PLoS ONE: Novel Lignan og Stilbenoid Blanding Shows anticarcinogenic Effekt i Prækliniske PC-3M-luc2 Prostata Cancer Model

Abstrakt

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform af mænd i den vestlige verden, og nye tilgange til reduktion prostatakræft risiko er nødvendige. Plant-afledte phenolforbindelser dæmpe prostatakræft vækst i prækliniske modeller af flere mekanismer, som er i overensstemmelse med epidemiologiske fund tyder på, at forbruget af plante-baserede kost er forbundet med lav risiko for prostatakræft. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere virkningerne af en ny lignan-stilbenoid blanding i PC-3M-luc2 humane prostata kræftceller

in vitro

i ortotopisk xenotransplantater. Lignan og stilbenoid rig ekstrakt blev opnået fra skovfyr (

Pinus sylvestris

) knob. Pine knude ekstrakt samt stilbenoider (methyl pinosylvin og pinosylvin), og lignaner (matairesinol og nortrachelogenin) til stede i fyrretræ knude ekstrakt viste antiproliferative og proapoptotiske effekt på ≥40 uM koncentration

in vitro

. Endvidere pine knude ekstrakt udvundet stilbenoider forbedret tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) induceret apoptose allerede ved ≥10 pM koncentrationer. I orthotopisk PC-3M-luc2 xenograft bærende immunokompromitterede mus, blev tre-ugers peroral eksponering for fyrretræ knude ekstrakt (52 mg lignaner og stilbenoider pr kg kropsvægt) veltolereret og udviste anti-tumorigen virkning, påvist ved flerdimensional analyse kombinerer væsentlige markører for tumorvækst (dvs. tumorvolumen, vaskularisering og celleproliferation). Methyl pinosylvin, pinosylvin, matairesinol, nortrachelogenin, samt resveratrol, en metabolit af pinosylvin, blev påvist i serum ved total koncentration på 7-73 uM, hvilket bekræfter biotilgængeligheden af ​​fyrretræ knude ekstrakt udvundet lignaner og stilbenoider. Sammenfattende vores data indikerer, at fyrretræ knude ekstrakt er et hidtil ukendt og omkostningseffektiv kilde til resveratrol, methyl pinosylvin og andre bioaktive lignaner og stilbenoider. Pine knude ekstrakt viser anticarcinogenic effekt i prækliniske prostatakræft model, og vores

in vitro

data tyder på, at forbindelser afledt af ekstraktet kan have potentiale som nye kemosensibilisatorer til TRAIL. Disse resultater fremme yderligere forskning i sundhedsrelaterede anvendelser af træ biokemikalier

Henvisning:. Yatkin E, Polari L, Laajala TD, Smeds A, Eckerman C, Holmbom B, et al. (2014) Novel Lignan og Stilbenoid Blanding Shows anticarcinogenic Effekt i Prækliniske PC-3M-luc2 Prostata Cancer Model. PLoS ONE 9 (4): e93764. doi: 10,1371 /journal.pone.0093764

Redaktør: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, USA

Modtaget: Januar 13, 2014 Accepteret: 8 Mar 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Yatkin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af FIBIC finske Bioeconomy Cluster, den BioRefine program finske Funding Agency for Teknologi og Innovation, og Academy of Finland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform af mænd i Nordamerika, Vesteuropa, Østeuropa og Skandinavien. Den lange naturhistorie PCa præsenterer et relativt bredt tidsvindue for kosten eller farmakologiske interventioner, der kunne manifestere som reduktion i forekomsten, tilbagefald, sygelighed eller progression af sygdommen [1]. Foreslåede modificerbare risikofaktorer for PCa, der giver potentielle mål for forebyggelse omfatter inflammation, steroidhormoner og deres receptorer, fedme, hyperkolesterolæmi og kostfaktorer [2]. Naturlige phenolforbindelser, besidder anticarcinogenic egenskaber, kan tilbyde interessante muligheder for reduktion af kræft byrde [3], [4]. Dog er brug for flere data om deres effekt og virkningsmekanismer fra relevante prækliniske modeller, for at vælge de optimale forbindelser eller blandinger til kliniske forsøg og produktudvikling.

