PLoS ONE: TIM-3 Expression Karakteriserer Regulatory T-celler i tumorvæv og er forbundet med lungekræft Progression

Abstrakt

Baggrund

T-celle immunglobulin-3 (TIM-3) er blevet etableret som en negativ regulering molekyle og spiller en afgørende rolle i immun tolerance. TIM-3 opreguleres i opbrugt CD8

+ T-celler i både kronisk infektion og tumor. Arten af ​​TIM-3

+ CD4

+ T-celler i tumor mikromiljø er uklar. Denne undersøgelse er at karakterisere TIM-3 udtrykker lymfocytter inden humane lungekræft væv og etablere kliniske betydning af TIM-3 ekspression i lungekræft progression.

Metode

I alt 51 menneskelig lungekræft væv prøver blev opnået fra patologisk bekræftet og nyligt diagnosticeret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter. Leukocytter fra tumorvæv, distale normale lungevæv, og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) blev analyseret for TIM-3 overfladeekspression ved hjælp af flowcytometri. TIM-3 ekspression på tumorinfiltrerende lymfocytter (tils) blev korreleret med klinisk-patologiske parametre.

Konklusioner

TIM-3 er meget opreguleres på både CD4

+ og CD8

+ TIL’er fra humane lungecancer væv men ubetydelig udtrykt på T-celler fra patienters perifere blod. Frekvensen af ​​IFN-γ

+ celler blev reduceret i TIM-3

+ CD8

+ TIL’er sammenlignet med TIM-3

-CD8

+ TIL’er. Niveauet af TIM-3 ekspression på CD8

+ TIL’er undladt at associere med enhver klinisk patologisk parameter. Interessant fandt vi, at ca. 70% af TIM-3

+ CD4

+ TIL’er udtrykt Foxp3 og ca. 60% af foxp3

+ TIL’er var TIM-3

+. Vigtigere er det, TIM-3 ekspression på CD4

+ T-celler korrelerede med dårlige klinisk-patologiske parametre for NSCLC såsom nodal metastaser og avancerede kræft stadier. Vores undersøgelse afslører en ny rolle TIM-3 som en vigtig immun regulator i tumoren mikromiljø via sin dominerende udtryk i regulatoriske T-celler

Henvisning:. Gao X, Zhu Y, Li G, Huang H, Zhang G Wang F, et al. (2012) TIM-3 Expression Karakteriserer Regulatory T-celler i tumorvæv og er forbundet med lungekræft Progression. PLoS ONE 7 (2): e30676. doi: 10,1371 /journal.pone.0030676

Redaktør: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus Technical University-Dresden, Tyskland

Modtaget: 13. oktober 2011; Accepteret: December 20, 2011; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er delvist støttet af NSFC (National Natural Science Foundation of China) giver 30.528.008, Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (IRT0849) og et projekt finansieret af Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitution (PapD) (til BL og XZ). BL blev delvist støttet af Young Investigator Award fra Cancer Research Institute og University of Pittsburgh Startup fond. QY understøttes af Eleven-femte Mega-videnskabeligt projekt om “forebyggelse og behandling af AIDS, viral hepatitis og andre infektionssygdomme” (2008ZX10003-012). GL og XG understøttes af et stipendium fra Kina Scholarship råd. YZ er støttet af NSFC tilskud 31170866, Jiangsu Natural Science Fund BK2011289 og Suzhou Social Development Project (SYS201009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor udvikling inducerer antitumor immunreaktioner. Type 1 adaptive immunresponser, medieret af Th1-celler og CTL’er, menes at være en vigtig del af cellemedieret immunitet mod cancer [1]. Det er blevet veletableret, dog, at mange tumorinfiltrerende T-celler er i en tilstand af ikke-modtagelighed som følge af den immunundertrykkende tumormikromiljøet [2], [3]. Regulatoriske T-celler og konsumption af effektor T-celler menes at være to vigtigste T-celle iboende mekanismer, der gør ineffektive anti-tumor immunrespons [2], [4], [5]. Flere molekylære veje, såsom TGFp, IL-10, medlemmer af B7-familien, der er involveret i oprettelse tilstanden af ​​immunsuppression inden tumor [2], [6], [7], [8]. Forståelse af den rolle af hidtil ukendte immune inhibitoriske pathways i mediering immuntolerance i tumormikromiljøet skulle kunne forbedre immunterapi af cancer.

