PLoS ONE: iTRAQ Identifikation af Candidate Serum Biomarkører associeret med metastatisk Progression of Human Prostata Cancer

Abstrakt

En stor udfordring i behandlingen af ​​patienter med prostatakræft er at identificere de personer med risiko for udvikling metastatisk sygdom, som i de fleste tilfælde vil sygdommen forblive indolent. Vi analyserede samlet serumprøver fra 4 grupper af patienter (n = 5 prøver /gruppe), der er indsamlet prospektivt og overvåges aktivt i minimum 5 år. Patientgrupper var (i) histologisk diagnose af benign prostatahyperplasi uden tegn på kræft ‘BPH «, (ii) lokaliseret kræft uden noget tegn på progression,’ ikke-forløber (iii) lokaliseret kræft med tegn på biokemisk progression, ‘forløber ‘, og (iv) knoglemetastaser ved præsentationen “metastatisk”. Poolede prøver blev immuno-udtømt for de 14 mest rigelige proteiner og analyseres med en 4-plex iTRAQ tilgang. Samlet 122 proteiner blev identificeret og relativt kvantificeres. Sammenligninger af forløber

versus

ikke forløber grupper identificeret betydelige forskellen udtryk for 25 proteiner (p 0,001). Sammenligninger af metastatisk

versus

forløber grupper identificeret betydelige forskellen udtryk for 23 proteiner. Kortlægning af differentielt udtrykte proteiner på prostatakræft progression pathway afslørede dysreguleret ekspression af individuelle proteiner, par af proteiner og »paneler« af proteiner at være forbundet med bestemte stadier af sygdomsudvikling og progression. Medianen immunfarvning intensitet eukaryot translation elongation faktor 1 alfa 1 (eEF1A1), en af ​​kandidaterne identificeret, var signifikant højere i osteoblaster i umiddelbar nærhed af metastatiske tumorceller sammenlignet med osteoblaster i kontrol knogle (p = 0,0353, Mann Whitney U). Vores proteomisk tilgang har identificeret leads til potentielt nyttige serum biomarkører forbundet med metastaserende progression af prostatacancer. Panelerne er identificeret, herunder eEF1A1 garanterer yderligere undersøgelse og validering

Henvisning:. Rehman I, Evans CA, Glen A, Cross SS, Eaton CL, Ned J, et al. (2012) iTRAQ Identifikation af Candidate Serum Biomarkører associeret med metastatisk Progression for Human prostatakræft. PLoS ONE 7 (2): e30885. doi: 10,1371 /journal.pone.0030885

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: 26 august, 2011; Accepteret: December 27, 2011; Udgivet: 15 februar 2012

Copyright: © 2012 Rehman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra PROMET (projekt nr. FP6-LSH-5-2004-018858), og P-MARK (kontrakt nr. LSHC-CT-2004 til 503.011), under det sjette EU-rammeprogram og NCRI prompt (Prostata kræft mekanismer af progression og behandling) kollaborativ tilskud til Dr. Hamdy, og tilskud fra Teknik og Physical Sciences Research (EPSRC) til Dr. Wright: EP /E036252 /1 og GR /S84347 /01. Vi er taknemmelige for Dr. Nicholas Hoyle på Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland for sin støtte til hjælpematerialer og reagenser til projektet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Vi er taknemmelige for Dr. Nicholas Hoyle på Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland for hans støtte mod forbrugsvarer og reagenser til projektet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

I Europa og USA, prostatakræft er den anden mest almindelige kræftdiagnose og tredje mest almindelige årsag til kræft dødsfald hos mænd [1], [2]. Desuden har forekomsten steget siden den omfattende indførelse af prostata specifikt antigen (PSA) test [3]. De fleste patienter med prostatacancer er diagnosticeret på et tidligt stadium, men selv med screening over 7% af tilfælde udvikler metastatisk sygdom [4]. Hos mænd med fjernmetastaser er prognosen dårlig, med en gennemsnitlig overlevelse på 24 til 48 måneder. Knogle er det mest almindelige sted for prostatakræft metastase og er forbundet med knoglesmerter, rygmarv kompression og marv svigt [4]. I øjeblikket er knogle metastaselæsioner bestemt af billedbehandling såsom isotop knogle scanning kunne dog identifikationen af ​​et serum baseret biomarkør (r) til at forudsige modtagelighed patienterne til at udvikle knoglemetastaser muliggøre en mere nøjagtig klinisk vurdering af sygdommen og hjælpe guide terapi.

