD34, et glycophosphoprotein, udtrykkes normalt af modne endotelceller, mesenchymale og hæmatopoietiske progenitorceller, og endnu vigtigere i neurale stamceller er også lokaliseret i MPNSTs tumorer, sandsynligvis i endoneurale fibroblaster [17], [18]. Stigningen i ekspressionen af ​​denne markør i sfærerne viser, at et stigende antal celler er forbundet med en mere udifferentieret fænotype under stamcelle anvendte betingelser. Det er også muligt, at neural stamcelle dyrkningsbetingelser inducere eller fremme dedifferentiering af S462-celler eller proliferation af stamceller-lignende celler til stede i det parentale befolkning.

selvfornyelse er en af ​​egenskaberne af stamceller-lignende celler. Stigningen i kugle formation med passage i stamcelle medier tyder på, at hyppigheden af ​​stamceller-lignende celler i sfærerne stiger med vækst, som det ville forventes, hvis disse dyrkningsbetingelser selektere for eller støtte forøget proliferation eller overlevelse af stamme-lignende celler. Derfor en berigelse af cancer stamceller i sfærer sammen med reducerede mængder af differentierede celler er den sandsynlige årsag til den øgede tumorigene potens af kugler. Interessant, som det ses i native MPNST viste muse-afledte tumorer faktisk ikke udtryk for Schwann celledifferentiering markør S100.

Vores resultater giver bevis for eksistensen af ​​stilken kræft eller stamcelle-lignende celler i MPNST. Disse celler vokse som klonale kugler til flere passager under neurale stamceller kulturelle forhold, hurtig stængel /progenitor cellemarkører og inducere tumordannelse i immundefekte nøgne mus på et væsentligt højere frekvens end klæbende celler. At studere disse celler kan bidrage til en bedre forståelse af biologi og patogenese MPNST og kan gøre det muligt at identificere specifikke mål for udviklingen af ​​behandlinger.

Tak

Vi vil gerne takke departementerne Neurokirurgisk, onkologi og neuropatologi (University Medical center Hamburg Eppendorf, Hamborg, Tyskland) for at tillade os at bruge deres faciliteter. Særlig tak går til Dr. H. Guenther (Department Neurokirurgisk), K. Kluge, A. Schaefer og C. Horn, (flowcytometri facilitet i Onkologisk Afdeling og Hematology) og M. Haberkorn (Department of Neuropatologi) for at give os videnskabelig og teknisk rådgivning. Vi er også meget taknemmelige for professor R. Friedrich, Dr. M. Blessmann (Institut for Kæbekirurgi), professor E. Yekebas og Dr. M. Bockhorn (Institut for Kirurgi) fra University Medical Center Hamburg Eppendorf og Dr. U. Wahlländer -Danek (neurofibromatosis Clinic, München, Tyskland), for at give tumoren materiale.