TIM-3 udtrykkes på Th1, Th17 celler og CD8 T-celler, men ikke Th2-celler [9], [10], [11]. Interaktion mellem TIM-3 og dens ligand galectin-9 inhiberer Th1 og Th17 responser [12] og inducerer perifer tolerance [13], [14], støtter en inhibitorisk rolle TIM-3 i T-celle- responser. TIM-3-ekspression identificerer også udtømte T-celler under kronisk infektion. TIM-3-udtrykkende CD4

+ og CD8

+ T-celler producerer reducerede mængder af cytokin eller er mindre proliferativ reaktion på antigen. Blokade af TIM-3-signalvejen genskaber proliferation og forøger cytokinproduktion i HIV-1-specifikke T-celler [15]. Nylige undersøgelser har understøttet en vigtig rolle TIM-3 T-celle udmattelse i cancer. Tim-3 og PD-1, en anden markør for T-celle udmattelse, co-udtrykkes på CD8 TIL’er i mus med transplanterede tumorer samt på NY-ESO-1-specifikke CD8

+ T-celler hos patienter med fremskreden melanom [4], [5]. TIM-3

+ PD-1

+ T-celler udviser den mest alvorlige opbrugt fænotype som defineret ved manglende proliferere og at producere IL-2, TNF, og IFN-γ. Blokade af både Tim-3 og PD-1 pathways er mere effektivt til bekæmpelse af tumorvækst end målretning enten pathway alene, hvilket tyder disse to veje arbejder synergistisk etablere T-celle udmattelse [4], [5].

denne undersøgelse har vi undersøgt TIM-3-ekspression i TIL’er i ingen småcellet lungekræft (NSCLC). Vi har fundet, at TIM-3 udtrykkes i både CD4

+ og CD8

+ TIL’er i lungekræft væv. Både TIM-3

+ CD4

+ og TIM-3

+ CD8

+ T-celler produceret meget reducerede niveauer af IFN-γ sammenlignet med dem i TIM-3

-CD4

+ og TIM-3

-CD8

+ T-celler hhv. Interessant, TIM-3 ekspression på CD4

+ T-celler, men ikke CD8

+ T-celler korrelerede med dårlige klinisk-patologiske parametre for NSCLC såsom nodal metastaser og avancerede kræft stadier. Slående, ca. 70% af TIM-3

+ CD4

+ TIL’er udtrykt Foxp3 og ca. 60% af foxp3

+ TIL’er var TIM-3

+. I modsætning hertil blev TIM-3 minimalt udtrykt i perifere CD4

+ T-celler, tregs og CD8

+ T-celler. Disse data tyder på en ny rolle TIM-3 i tumorassocierede regulatoriske T-celler og dens betydning i human cancer progression.

Materialer og metoder

Valg af vævsprøver

A alt 51 lunge cancer vævsprøver blev opnået fra patologisk bekræftet og nyligt diagnosticeret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter, som fik drift fra oktober 2009 til maj 2011 i Hjerte-lunge kirurgi Institut for First Affiliated Sygehus, Soochow University i nærværende undersøgelse . Desuden blev 51 tilfælde af hosliggende normale væv fra ikke-maligne del reseceret og valgt som kontroller. De normale væv var mindst 5 cm fra den synlige tumormasse. Autologe mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev isoleret fra helblod ved Ficoll densitetsgradientcentrifugering før operation. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i den første Tilknyttede Hospital i Soochow University. Data blev analyseret anonymt og informeret samtykke ikke var påkrævet.

Høst af tumor infiltrerer lymfocytter (tils)

Tumor væv og tilstødende normale væv fra den samme patient blev hakket og fordøjet med collagenase fordøjelse løsning (1 mg /ml collagenase IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i RPMI1640) ved 37 ° C i 45 minutter. Stykkerne blev derefter overført til stålnet og enkeltcellesuspensioner opnåedes ved mekanisk grind. TIL’er blev yderligere oprenset ved gradienten i henhold til producentens protokol, vasket og resuspenderet i Hanks medium til forskellige analyser.