diagnosen prostatakræft er oftest lavet af en triade af serum prostata specifikt antigen (PSA) målinger, digital rektal undersøgelse (DRE), og histologisk vurdering af transrektal ultralyd (TRUS) guided biopsi materiale [ ,,,0],5]. Selvom PSA en FDA godkendt biomarkør til påvisning af prostatacancer, dens anvendelighed er kontroversiel, da det har vist sig at være upålidelige til sygdomsdiagnose, og især til at skelne indolent fra aggressive former af sygdommen [6], [7]. Derudover er PSA forbundet med en høj grad af falsk-positive og falsk-negative testresultater, som niveauer kan være forhøjet i ikke-cancer tilstande i prostata, herunder benign prostatahyperplasi (BPH). Således er der et presserende behov for yderligere biomarkører, der kunne forbedre den diagnostiske specificitet PSA og forudsige sandsynligheden for sygdomsprogression.

Blod og dens produkter, såsom plasma og serum er ideelle væsker til identifikation af kræft biomarkører, da de indeholder proteiner både udskilt og kaste fra kræftceller, kombineret med den lethed for prøveudtagningen. Men den variabel sammensætning og stort dynamikområde af proteiner til stede i plasma (estimeret til at være 10

10 størrelsesordener eller mere),, udgør store udfordringer i at identificere klinisk relevante biomarkører blandt baggrunden af ​​rigelige proteiner, såsom albumin, immunoglobulin og transferrin [8]. Af de 22 eller deromkring mest udbredte proteiner i plasma, disse udgør mere end 99% af massen af ​​de samlede plasmaproteiner, medens den resterende 1% menes at være sammensat af mellemliggende /lav hyppighed proteiner og omfatter biomarkør pool [9 ]. De store størrelsesordener i koncentrationen protein har hæmmet tidligere massespektrometri baseret bestræbelser på at identificere klinisk relevante biomarkører, primært som følge af en undertrykkelse af ionisering af lav hyppighed proteiner ved de højere overflod proteiner [10]. Men forud fjernelse af nogle af de mest rigelige proteiner er blevet vist, at forbedre påvisningen af ​​relativt lavere rigelige proteiner [11], [12]. Selvom der er mange forskellige proteinfraktioneringsteknikker metoder baseret på forskelle i molekylvægt, form, ladning, pI, hydrofobicitet og affinitet gennem specifikke biomolekylære interaktioner, er det blevet rapporteret, at høje overflod proteinadskillelse anvendelse af antistoffet baseret IgY-12 immunodepletion system er meget reproducerbar [13].

Blandt de proteomiske teknologier, der anvendes til biomarkør identifikation, ‘isobare Tags til relativ og absolut kvantificering’ (iTRAQ) har fordelene ved at være relativt højt gennemløb, og kan samtidig give oplysninger om peptid kvantificering og identifikation som tidligere rapporteret af os og andre [14] – [16]. Kort beskrevet i en typisk arbejdsgang prøver reduceres, alkyleres og proteolytisk spaltet til frembringelse peptider. Peptiderne mærkes med et sæt iTRAQ reagenser (i en 4 eller 8-plex format), samlet og fraktioneret ved stærk kationbytter (SCX). Fraktionerne analyseres derefter ved væskekromatografi tandem-massespektrometri (LC-MS /MS), med de resulterende massespektre med information sekvens (fra peptidfragmenterne) og relativ kvantificering (fra reportergruppen ioner).

i et forsøg på at identificere hidtil ukendte proteiner der er forbundet med metastatisk progression af human prostatacancer, er der udført en 4-plex iTRAQ analyse under anvendelse puljede serumprøver indsamlet prospektivt fra 4 veldefinerede grupper af patienter, som var aktivt overvåges i mindst 5 år, og udtaget til spektret af prostata sygdom. Efter dataanalyse, blev fundet en række kandidater til at blive væsentligt forskelligt udtrykt i prøver kræft sammenlignet med godartede prøver. En af kandidaterne identificeret som markant opreguleret i cancer grupper var eukaryote oversættelse forlængelse faktor 1 alfa 1 (eEF1A1), og blev yderligere undersøgt ved immunhistokemi hjælp prøver prostata væv fra lokaliserede og metastatiske tilfælde. Den biomarkør fører identificeret i vores ‘discovery’ fase undersøgelse, herunder eEF1A1 diskuteres i forhold til deres betydning for prostatakræft progression.