Træer er en rigelig kilde til phenolforbindelser, strukturelt identisk med eller ligner dem i spiselige planter [5]. Disse forbindelser kan let isoleres fra træ ved hydrofil ekstraktion efter fjernelse af lipofile ekstraherende stoffer af hexan-ekstraktion [6]. Træ-afledte ekstrakter er således en omkostningseffektiv kilde til naturlige phenolforbindelser, og en attraktiv mulighed for udvikling af nye sundhedsfremmende produkter.

Plant phenolforbindelser, såsom lignaner og stilbenoider, modulere flere vigtige biologiske processer i pattedyrceller [7], [8], og vise anticarcinogenic egenskaber i prækliniske PCA-modeller. Rug eller hørfrø-holdige kost, som har et højt lignanindhold samt en kost suppleret med en træ-afledt plante lignan, 7-hydroxymataresinol (HMR), inhibere væksten af ​​PCa i

in vivo

[ ,,,0],9], [10], [11], [12]. Tilsvarende har planteafledte stilbenoider, resveratrol (RV) og pterostilbene blevet rapporteret at undertrykke væksten af ​​PCa

in vivo

[13]. Flere mulige mekanismer, hvorved lignaner og stilbenoider kan udøve deres anticarcinogenic handlinger i PCa er blevet identificeret, herunder cellecyklus arrest og induktion af apoptose [14], [15], hæmning af celledeling [16], [17], tumorvaskularisering [18], modulation af cytokin profil [19], og sensibilisering af kræftceller til programmeret celledød [20], [21], [22].

tumornekrosefaktor-Related apoptoseinducerende ligand (TRAIL ) -medieret apoptose er for nylig blevet identificeret som en interessant mål for lignaner og stilbenoider. TRAIL er et protein, der fungerer som en ligand, som aktiverer en død-signalvejen især i cancerceller med minimal toksicitet over for normale væv [23]. Modstand mod TRAIL er almindelig i PCa, og forbindelser, der bevidstgøre PCa til TRAIL er i øjeblikket under aktiv efterforskning. Interessant lignaner, såsom matairesinol (MR), og nortrachelogenin (NTG), samt RV øge antitumoraktiviteten af ​​TRAIL i PCA-celler [21], [22] eller xenografter [18].

Eksperimentel undersøgelser tyder således at naturlige lignaner og stilbenoider dæmpe PCa vækst via talrige virkningsmekanismer. Det er derfor, plausibelt at foreslå, at kombinationen af ​​de to grupper af phenolforbindelser kan tilbyde yderligere fordele i forhold til brugen af ​​enkelte forbindelser. Dog findes ingen offentliggjorte data på den kombinerede effekt af lignaner og stilbenoider i kontrollerede eksperimentelle indstillinger. I denne undersøgelse, vi vist væksthæmmende effekter af fyrretræ knotwood ekstrakt (PKE), rig på lignaner og stilbenoider, i PC-3M-luc2 humane PCA celler

in vitro

in vivo

. Desuden bekræftede vi biotilgængeligheden af ​​PKE-afledte fenoler, og identificeret de forbindelser, der kan tage højde for de anticarcinogenic virkninger af PKE.

Materialer og metoder

Etik Statement

Animal pleje og brug blev gennemført i henhold til den finske lov om dyreforsøg og EU-love, retningslinjer og anbefalinger. Alle undersøgelser blev godkendt af den nationale dyreforsøg Board i Finland (License nummer 1993 /04.10.03 /2011).

Forberedelse og kemisk karakterisering af PKE

Skovfyr knob blev opnået fra en industriel papirmasse mølle proces (såkaldt sten fælde) (UPM Tervasaari, Valkeakoski, Finland). Knuderne blev formalet, sigtet ( 2 mm), frysetørret og ekstraheret sekventielt med

n

-hexan ved 90 ° C (3 x 5 min) og ethanol-vand (95:5 efter volumen .) ved 100 ° C (3 x 5 min) under anvendelse af ekstraktion accelereret solvent. Den PKE blev kemisk karakteriseret ved GC-flammeioniseringsdetektion (FID), GC-MS og ved højtydende gelpermeationskromatografi med evaporativ lysspredende detektion (HPSEC-ELSD). GC-FID, GC-MS, og HPSEC-ELSD analyser blev udført som tidligere [24] beskrevne. GC-FID blev anvendt til kvantificering af komponenterne i ekstraktet, der elueret fra GC-kolonne. Kvantificeringen var baseret på tre eksemplarer analyser af samme ekstrakt. Heneicosansyre syre blev anvendt som intern standard, med Kalibreringsfaktorerne 1,00. De individuelle forbindelser detekteres ved GC-FID blev identificeret ved GC-MS, ved brug af kommerciel og laboratoriets egne spektrale biblioteker. Det molære massefordeling PKE komponenter blev bestemt ved HPSEC-ELSD