Mus Salg

6-8 uger gamle C57BL /6 mus var anvendes i tumor eksperimenter. Alle dyrene blev holdt under specifikke patogenfrie forhold i dyret facilitet på University of Pittsburgh eller Soochow University. Alt dyr arbejde er blevet godkendt af institutionen Animal Care og brug Udvalg ved University of Pittsburgh (protokol nummer 0.906.824). For tumor modelforsøg blev mus udfordret med 2 × 10

5 B16F0 celler i.d. og tumorprøver blev fjernet til analyse omkring dag 20 som tidligere beskrevet [16].

In vitro T-celle-stimulering

Naive T-celler blev oprenset fra PBMC’er fra raske donorer under anvendelse depletterende anti-CD45RO-antistof og Stemsep® human T-celle berigelse kit (StemCell teknologier, Vancouver, British Columbia, Canada). Renheden af ​​T-celler var mere end 90%. Celler blev stimuleret med 1 ug /ml pladebundet anti-CD3 (klon OKT3) og 2 pg /ml pladebundet anti-CD28 mAb’er i op til 72 timer.

I isolering tregs, PBMC’er blev farvet med phycoerythrin-cyanin Dye7 (PECY7) konjugeret anti-CD4-mAb (RPA-T4) og anti-CD25-phycoerythrin (PE) (BC96). A MoFlo cytometer (Beckman-Coulter, Brea, CA USA) blev anvendt til at isolere CD4

+ CD25

høje celler. Disse celler blev derefter stimuleret med anti-CD3 (1 pg /ml) og anti-CD28 (2 ug /ml) i nærvær af IL-2 (200 U /ml, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). 24, 48, og 72 timer senere blev celler høstet til yderligere analyse

Antistoffer og flow-cytometri

Direkte konjugeret anti-humane antistoffer mod følgende overflademolekyler blev anvendt:. Anti-CD4 (RPA-T4) og anti-CD8 (RPA-T8) blev opnået fra Beckman Coulter. Anti-TIM-3 (344823), anti-PD-1 (2H7), og anti-CD25 (BC96) blev indkøbt fra R & D Systems. De følgende monoklonale antistoffer specifikke for muse antigener blev indkøbt fra eBioscience (San Diego, CA, USA): CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), Tim-3 (RMT3-23) og Foxp3 (FJK-16) . Flowcytometrisk analyse blev udført under anvendelse af en FACS flowcytometer.

I intracellulær cytokin-farvning blev humane TIL’er høstet fra prøver lungekræft, stimuleret med plade-bundet anti-CD3 mAb (1 ug /ml) og plade-bundne anti-CD28 mAb’er (2 ug /ml) i 16 timer og inkuberet i de sidste 3 timer med Brefeldin A (10 ug /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev overført til en V-bundplade, farvet med anti-CD4 eller anti-CD8 i Hanks puffer (indeholdende 1% FCS), derefter fikseret med fiksering medium, som blev efterfulgt af permeabilisering medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Cellerne blev efterfølgende farvet med anti-IFN-γ antistof (4S.B3, Biolegend, San Diego, CA, USA). Celler, der producerer IFN-γ blev undersøgt med flowcytometri.

Til analyse af foxp3 ekspression blev TIL’er først farvet med anti-CD4-PECY7, anti-CD25-PECY5 og anti-TIM-3-PE eller anti a-PD-1-PE, efter fiksering og permeabilisering blev celler inkuberet med FITC-konjugeret anti-humant foxp3 (259d, BioLegend, San Diego, CA, USA), baseret på producentens anbefalinger, og udsat for flowcytometrianalyse.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 5.0 softwarepakke (GraphPad software, Inc., San Diego, USA). T-test, envejs ANOVA og mindst signifikant forskel (LSD) -t test blev anvendt efter behov. P-værdier mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

Siden TIM-3 er involveret i T-celle udmattelse, besluttede vi at undersøge sit udtryk på TIL’er i lungekræft prøver. Leukocytter fra tumorvæv, distale normale lungevæv, og PBMC blev analyseret for TIM-3 overfladeekspression ved hjælp af flowcytometri. Den ikke-specifik farvning blev kontrolleret af isotype kontrol-IgG-antistof (fig S1). Mere end 90% af CD4

+ -celler var positive for CD3 efter vores oprensningsprocedure og udvælgelse af lymfocytporten under flowcytometrisk analyse. I vores lungekræft patientgruppe, har vi fundet, at TIM-3 blev udtrykt i gennemsnit på omkring 30% af CD4