Materialer og metoder

Patienter og serum samling

Perifert blod blev opsamlet fremadrettet fra patienter, der deltog i Urologi klinik på Royal Hallamshire Hospital på tidspunktet for deres første besøg, efter skriftlig informeret samtykke. Blodprøve samling blev godkendt af den etiske komité ved University of Sheffield. Serum blev indsamlet ved at lade blodet til at koagulere i 30 minutter, centrifugeret ved 1.200 x g i 10 minutter ved 4 ° C og derefter opbevaret ved -80 ° C i 100 pi alikvoter. Alle blodprøver blev indsamlet før administrationen i en behandling. Tyve serumprøver blev omhyggeligt udvalgt til at repræsentere de forskellige stadier og kvaliteter af prostata sygdom og samlet (n = 5 patienter /gruppe), at danne 4 patientgrupper. Alle patienter var aktivt overvåges i mindst 5 år fra tidspunktet for deres oprindelige blodprøvetagning. De 4 patientgrupper var: Gruppe 1: histologisk diagnose af benign prostatahyperplasi ‘BPH «, uden tegn på cancer med mindst 2 uafhængige sæt af prostata biopsier, og en PSA niveau under 10 ng /ml (gennemsnitsalder 61 år) . Gruppe 2: histologisk diagnose af prostatakræft med en PSA niveau under 10 ng /ml, og ingen tegn på en stigende PSA efter 5 år aktiv overvågning – »ikke-forløber ‘gruppe (gennemsnitlig alder af 67 år); Gruppe 3: histologisk diagnose af klinisk lokaliseret kræft med en indledende PSA niveau under 13 ng /ml, efterfulgt af 3 på hinanden følgende stigninger i PSA niveauer i løbet af 5 år af aktiv overvågning -‘progressing ‘gruppe (gennemsnitlig alder af 69 år); Gruppe 4: patienter med PSA 19 ng /ml og dokumentation for knoglemetastaser fra en positiv radionukleotid knoglescanning – “metastatisk” gruppe (gennemsnitlig alder af 73 år). Forskellene i median alderen patienterne fandtes ikke at være statistisk signifikant mellem de 4 grupper (p = 0,146, Kruskal-Wallis test). Sygdomskarakteristika hos de 20 patienter, der omfatter de 4 grupper er vist i tabel S1. Salg

Patient vævsmateriale Salg

Tissue microarrays (TMAS), der består af 56 tilfælde prostataadenocarcinom spænder i single Gleason kvaliteter (dvs. grad 2, n = 5; grad 3, n = 32; grad 4, n = 9; klasse 5, n = 10), og 40 tilfælde af tilstødende ikke-malignt væv, og blev konstrueret som tidligere beskrevet [17] , [18]. Yderligere 23 tilfælde af knogle biopsier fra patienter både med og uden prostatacancer skelet metastaser blev opnået ved 8 mm trepan biopsi udføres under generel anæstesi. Informeret patient samtykke og etiske komité godkendelse blev opnået forud for undersøgelsen (South Sheffield videnskabsetisk komité, SSREC /02/155 og 00/172).

Cellelinjer

menneskelige prostata cancer cellelinjer LNCaP, PC-3, DU145 og VCap blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC), (https://www.lgcstandards-atcc.org/). DuCaP celler blev opnået via projektet konsortium (https://www.primaproject.org/participants.php) PRIMA. Den LNCaP-Pro5, LNCaP-LN3, PC-3M og PC-3M-LN4 celler en slags gave fra Dr. Curtis Pettaway (University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center), [19]. LNCaP-c4-2 og LNCaP-C4-2B cellelinier blev opnået fra Prof. George Thalmann [20]. TE-85 osteosarkomceller var en venlig gave fra Prof. J.A. Gallagher, University of Liverpool. Alle prostatacancercellelinjer blev dyrket som tidligere beskrevet og bekræftet at være fri for mycoplasma [15].