De store sammensatte grupper i PKE var:. Lignaner (16%), stilbenoider (17%), oxiderede harpikssyrer (20%), harpikssyrer (24%) og højere molær-masse forbindelser (550-4000 Da, 18%). Koncentrationerne (vægt-% af tørstof) af de vigtigste GC-detekterbar phenoler i PKE blev pinosylvin monomethylether (MEPS, 10,2%), NTG (7,0%), pinosylvin (PS, 4,0%), MR (1,5%) , abietinsyre (1,5%), og pinostilbene (0,4%). GC-detekterbar harpikssyrer udgjorde 21,8% af den tørre vægt af PKE. Mindre mængder ( 0,1-0,5%) af lignaner HMR, conidendric syre, secoisolariciresinol og todolactol A blev fundet

Reference og Test Forbindelser

Forberedelse og renhed af lignaner HMR, MR. , NTG, secoisolarici-, larici-, cyclolarici-, 7-oxomatai-, pino-, og medioresinol, α-conidendrin, enterolactone, 7-hydroxyenterolactone, MR-

d

6, og enterolactone-

d

6 er blevet beskrevet tidligere [25], [26]. Den stilbener PS og MEP’er og harpiksen syre dehydroabietinsyre (renheder 95%) blev fremstillet på Laboratoriet for træ og papir kemi ved Åbo Akademi ved isolering af træ og rensning ved flashchromatografi (Biotage Flash 40i) med silica kolonner. RV og enterodiol var fra Sigma-Aldrich Co., pinostilbene fra TCL Pharma Chem., Inc (Vaughan, ON, Canada) og

O

-methylpodocarpic, neoabietinsyre og abietinsyre fra Helix Biotech Corp. (CanSyn Chem Corp, Toronto, Canada).

for at studere de kombinerede effekter af ren PKE-afledte lignaner og stilbenoider

in vitro

, vi udarbejdet en lignan-stilben blanding (LS-blanding), der indeholder de fire mest udbredte PKE-afledte forbindelser i molære forhold ligner PKE (tabel 1).

Cell kultur og spredning, apoptose og cellecyklus assays

PC-3M-luc2 celler (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) blev dyrket i Dulbeccos s phenolrødt-frit modificerede Eagle-medium suppleret med 50 IU /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum ( Invitrogen, Paisley, UK). Cellerne blev holdt i en befugtet 5% CO

2 /luftatmosfære ved 37 ° C.

I celleproliferation assay blev PC-3M-luc2 celler podet i en 96-brønds plade (1500 celler per brønd). Dimethylsulfoxid stamopløsninger af PKE (1-100 mg /l), oprensede forbindelser (1-100 uM) eller dimethylsulfoxid kontroller fremstillet i dyrkningsmedium blev tilsat til brønde (seks gentagelser). Efter 48 timer blev celleproliferationen målt med celleproliferation ELISA BrdU immunoassay-kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

I apoptose assay, PC-3M-luc2 celler blev podet i en 96 brønds plade. Når 60-80% konfluente halvdelen af ​​mediet blev fjernet og erstattet med medium indeholdende træ-afledte forbindelser (slutkoncentrationer 1-40 mg /l). Efter 48 timer blev cellerne løsrevet med trypsin og sprængt med 0,4 M citratpuffer i PBS indeholdende 0,3% Triton-X (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO). Kerner og nukleare fragmenter blev mærket med propidiumiodid (Sigma). For at bestemme den del af sub-G0 /G1-hændelser blev prøver analyseret med flowcytometer (BD LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Til vurdering af TRAIL følsomhed blev celler behandlet med en kombination af træ afledt forbindelser (som ovenfor) og human TRAIL /Apo2L (kat. Nr. C-63.600, Promokine, Heidelberg, Tyskland) ved koncentrationer på 3, 25, 50 og 100 . ng /ml