+ TIL’er og CD8

+ TIL’er (figur 1A og 1B). Procentdelen af ​​TIM-3

+ CD4

+ og TIM-3

+ CD8

+ TIL’er i de distale normale lungevæv reduceret til ca. 18% og 15% (figur 1A og 1B) . I modsætning hertil var ubetydelig ekspression af TIM-3 på T-cellerne i blod fra disse patienter (figur 1A og 1B). Derfor TIM-3-ekspression var specifikt opreguleret på T-celler i de normale lungevæv og yderligere i kræftvæv. En nylig rapport viste, at i PBMC isoleret fra fremskreden melanoma patient, en fraktion af PD-1

+ NY-ESO-1-specifikke CD8

+ T-celler co-udtrykkes TIM-3 og PD-1, og disse celler var mere dysfunktionel end TIM-3

a-PD-1

+ og TIM-3

a-PD-1

– modstykker [4]. Vi studerede derefter PD-1 og TIM-3 ekspression på TIL’er fra lungekræft væv. PD-1 blev udtrykt i mere end 65% af TIL’er fra både normale og cancer lungevæv (Figur 1C). Flertal af TIM-3

+ TIL’er var PD-1

+ i lungevæv. I modsætning hertil 10% af T-celler i perifert blod var positive for PD-1 (figur 1C). , Fandt vi, at et stort antal TIM-3

+ PD-1

+ T-celler blev beriget med lungekræft væv. Dette er i overensstemmelse med det faktum, at mange af T-celler i kræft væv er dysfunktionel sandsynligvis på grund af udmattelse eller anergi.

Tumor infiltrerer lymfocytter (tils) blev høstet fra lungekræft væv, der støder normale væv og perifert blod monouclear celler (PBMC’er) fra fuldblod af patienterne. Celler blev derefter farvet for CD4, CD8, TIM-3 og PD-1. A. Repræsentative dot-plots viser TIM-3 ekspression på CD4

+ og CD8

+ T-celler i forskellige væv fra patienter med lungecancer. Lymfocytter blev gated for yderligere analyse af CD4 og CD8 T-celler. Mere end 90% CD4

+ eller CD8

+ celler var CD3

+. B. opsummerede resultater af procent (%) af TIM-3-ekspression på CD4

+ og CD8

+ T-celler fra patienter med lungecancer er vist. Vandrette søjler skildrer den gennemsnitlige procentdel af TIM-3 ekspression på CD4

+ og CD8

+ T-celler. Fejllinjer: ± S.E.M. C. Dual ekspression af TIM-3 og PD-1 på gated CD4

+ og CD8

+ T-celler er vist. P-værdierne blev beregnet under anvendelse af envejs ANOVA.

Da det er blevet vist, at antigen-specifikke TIM-3

+ CD8

+ T-celler er funktionelt opbrugt i kronisk infektion og kræftpatienter, besluttede vi at undersøge, om TIM-3 også markeret dysfunktionelle T-celler i TIL’er i lungekræft væv. TIL’er blev stimuleret med anti-CD3 og anti-CD28 i 16 timer og analyseret for IFN-γ-produktion ved flowcytometri. Vi har fundet, at i gennemsnit 5% TIM-3

-CD8

+ TIL’er er IFN-γ

+ ved ex vivo-stimulering med anti-CD3 (figur 2A, 2C). I modsætning hertil blev hyppigheden af ​​IFN-y-producenter signifikant reduceret i TIM-3

+ CD8

+ TIL’er (figur 2A, 2C). Således er vores data er i overensstemmelse med den ide, at TIM-3 point funktionel udmattelse af CD8 T-celle i humane cancer væv, i holde med den nylige fund ved hjælp af transplantation mus tumor model [5].

TIL’er blev høstet fra lungekræft væv. Celler blev derefter stimuleret med plade-bundet anti-CD3 mAb (1 ug /ml) og plade-bundet anti-CD28 mAb’er (2 ug /ml) i 16 timer og inkuberet i de sidste 3 timer med Brefeldin A (10 ug /ml ). Celler, der producerer IFN-γ blev undersøgt med intracellulær cytokin-farvning og flowcytometri. (A og B). Repræsentative dot plots fra en patient viste procentdelen af ​​TIM-3

+ IFN-γ

+ og TIM-3

-IFN-γ

+ inden CD8

+ eller CD4

+ T-celle rum. De viste data er repræsentative for seks uafhængige forsøg. C. Den gennemsnitlige procentdel af IFN-γ-producerende CD8

+ eller CD4

+ T celler blandt TIM-3

+ og TIM-3

– fraktioner er vist

.