IgY-14 affinitet udtømning af serumprøver

puljede serumprøver blev udtømt for de 14 mest fælles plasmaproteiner vha Seppro IgY-14 depletion systemet [21]. Tidligere undersøgelser har vist at serum pooling efterfulgt af udtømning af de mest rigelige proteiner er en effektiv strategi til at reducere dynamikområdet af proteiner og dermed styrke identifikationen af ​​serum biomarkører, som påvist ved hjælp af den kvantitative proteom fremgangsmåde til iTRAQ (R) [ ,,,0],22]. Serumprøver fra 5 patienter repræsenterer hver af de 4 patientgrupper blev samlet i lige store volumener, hvilket gav et samlet volumen på 200 pi for hver gruppe (40 pi af hver prøve). De puljede serumprøver blev afsendt på tøris til Genway (Digilabs BioVision, Tyskland), for immun-udtømning ved hjælp af Seppro Ig-Y14-system. Gennemløbet fraktion (depleteret for albumin, immunoglobulin IgG, fibrinogen, transferrin, IgA, IgM, haptoglobin, alpha2-macroglobin, alfa1-syreglycoprotein, alfa1-antitrypsin, Apo AI HDL, Apo A-II HDL, komplement C3 og LDL (ApoB)), blev anvendt til efterfølgende iTRAQ analyse.

iTRAQ prøve mærkning og SCX-fraktionering

Før iTRAQ analyse blev prøver koncentreret og buffer udveksles ved hjælp af 5 kDa molekylvægt cut-off tur koncentratorer (Millipore). Prøverne blev bufferudskiftet tre gange mod 500 pi 1 M triethylammoniumbicarbonate (TEAB) buffer og koncentreret til et volumen på ca. 80 pi. Prøver blev mærket med iTRAQ reagenser ifølge producentens instruktioner, og som tidligere beskrevet [14], [15]. Hver prøve blev mærket med en af ​​de fire iTRAQ reagenser (iTRAQ reporter ioner af 114,1, 115,1, 116,1, 117,1 masse /ladningsforhold). Ordren mærkning tag var BPH- 117; lokaliseret ikke- forløber cancer-116; forløber cancer-115; metastatisk sygdom-114). Mærkede prøver blev samlet og fraktioneret ved stærk kationbytter (SCX), ved anvendelse af en BioLC HPLC-søjle (Dionex, Surrey, UK), og analyseret ved LC-MS /MS som tidligere beskrevet [14], [15].

tandem massespektrometrianalyse

massespektrometri (MS) blev udført under anvendelse af en QStar XL Hybrid ESI Kvadrupol time-of-flight tandem massespektrometer, ESI-qQ-TOF-MS /MS (Applied Biosystems, Framingham, MA; MDS-Sciex, Concord, Ontario, Canada), kombineret med en online kapillar væskekromatografi-system (Famos, Switchos og Ultimate fra Dionex /LC Pakninger, Amsterdam, Holland). De tørrede prøver blev resuspenderet i 60 l 3% acetonitril og 0,1% myresyre klar til MS, og 10-15 l (afhængig af peptidkoncentration, som ses i topintensiteten af ​​SCX kromatogrammet) injiceret til nano- LC-ESI-MS /MS-system ved hver analyse. Indledende adskillelse fandt sted på en PepMap C

18 RP kapillarsøjle (LC Packings) med en konstant strømningshastighed på 0,3 l /min. LC buffere A og B blev fremstillet som 3% acetonitril, 0,1% myresyre og 97% acetonitril, 0,1% myresyre hhv. Gradienten blev startet som 97% puffer A og 3% puffer B i 3 minutter, efterfulgt af 3 til 25% puffer B i 120 minutter, 90% buffer B i 7 minutter og endelig 97% puffer A i 7 minutter. datafangst i massespektrometeret var indstillet til den positiv ion-mode, med et udvalgt masseinterval på 350-1800 m /z. Tandem massespektrometri blev udført på peptider med +2, +3, +4 opladningstilstand på tværs af en scanning række 65-2000 m /z.