ortotopisk PC-3M-luc2 i athymiske mus

Hsd: athymiske nøgne – Foxn1

nu hanmus (5-6 uger gamle) købt fra Harlan Laboratories (Horst, Holland) blev huset i aseptiske forhold i Central Animal Laboratory ved University of Turku. Musene blev akklimatiseret i to uger; forsynet med soja-fri naturlig ingrediens diæt (RM3, SDS, Essex, UK) og postevand

ad libitum

.

PC-3M-luc2 celler, der anvendes i ortotopisk xenograft eksperiment blev dyrket i RPMI 1640 phenolrødt-frit medium suppleret med 50 IU /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum. Cellerne blev holdt i en befugtet 5% CO

2 /luftatmosfære ved 37 ° C. PC-3M-luc2 celler (1 x 10

6 celler i 20 pi almindeligt RPMI 1640-medium) blev podet i dorsolaterale prostata gennem en abdominal incision under isofluran-narkose. For smertelindring blev mus givet buprenorphin (TEMGESIC, 0,05-0,1 mg /kg

sc

.) Og carpofen (Rimadyl, 5 mg /kg

sc

.) Før og efter operationen, henholdsvis. Tumorvækst blev efterfulgt af bioluminescens billeddannelse med IVIS Lumina II, udstyret med XGI-8 Gas Anæstesi System (Caliper Life Sciences, Runcorn, UK). Mus blev bedøvet med isofluran, injiceret

ip

med 150 mg /kg D-luciferin (Xenogen kat. Nr. XR-1001, Oregon, USA) 10 min før billeddannelse, og bioluminescens blev kvantificeret under anvendelse LivingImage 4.09A carbon software (Xenogen).

En uge efter podning, tumor-fri dyr blev identificeret ved bioluminescens billeddannelse og udelukket fra studiet. Tumorbærende mus blev tildelt i køretøjet (kontrol), lav dosis (32 mg /kg) eller høj dosis (160 mg /kg) PKE grupper. Lav og høj dosis indeholdt ca. 5,0 og 5,4, og 25 og 27 mg af lignaner og stilbenoider hhv. PKE blev opløst i en bærer indeholdende 10% (v /v) af absolut ethanol og 90% (v /v) majsolie. Både bilen og PKE blev tvangsfodret

p.o.

Dagligt. Mus blev vejet ugentligt, og bioluminescens billeddannelse blev udført to gange om ugen.

I den tredje uge af behandlingen 24-h urinprøver blev opsamlet i metaboliske bure (5-6 mus pr bur). Urin blev opsamlet i krukker indeholdende 0,15 M natriumazid og 0,56 M ascorbinsyre som konserveringsmidler. Urinprøver blev centrifugeret og opbevaret i -20 ° C indtil analyse.

Efter tre ugers behandling blev musene aflivet med CO

2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Blod blev opsamlet via hjertepunktur, centrifugeret, og serummet blev separeret og opbevaret i -70 ° C indtil analyse. Tumorerne blev dissekeret og vejet, og tumorstørrelsen blev målt med en skydelære i tre dimensioner. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: volumen (mm

3) = (længde × bredde × højde) × π /6. Tumorerne blev fikseret i 10% neutral bufret formalin og bearbejdet til paraffin indlejring og anvendt til immunohistokemisk analyse.

Analyse af lignaner og stilbenoider Mouse Serum og urin

Serum (50 pi) og urin ( 300 pi) prøver blev hydrolyseret og fastfase-ekstraheret som beskrevet tidligere med nogle modifikationer [25], [27]. Til hydrolyse blev en frisk fremstillet β-glucuronidase /-sulphatase i 10 mM natriumacetatpuffer (pH 5,0) tilsat til serum- og urinprøver og inkuberet i 19 timer ved 37 ° C. Efter hydrolysen blev interne standarder tilsættes til prøverne: MR-

d

6 for plante lignaner og stilbener, EL-

d

6 for enterolignans (endelige koncentrationer ~ 1 ug /ml), og

O

-methylpodocarpic syre for harpikssyrer (slutkoncentration -3 ug /ml). Den faste fase ekstraheret og inddampet serum- og urinprøver [25] blev genopløst i 150 pi og 500 pi methanol /0,1% eddikesyre 20:80 (v /v), henholdsvis. De PKE komponenter og deres metabolitter blev kvantificeret ved hjælp af HPLC-MS /MS med multipel ion overvågning i negativ ion-mode som tidligere [24] beskrevet. De optimerede flere ion overvågning overgange var den deprotonerede molekylære ion og de følgende fragmenter i MS