Udover CD8

+ TIL’er, TIM-3 blev udtrykt på CD4

+ TIL’er i human lungecancer (figur 1) samt i musen transplanterede tumor [5]. Tim-3 blev også overudtrykt på Th1 og Th17-celler og vigtige for at inhibere funktionen af ​​disse celler [10]. Hvorvidt TIM-3 mærker CD4

+ T-celle dysfunktion er dog ikke sikkert. Vi anfører derefter undersøge frekvensen af ​​IFN-y-producerende CD4

+ TIL’er med hensyn til TIM-3 overfladeekspression. Vi har fundet omkring 2% af TIM-3

-CD4

+ TIL’er var IFN-y-producenter upon ex vivo-stimulering med anti-CD3 (figur 2B). I modsætning hertil procentdelen af ​​IFN-γ

+ celler var signifikant reduceret i TIM-3

+ CD4

+ TIL’er (figur 2B og 2C).

Det er velkendt, at regulering T-celler er en fremherskende population af CD4

+ T-celler blandt TIL’er [3]. Fordi tregs er også funktionelt anergiske, så besluttede vi at bestemme, om TIM-3 udtrykkes i regulatoriske T-celler blandt TIL’er hjælp Foxp3 som markør. Til vores overraskelse, selv om ca. 17% af CD4

+ TIL’er var Foxp3

+ tregs, omkring 70% af TIM-3

+ CD4

+ TIL’er var Foxp3

+ (fig. 3A). Desuden ca. 60% af Foxp3

+ CD4

+ TIL’er udtrykte TIM-3 på deres overflader (fig. 3A). Således TIM-3

+ CD4

+ T-celler var overvejende tregs og de fleste af tregs inden lungekræft TIL’er meget opreguleret TIM-3-ekspression. I overensstemmelse med disse data, alle foxp3

+ CD4

+ TIL’er udtrykker PD1 (fig. 3B). I modsætning til høj ekspression af TIM-3 i TIL’er, minimal ekspression af TIM-3 blev fundet på hverken konventionelle T-celler eller tregs i perifert blod (data ikke vist).

TIL’er blev høstet fra lungekræft væv. Celler blev derefter farvet for CD4, TIM-3, og Foxp3 (A) eller CD4, PD-1, og Foxp3 (B). Lymfocytter blev gated for yderligere analyse af CD4 og CD8 T-celler. Andelen af ​​hver population inden CD4

+ T-celle rum blev angivet. De viste data er repræsentative for fem uafhængige forsøg.

Siden TIM-3 blev vist at være opreguleret i T-celler på in vitro dyrkning med forekomst af TCR stimulation [10], besluttede vi at undersøge, om tregs kunne blive stimuleret til at udtrykke TIM-3. Som en kontrol, humant CD4

+ og CD8

+ T-celler blev stimuleret med anti-CD3 og anti-CD28 i 72 timer. Hver 24 timer, undersøgte vi TIM-3 og PD-1 ekspression. Både PD-1 og TIM-3 blev opreguleret på omkring 48 timer og længere opreguleret efter 72 timer i både CD4

+ og CD8

+ T-celler (fig. 4A og 4B). Vi derefter testet, om TIM-3 kunne være tilsvarende opreguleret i regulatoriske T-celler. Vi beriget humane tregs ved at isolere CD4

+ CD25

høje T-celler under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Derefter stimuleret vi disse T-celler med anti-CD3 og anti-CD28 i nærværelse af IL-2 i 72 timer. Ekspressionen af ​​TIM-3 og Foxp3 blev undersøgt ved 48 timer og 72 timer. TIM-3 udtrykkes ved et ubetydeligt niveau i både ustimulerede naive CD4

+ T-celler og tregs (data ikke vist). Sammenlignet med ikke-stimulerede T-celler, TIM-3-ekspression var betydeligt opreguleret ved 48 timer og yderligere forøget ved 72 timer (fig. 4C). Ved 72 h ca. 25% af Foxp3

+ T-celler var TIM-3 positive (fig. 4C). Kollektivt antyder disse data, at TIM-3 opreguleres på både traditionelle T-celler og tregs ved stimulering via TCR.