Protein identifikation og relativ kvantificering

Protein identifikation og relative kvantificering blev udført som beskrevet tidligere [23], [24]. Identifikation af peptid forløber og fragmenter blev udført ved databasesøgning mod Swiss-Prot og Trembl

Homo sapiens

protein database (41070, 71449 ORF’er henholdsvis downloades fra UniProt, maj 2010). Parametre til søgning blev sat op som følger: MS tolerance var 0,4 og MS /MS tolerance blev sat til: peptid tolerance 0,4 Da, oplade 2, 3 og 4, min peptid længde, z-score, max p-værdi og AC score var 6, 6, 10

-6 og 6. Phenyx standard ‘turbo’ scoring blev aktiveret med masse tolerance begrænsning på 0,1 Da for MS og MS /MS og den mindste procentdel af peptidsekvensen dækning af b

+ (b), b

2+ (b ++), y

+ (y) eller y

2+ (y ++) fragment serien blev sat til standardværdien på 20%. Target databasesøgning plads var begrænset til tryptiske peptider med en maksimal på 1 miscleavage. Ændringer blev sat som: 4-plex iTRAQ masseskift (144 Da, K og N-term), methylthiol (46 Da) og oxidation af methionin (16 Da). Falske opdagelse satser (FDR) blev estimeret ved hjælp af en sammenkædet target-lokkedue database som beskrevet af Elias og Gygi [25]. Protein-ændringer blev kvalificeret under anvendelse af en t-test algoritme udviklet i hus [23].

Immunhistokemi for eEF1A1

Immunhistokemi blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [18]. Sektioner af knogle- og prostatavæv blev skåret (4 m) og monteret på SuperFrost objektglas (VWR International, Tyskland). Objektglas blev inkuberet med monoklonalt muse-anti-eEF1A1 antistof (Santa-Cruz Biotechnology, CA, USA Cat. N

o sc21758), ved 0,4 ug /ml i 2% hesteserum natten over ved 4 ° C. Snit blev vasket to gange i PBS-Tween 20 (PBST) og inkuberet i 30 minutter med anti-muse-IgG ImmPRESS HRP (Vector Laboratories, kat. N

o MP-7402). Efter yderligere vask i PBST blev lokalisering af antistof /antigen-kompleks visualiseres ved anvendelse af IMMPACT DAB-systemet (Vector Laboratories, kat. N

o SK-4105). Kontrolsnit blev inkuberet med anti-mus IgG-isotype-kontrol (Vector Laboratories I-2000), fortyndet til 0,4 ug /ml i 2% normalt hesteserum. eEF1A1 immunfarvning blev vurderet for både intensitet og cellulære lokalisering af en erfaren histopatolog (Dr. Simon Cross), som er blindet for undersøgelsen. Hvert tilfælde blev tildelt en farvning intensitet, der spænder fra 0-3, hvor 0 = fraværende; 1 = svag; 2 = moderat og 3 = intens farvning som tidligere beskrevet [18].

Western blotting

Western blotting blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [26]. Anti-EF-Tu gede polyklonalt IgG primært antistof blev anvendt ved en koncentration på 1:1000 (Santa Cruz, Cat. N

o. Sc12990). Sekundært antistof var HRP-konjugeret kanin-anti-ged (Abcam), og blev anvendt ved en koncentration på 1:1400 (Abcam). Dual farve præcision plus molekylvægtmarkører blev anvendt til størrelse estimation (Bio-Rad, Hertfordshire, UK).