2 (

m /z

); PS 169 18; MEP’er 182 20; RV 143, 22; pinostilbene 225. De harpikssyrer dannede ingen fragmenter i MS

2. De anvendte kegle spændinger var 40 V for stilbener og 48 V for de harpikssyrer. De kollisionsenergier var omkring 20 eV for stilbener og 5,0 eV for harpikssyrer. De MS-parametre for de analyserede lignaner er tidligere blevet [26] beskrevne. De kvantificeringer blev udført ved hjælp af standard opløsninger indeholdende de interne standarder og seks koncentrationen af ​​analytter som tidligere beskrevet [26].

Immunohistokemi og Påvisning af apoptotiske celler i tumorprøver

For von Willebrand faktor (vWF, fortynding: 1:4000, ab6994-100, Abcam, Cambridge, UK) og phospho-histon H3 (pH-H3, fortynding: 1:200, Ser10, cellesignalering) immunhistokemi blev vævssnit deparaffineret, rehydreret, og inkuberet i 10 mM Tris-EDTA, pH 9 (for vWF-farvning) eller i 10 mM natriumcitrat pH 6 (til pH-H3-farvning) puffer, i en mikrobølgeovn for antigen hentning. Den endogene peroxidase aktivitet blev blokeret med 3% H

2O

2. Efter skylning med PBS blev snittene inkuberet med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 10 minutter, og mærket med vWF eller pH-H3-antistoffer i 60 minutter ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved + 4 ° C, hhv. Peberrodsperoxidase-mærket polymer anti-kanin (DAKO Envision system Dako) blev anvendt som et sekundært antistof. Diaminobenzidin (Dako) blev påført til afsnittene efterfulgt af Mayers hematoxylin og montering.

Den terminale deoxynucleotidyltransferase biotin-dUTP nick endemærkning (TUNEL) metode blev anvendt til bestemmelse apoptotiske celler i tumorsnit. Analysen blev udført under anvendelse ApopTag Peroxidase in situ Apoptose Detection Kit (Chemicon International, Hampshire, UK) ifølge producentens instruktioner. Snittene blev deparaffineret, rehydreret og behandlet med 10 mM natriumcitratbuffer i mikrobølgeovn i antigen-genvinding. Den endogene peroxidase aktivitet blev blokeret med 3% H

2O

2. For positiv kontrol blev en sektion inkuberet med DNase I (Invitrogen) i 30 minutter ved + 37 ° C. For TUNEL blev snit inkuberet med 0,8 U /pl TdT reaktionsblanding: TdT puffer, 4 U /pl transferase, 25 mM CoCl

2 (Terminal transferase, Roche, Mannheim, Tyskland), biotin-16-dUTP (Roche ) og MilliQ vand; og for den negative kontrol, blev en sektion inkuberet med TUNEL-reaktionsblandingen uden transferase i en time ved + 37 ° C. TUNEL reaktionen blev standset med 300 mM NaCl, 30 mM natriumcitrat i dH

2O (15 minutter ved stuetemperatur). Uspecifikke sites blev blokeret med 3% BSA /PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. ExtrAvidine®-Peroxidase 1:500 (Sigma) blev påført i 1% BSA /PBS i 30 minutter ved + 37 ° C, hvorefter diaminobenzidin blev påført, og snit blev farvet med Mayers hematoxylin og monteret.