(A og B). Humane naive T-celler blev oprenset fra PBMC’er af sundhedsmæssige donorer. Celler blev derefter stimuleret med plade-bundet anti-CD3 plus anti-CD28 mAb. 24, 48 og 72 timer senere blev cellerne opsamlet og farvet for CD4, CD8, TIM-3 og PD-1. Ekspressionen af ​​PD-1 og TIM-3 blev analyseret ved flowcytometri på gated CD4

+ (A) eller CD8

+ (B) T-celler. C. CD4

+ CD25

høje T-celler blev isoleret fra perifert blod ved FACS. Disse celler blev derefter stimuleret med anti-CD3 og anti-CD28 i nærværelse af IL-2 (200 U /ml). 24, 48 og 72 timer senere blev cellerne høstet og farvet for CD4, TIM-3 og Foxp3. Ekspressionen af ​​TIM-3 på CD4

+ Foxp3

+ T-celler er vist. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Siden TIM-3 er stærkt udtrykt i TIL’er isoleret fra lungekræft væv, bestemmes derefter vi om TIM-3-ekspression havde nogen klinisk betydning ved at korrelere TIM-3-ekspression med kliniske patologiske parametre. Vi har fundet procentdelen af ​​CD4

+ og CD8

+ T-celler inden TIL’er blev ikke forbundet med kliniske patologiske parametre. Forholdet mellem CD4 versus CD8 heller ikke vise nogen klinisk betydning (tabel 1). Desuden har frekvensen af ​​TIM-3 på CD8 T-celler ikke viser nogen klinisk betydning (tabel 2). I modsætning hertil var højere frekvens af TIM-3

+ CD4

+ TIL’er viste signifikant association med lymfeknude-metastase og mere avancerede kræft stadier (tabel 2). Således TIM-3 ekspression på CD4

+ TIL’er er forbundet med lungekræft progression.

Ud over den menneskelige Foxp3

+ TIL’er undersøgte vi Tim-3 udtryk på mus Foxp3

+ TIL’er. Vi bruges B16 model, fordi Tim-3

+ CD4

+ TIL’er nylig blev beskrevet i denne model [5]. Inden for B16 tumor, fandt vi ca. 50% af Foxp3

+ CD4

+ TIL’er udtrykte Tim-3 (fig. 5). I modsætning hertil Foxp3

-CD4

+ TIL’er udtrykte ubetydelige niveauer af Tim-3 (fig. 5). Tim-3 blev udtrykt på minimale niveauer i milt og lymfeknude CD4

+ T-celler uanset Foxp3 ekspression (fig. 5). Således Tim-3 er overvejende til stede på en undergruppe af Foxp3

+ CD4

+ regulatoriske T-celler i både humane og muse-tumorer.

6-8 uger gamle C57BL /6-mus var inokuleret med 2 x 10

5 B16F0 celler id, tumorprøver, milt og lymfeknuder blev fjernet når tumorstørrelser nået omkring 15 mm i diameter på dag 20. tils, splenocytter og lymfeknudeceller blev isoleret til analyse ved flow cytometri. Tim-3 ekspression på mus CD4

+ Foxp3

+ eller CD4

+ Foxp3

– T-celler er vist. De viste data er repræsentative for fem uafhængige forsøg.

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi TIM-3 ekspression i TIL’er fra NSCLC prøver. Vi fandt høje niveauer af TIM-3-ekspression på både CD4

+ og CD8

+ TIL’er. Vigtigere, selvom TIM-3 overfladeekspression er blevet rapporteret at angive en funktionelt anergiske tilstand af CD8

+ TIL’er, fandt vi, at TIM-3-ekspression på CD8

+ TIL’er undladt at associere med klinisk-patologiske parametre i lungekræft, men hyppigheden af ​​TIM-3 ekspression på CD4

+ TIL’er gjorde associere med lymfeknude metastaser og mere avancerede kræft stadier. Yderligere analyse viste, at TIM-3

+ CD4

+ T-celler var overvejende Foxp3

+ og størstedelen af ​​foxp3

+ CD4

+ T-celler udtrykte TIM-3. Vores undersøgelse afslører en ny rolle TIM-3 i tumor mikromiljø via sin dominerende udtryk i regulatoriske T-celler.

Det er interessant, at vi har fundet udtryk i TIM-3 på en stor del af tregs inden lungekræft væv. Vores data mining afslørede også, at Tim-3-mRNA blev udtrykt i naturlige Foxp3

+ CD4

+ T-celler, som er blevet adoptivt overført til RAG1 manglende mus og Foxp3 kræves for Tim-3-ekspression i disse Treg celler (figur S2) [17], hvilket tyder på Tim-3 ekspression i tregs kunne være en integreret del af Foxp3-regulerede netværk inden naturlige tregs. Vi har yderligere vist, at TIM-3 ikke udtrykkes konstitutivt af tregs i humant perifert blod, men kan induceres ved TCR-stimulering. Grunden til, at TIM-3 er stærkt udtrykt i Foxp3

+ CD4

+ TIL’er kan skyldes konstant stimulation af tumor associerede antigener i tumor site.