Reverse-Transskription PCR og sekventering

Totalt RNA blev ekstraheret fra prostata cancer cellelinjer under anvendelse TRI-reagens (Sigma-Aldrich, UK) ifølge producentens instruktioner. RNA blev kvantificeret spektrofotometrisk og 2 ug blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase-kit med 250 ng af tilfældige primere, ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, UK). PCR primere specifikke for eEF1A1 isoformen var designet manuelt, ved hjælp af Ensembl cDNA-sekvens: ENST00000316292 (https://www.ensembl.org/index.html). Den eEF1A1-forward primer sekvens var (5′-3 ‘): TCCTTCAAGTATGCCTGGGTCT (eEF1A1-F1), der svarer til nukleotid positionerne 157-178. Den eEF1A1-reverse primer sekvens var: TGGCACAAATGCTACTGTGTCG (eEF1A2-R1), svarende til nukleotid positionerne 555-576, til opnåelse af en forventet PCR produkt størrelse på 420 bp. Tilsvarende PCR primere specifikke for eEF1A2 isoformen blev designet ved hjælp af Ensembl cDNA-sekvens: ENST00000298049. Den eEF1A2-forward primer sekvens var: AGGAGGCTGCTCAGTTCACCT (eEF1A2-F3), svarende til nukleotid positionerne 1004-1024; og eEF1A2- revers primer sekvens var: CCGCTCTTCTTCTCCACGTTC (eEF1A2-R3), svarende til nukleotid positionerne 1317-1336, med en forventet PCR produkt størrelse på 334 bp. Primere blev syntetiseret under anvendelse af kommercielle anlæg på Eurofins MWG Operon (https://www.eurofinsdna.com/products-services/oligonucleotides0.html).

Revers transkription PCR blev udført ved anvendelse af 1 pi cDNA fra hver af cellelinierne, 10 pmol af hver fremad /revers primer, og 0,5 pi AccuPrime Taq-DNA-polymerase (Invitrogen, UK), i 20 pi volumener. Termocyklingen blev udført under følgende betingelser: Initial denaturering ved 94 ° C i 5 minutter; 30 PCR-cyklusser ved 94 ° C i 1 min, 58 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min, og en endelig forlængelse på 72 ° C i 7 minutter. Amplified PCR-produkter (10 pi) blev separeret på en 2,5% agarosegel indeholdende ethidiumbromid og afbildes ved hjælp af GelDoc XR

+ Molecular Imager (Bio-Rad). Band intensiteter blev målt ved hjælp af den Mængde One-software (Bio-Rad).

PCR-produkter blev sekventeret ved Genetik core facilitet, University of Sheffield (https://www.shef.ac.uk/medicine/research /corefacilities/genetics.html). DNA-sekvenser blev visualiseret ved hjælp af kulørtheder Lite version 2.01 software, frit downloades fra https://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.

Resultater

Hierarkisk klynge analyse af protein-profiler

Analyse af de 4 samlede grupper af patienter identificeret 122 proteiner med tilhørende oplysninger om deres relative ekspressionsniveauer (tabel S2). Den falske opdagelse sats var 1,4%, hvilket er inden for det acceptable grænse på 5% [25]. For iTRAQ datasæt blev 75 unikke proteiner identificeret og relativt kvantificeres med ≥2 unikke peptider, og disse data blev anvendt til statistiske analyser for at bestemme ændringer i protein niveauer mellem grupper. Hierarkisk klyngedannelse blev udført for at gruppere data baseret på graden af ​​lighed mellem BPH og kræft grupper. Agglomerative klyngedannelse ved hjælp af den kvadrerede Euklidiske afstand mellem log

10 værdi iTRAQ nøgletal og mindste intercluster forskellighed kobling procedure blev udført (Mathematica 7.0.0 til Mac), til at generere dendrogram vist i figur 1. Et centralt element i den dendrogram er adskillelse af de patientgrupper i henhold til den fase af deres sygdom. Patienter med metastaser adskilt længst og anses derfor for at være den mest forskellig fra patienter med BPH. Patienterne med BPH grupperet tættere sammen med patienter i den ikke-forløber gruppe sammenlignet med de udvikler og metastatiske grupper.

Prøver blev grupperet baseret på ligheden mellem deres protein udtryk profiler observeret i log

10 af iTRAQ-forhold og en dendrogram genereret for at angive forholdet mellem prøverne. Squared euklidiske afstand mellem klynger (enkelt binding) vises. Varierende længder i branchen punkter angiver graden af ​​lighed; jo kortere gren jo højere grad af lighed.