Kvantificering af celleproliferation og apoptose indekser, og Blood Vessel Density og længde

Farvede sektioner blev scannet med en virtuel mikroskop (Digital Virtual Microscope, Soft Imaging System, Olympus, Tyskland). Antallet og længden af ​​vWF-positive kar blev kvantificeret i tre eller fire udvalgte områder ved hjælp af måling værktøj af dotSlide program (Soft Imaging System). Kvantificeringen af ​​pH-H3 og TUNEL-positive celle i tumor sektioner blev udført med brugerdefinerede funktioner udviklet til væv billedanalyse af Quva Ltd (Tampere, Finland). Først blev billederne opnået fra scannede dias normaliseret for intensitet og farvevariationer. Forarbejdning blev fortsat ved billedanalyse tærskling, som detekterer områder med passende farve skal betragtes som positivt farvede målceller. Endelig blev uvedkommende afsløringer filtreret ud af størrelse og form oplysninger, og de resulterende celler blev visualiseret i røde pletter i det originale billede.

Statistiske Analyser

De univariate analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 4.00 til Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). I normalfordelte data, blev anvendt den envejs variansanalyse og Tukey post-hoc test; Ellers blev Kruskal-Wallis eller ikke-parametrisk t-test anvendt. Alle data præsenteres som gruppe middelværdi ± SEM. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

s

. 0,05

Parvis multivariate sammenligninger af gruppens midler (f.eks μ1 og μ2) blev testet med Mahalanobis afstand (MD) 🙁 1)

Mahalanobis afstanden er en velkendt multivariat statistik, som inkorporerer lineære korrelationer af kovariater gennem kovariansen-varians matrix

S

, med dimension svarende til antallet af kovarianter [28]. Ved at samle supplerende oplysninger fra indbyrdes forbundne faktorer, og som har følsomhed over for mønstre afviger fra de vigtigste tendenser [29], MD er en bekvem statistik til at teste mere subtile behandlingseffekt potentielt savnet af de univariate test. I særlige tilfælde, MD reducerer til den standardiserede euklidiske afstand, hvis

S

er en diagonal matrix, og for den almindelige euklidiske afstand, hvis

S

er en enhed matrix, og dermed links nøje til den konventionelle

t

statistik afprøvning af uafhængige tumorvækst markører. Statistisk signifikans af afstanden

D

blev evalueret ved tilfældig permutation af klassen etiketter i de to-stikprøvetest (Vehicle vs. Low dosis eller Vehicle vs. Høj dosis) [30]. De null fordelinger blev opnået ved at køre 100.000 simuleringer af sådanne tilfældigt genererede afstande og de empiriske

p

-værdier blev defineret som andelen af ​​tilfældige afstande større end eller lig med den observerede afstand

D

.

Resultater

PKE og dens komponenter Inhibit PC-3M-luc2 Cell Proliferation og inducere apoptose

in vitro

PKE betydeligt svækket PC-3M-luc2 celleproliferation på ≥40 mg /l (fig. 1A), demonstreret ved reduceret inkorporering af BrdU. I tråd med dette, de vigtigste bestanddele af PKE, stilbenoider (MEP’er og PS), samt lignaner (MR og NTG) hver signifikant hæmmede celleproliferation ved 40-100 uM koncentration (fig. 1B). Endvidere kombination af disse fire forbindelser (MEP’ere, PS, MR, og NTG), i samme forhold som er til stede i PKE (lignan-stilben, LS, blanding), reduceret BrdU-inkorporering på en måde svarende til den oprindelige ekstrakt (fig. 1C). PKE (40 mg /l) og LS-blanding (40 uM), både øget apoptose sats, påvist ved flowcytometrisk analyse (fig. 2A). PKE induceret standsning af cellecyklus, dvs. øget den del af ikke-apoptotiske celler i G0 /G1 (fig. 2B), og henholdsvis faldt den del af cellerne i S og G2 /M-faser. Desuden PKE (10 og 40 mg /ml) sensibiliserede PC-3M-luc2 celler til TRAIL-induceret apoptose (fig. 3A). LS blandingen og alle de testede PKE-afledte forbindelser (MEP’er, NTG, PS, MR, og RV), undtagen abietinsyre, væsentligt forbedret TRAIL-medieret apoptose (fig. 3B), PS, parlamentsmedlemmer og MR viser de mest markante effekter . Salg

a) Celler blev behandlet med PKE eller en blanding af dets vigtigste lignaner og stilbenoider (LS blanding) i 48 timer. B) Celler blev behandlet med individuelle PKE afledte forbindelser i 48 timer. Celleproliferation rate udtrykt som procent af kontrol blev målt med BrdU assay. Dataene er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive køretøj behandling (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