Den nøjagtige rolle TIM-3 i tumor infiltrerer tregs stadig ikke kendt. Vores data tyder på, at TIM-3

+ tregs i lungekræft væv kunne være afledt af naturlige tregs ved kronisk TCR stimulering af tumorantigener. PD-1-ligand B7-H1 og TIM-3 ligander, såsom galectin-9 og apoptotiske celler i tumorvævet kan være vigtigt for opretholdelse af antallet og funktionen af ​​TIM-3

+ PD-1

+ tregs. I indstillingen transplantation, blev Tim-3 vist at regulere allospecifik Treg aktivering [14]. Det blev vist, at Tim-3-Tim-3L-sensitive pathway var involveret i den funktionelle generation af donor-specifikke tregs efter administration af tolerance-fremkaldende behandlinger [14]. Konsistent med denne ide, har Tim-3 nylig blevet rapporteret at blive udtrykt i omkring 15% af Foxp3

+ Treg celler i milten under allo-transplantation [18]. Vores undersøgelse, ved at afsløre høje niveauer af TIM-3-ekspression på tregs inden human tumor, antyder, at TIM-3 kan spille en direkte rolle i den funktionelle modning af tumorinfiltrerende tregs ved at levere et signal inden tregs eller kan være vigtig for opretholdelse det immunosuppressive funktion af disse tregs i tumormikromiljøet.

Udover naturlige tregs, TIM-3 og PD-1 kan også spille en rolle i dannelsen af ​​adaptive tregs. Faktisk blev PD-1-ligand vist at være involveret i dannelsen af ​​adaptive tregs i tumoren drænende lymfeknuder [19]. Galectin-9 viste sig at beskedent forøge Foxp3 ekspression in vitro model af tregs induktion ved TGF-β [18], [20]. Hvorvidt tregs findes i vores undersøgelser er adaptive eller naturlig treg vil være genstand for yderligere undersøgelse.

TIM-3 har vist sig som et lovende mål for kræft immunterapi [21]. Nylige undersøgelser har fokuseret på den rolle, TIM-3-ekspression på CD8

+ T-celler i perifert blod samt inden tumorer [4], [5]. Disse undersøgelse elegant demonstreret, at TIM-3 mærker funktionelt udmattede CD8

+ T-celler og er sandsynligvis ansvarlig for svigt af immunosurveillance og tumor vaccination. Vores undersøgelse viser, at ekspressionen af ​​TIM-3 på CD4

+ tils celler signifikant associeret med dårligere kliniske patologiske parametre i lungekræft. Derfor TIM-3 sandsynligvis spiller en væsentlig rolle i tumorudvikling ved at opretholde tumoren immunsuppressive miljø gennem tregs. Yderligere karakterisering af TIM-3 ekspression og funktion inden for forskellige tils delmængder bør forbedre vores viden om de underliggende mekanismer i TIM-3-medieret immunsuppression inden tumor mikromiljø.

Støtte oplysninger

figur S1. Salg Tim-3-ekspression ved flowcytometri. Tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL’er) blev høstet fra lungekræft væv, der støder normale væv, og perifere blod monouclear celler (PBMC’er) fra fuldblod af patienterne. Celler blev derefter farvet for CD4 og TIM-3 eller CD4 plus en kontrolgruppe-IgG-antistof. Celler i lymfocyt porten blev yderligere analyseret for CD4 og TIM-3 udtryk

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030676.s001

(PPT)

Figur S2. Salg Tim-3-ekspression i native tregs og dens afhængighed af Foxp3. NCBI GEO profil databasen blev forespurgt til Tim-3 ekspression i tregs. Et resultat viste, at Tim-3 nedreguleres i Foxp3 deficiente native tregs som vist her. DataSet Record GDS2525

doi:. 10,1371 /journal.pone.0030676.s002

(PPT)

Tak

Forfatterne takker Drs. Olivera Finn, Larry Kane, og Lujun Chen til at læse manuskriptet og hjælpsomme diskussion.