Gene ontologi annotation

For at vurdere forskellige proteiner identificeret, gen-ontologi (GO) anmærkninger for biologiske processer blev tildelt ved hjælp af protein ANalysis gennem Evolutionary Relationships (PANTHER) software, som forbinder protein tiltrædelse koder til de tilsvarende angivelser i genet ontologi databasen [14], [27]. PANTHER analyse afslørede tilstedeværelsen af ​​mange almindelige plasmaproteiner såsom dem associeret med komplement medieret immunitet (14%), immunitet og forsvar (27%), proteolyse (21%), blodpropper (7%), og protein metabolisme og ændring (22%).

i den biologiske netværk analyse Metacore platform (GeneGo, Inc., St. Joseph, MI), blev anvendt som beskrevet tidligere [14], som afslørede, at mange af det differentielt udtrykte proteiner såsom C4, C4a, C5, C5b, C9 og C6 kortlagt til den klassiske immunrespons vejen (figur S1).

diagnostisk biomarkør fører

Forskelle i protein niveauer er rapporteret efter en t -test analyse som tidligere beskrevet [23]. P-værdierne blev beregnet baseret på antallet af peptider anvendt til kvantificering og variansen af ​​iTRAQ reporter nøgletal stammer fra disse peptider. En p-value≤0.01 blev anvendt til at tildele signifikante ændringer i protein- niveauer mellem prøvesæt. Vigtigere blev proteinforandringer rapporteret som signifikant differentiel ekspression udvalgt baseret på statistisk signifikans frem gange ændring [28]. Nogle af disse forskelle forventes at være potentielt større på grund af den kendt under estimering forbundet med iTRAQ baseret kvantificering [24].

Under vores analyse, vi var interesserede i proteiner, der viser både øget og nedsat ekspressionsniveauerne, som tidligere undersøgelser har rapporteret, at både markant op- og ned-regulerede proteiner kan være af klinisk relevans [15], [29].

identifikation af proteiner differentielt udtrykte i ikke-forløber, udvikler og metastatisk patientgrupper i forhold til BPH gruppe var af interesse, da disse kan give kundeemner til potentielt nyttige diagnostiske og prognostiske biomarkører (tabel S3). Således er en sammenligning mellem den ikke-forløber kræft versus BPH gruppen viste en signifikant differentiel ekspression af 22-proteiner; Hvoraf 7 blev opreguleret og 15 nedreguleret (tabel S3a). Ligeledes kan en sammenligning mellem den forløber patientgruppe versus BPH gruppen identificeret den differentielle ekspression af 19-proteiner; Hvoraf 11 viste signifikant overekspression og 8 viste nedregulering (tabel S3b). Sammenligninger af det metastatiske patientgruppe versus BPH gruppen identificerede den differentielle ekspression af 35 proteiner, med 19 proteiner viser signifikant overekspression og 16 viser signifikant nedregulering (tabel S3C). Endvidere blev C-reaktivt protein (CRP) fundet at være forhøjet 41,1 fold i serum fra patienter med metastatisk sygdom sammenlignet med patienter med BPH (tabel S2).

Prognostisk biomarkør fører

Når en diagnose af kræft er blevet gjort de næste skridt er at fastslå omfanget (etape) af sygdom, i et forsøg på at forudsige de patienter, hvor sygdommen sandsynligvis vil videre fra patienterne, hos hvilket sygdommen sandsynligvis vil forblive lokaliseret, og at opnå prognostisk information. I øjeblikket er forbehandling PSA niveauer, biopsi Gleason kvalitet og klinisk iscenesættelse bruges til at give prognostisk information; imidlertid er disse parametre associeret med en række begrænsninger. Således er en sammenligning af patienter med forløber versus ikke-skrider sygdommen identificeres den betydelige differentiel ekspression af 25-proteiner; 13 opreguleret og 12 nedreguleres (tabel S4).

Differential proteinniveauer forbundet med sygdomsprogression

Udover ovennævnte sammenligninger, protein forskelle blev kortlagt ifølge den fase af prostata cancer udviklingen og progressionen dvs. som kræft udviklet fra ikke-maligne epitel og skred frem til lokalt fremskreden og metastatisk sygdom (figur 2). Listerne over forskelle er baseret på sammenligninger mellem den ikke-forløber versus BPH gruppe; forløber versus ikke-forløber gruppe; og metastatisk versus forløber cancer grupper. Fra figur 2 fremgår det, at individuelle proteiner, “par” af proteiner og »panelernes af proteiner (defineret som ≥3 proteiner), der anses for at differentielt udtrykt i bestemte faser af sygdomsudvikling og progression. For eksempel blev individuelle proteiner, såsom alfa-2-makroglobulin, lumican og serumamyloid P-komponent ses at være differentielt udtrykt mellem den ikke-forløber versus BPH gruppen. Andre proteiner såsom beta-2-glycoprotein 1 og somatomedin-B (blå skrift), blev begge set at være relativt faldet som en “par” i forløber versus ikke-skrider prøver, mens både apolipoprotein A-1V og Suppler komponent 4B var ses at være relativt forøget i ekspression i metastatiske prøver versus forløber prøver (orange skrift). Derudover to »paneler«, blev set at blive ændret som sygdommen udvikles og skred frem. Det første panel består af 3 proteiner: afamin, alpha-2-HS-glycoprotein kæde B og fibronectin 1 (vist med rødt skrifttype), og blev set at være relativt forøget i ekspression i ikke-forløber versus BPH gruppen, men faldt som kræft skred frem, og forblev forholdsvis lav som kræft spredt. Det andet panel består af 7 proteiner: alpha-1-antichymotrypsin; cDNA FLJ55673, meget lig at supplere faktor B; cDNA FLJ54228, meget ligner leucin-rige alfa-2-glycoprotein; cDNA FLJ58564, meget ligner plasma protease C1-hæmmer; Ceruloplasmin, Supplere C5 og Suppler komponent C9b (grøn skrift), og blev set at være forholdsvis faldet i udtryk i den ikke-forløber gruppen sammenlignet med BPH gruppe, og relativt steget i udtryk som kræft skred dvs. blev relativt forøget i forløber gruppe og forblev forhøjet i metastatiske gruppe

listen over differentielt udtrykte proteiner viste, er baseret på sammenligninger mellem ikke-forløber versus BPH.; forløber versus ikke-forløber og metastatisk versus forløber grupper. Bemærk den differentielle ekspression af proteiner enten individuelt (sort skrift), som par (blå, orange og lilla skrifttyper), eller som et panel (≥3 proteiner, grøn og rød skrifttype). (*) = Identificeret som en enkelt høj tillid peptid.

Interessant, eukaryote oversættelse forlængelse faktor 1 alfa 1 (eEF1A1), (alias EF-Tu), blev set at vise signifikant øget udtryk i ikke -progressing kræft i forhold til BPH, og dets ekspression blev yderligere forøget med sygdomsprogression, og blev fastholdt i metastase (tabel S2 og figur 2). eEF1A1 var den øverste hit efter BLASTP søgning af VETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVK peptid identificeret i serumprøver. Sammenligning af den fulde længde aminosyresekvens af eEF1A1 med sin isoform eEF1A2, indikerede, at peptidsekvensen var unik for eEF1A1. Det tilsvarende peptid i eEF1A2 afviger med en enkelt aminosyre, hvor valin er substitueret med isoleucin. Da disse aminosyrer har en 14 Da forskel i molekylmasse kunne vi trygt tildele den identificerede peptid til at svare til eEF1A1 isoformen.

Bekræftelse af kandidater identificeret af iTRAQ

For at bekræfte forskellen udtryk for kandidat proteiner identificeret af iTRAQ, vi efterfølgende udført en 1D-gelelektroforese hjælp samlet serum fra de 4 patientgrupper. Efter farvning med Coomassie blue, blev et svagt bånd visuelt ses at være til stede på et lidt højere intensitet i prøverne fra patienter med metastatisk sygdom i forhold til de andre 3 grupper af patienter (data ikke vist). Dette bånd blev udskåret fra gelen, spaltet med trypsin og de resulterende peptider analyseret ved LC-MS /MS. Massespektrometri data identificeret 7 peptider matchende til CRP med en sekvens dækning på 27,6%, og bekræftede iTRAQ data. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.