Apoptose satser og antallet af celler i G0 /G1 fasen er udtrykt i forhold til køretøjets kontrol (Ctrl = 1). Cellerne blev behandlet med testforbindelser i 48 timer og apoptose sats og cellecyklus fase blev bestemt med flowcytometer. LS, blanding af de vigtigste PKE lignaner og stilbener; MEP’er, pinosylvin monomethylether; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, abietinsyre; RV, resveratrol. Dataene er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive Ctrl. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

A) Celler blev behandlet med PKE i kombination med stigende koncentrationer af humant TRAIL (0-100 ng /ml), værdier er procenter af nuklear fragmentering. B) Celler blev behandlet med PKE, LS blanding, eller med individuelle PKE forbindelser i kombination med human TRAIL (25 ng /ml), værdier er relative apoptose satser (CTRL = 1). Cellerne blev behandlet med testforbindelser i 48 timer og nuklear fragmentering blev bestemt med flowcytometer. LS, blanding af de vigtigste PKE lignaner og stilbener; MEP’er, pinosylvin monomethylether; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, abietinsyre; RV, resveratrol. Dataene er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive køretøj behandling (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Effekt af PKE på ortotopisk PC-3M-luc2 xenograft Volume, Cell Proliferation og angiogenese

. Tre ugers daglig indtagelse af PKE var veltolereret, og ingen tegn på bivirkninger blev observeret på noget tidspunkt. PKE reducerede signifikant proliferation index (fig. 4A) og længden af ​​blodkar (dvs. omkredsen) i PC-3M-luc2 tumorer (fig. 4B). En tendens til reduceret bioluminescens og PCA tumor volumen blev observeret i højere PKE dosis (160 mg /kg) gruppe (fig. 4C og D). Ingen signifikante ændringer blev observeret i apoptose-indekset, som kvantificeret fra TUNEL-farvede tumor sektioner (data ikke vist). Den multivariate sammenligning af det udskårne tumorvolumen, log-transformeret tumor bioluminescens, apoptose og proliferation indekser, og blodkar tæthed og længde blev udført under anvendelse af MD statistik (Eq. 1). Hvor responsen blev testet med hensyn til den kombinerede virkning af disse 6 kovariater (fig. S1), der var en signifikant forskel mellem køretøjet og højdosis PKE grupper (p = 0,0051, fig. 5A), mens køretøjet og lavdosis PKE grupper var ens (p = 0,4195, fig. 5B). Interessant, den kombinerede vurdering af kovariater og deres samspil klart adskilt køretøjet og højdosis PKE grupper (fig. 5C, med de 3 vigtigste funktioner visualiseret). Den slutning drages af denne kombinerede analyse var dybt forskellig fra de uafhængige univariate analyser (Fig 4.) for eksempel den multivariate tilgang registreret, at nogle tumorer havde reduceret vaskularisering (

fartøjets længde

), mens andre havde reduceret størrelse (

tumorvolumen

), og derfor gav en flerdimensionel visning af behandlingseffekt . Den oprindelige tumor målinger er vist i den supplerende materiale som bivariate (fig. S1) og univariate plots (Fig. S2). Den beregnede varians-kovarians struktur

S,

efter skalering til korrelationsmatrix, er vist i fig. S3. Som forventet, de relaterede faktorer, såsom tumor volumen og tumor bioluminescens eller fartøj tæthed og fartøjets længde, var stærkt korreleret, og deres afstande blev effektivt grupperet i MD-analyse (fig. S3).

A) PKE reducerer celleproliferation indeks. Repræsentative billeder af pH-H3-immunfarvninger er vist. B) PKE falder blodkar længde. Repræsentative billeder af vWF-immunfarvninger er vist. C) Bioluminescens af tumorerne, kvantificeret hver anden uge af

in vivo

billeddannelse. D) Tumorvolumener ved aflivning. Mus blev behandlet dagligt med vehikel (n = 11), PKE 32 mg /kg BWT (n = 10) eller PKE 160 mg /kg BWT (n = 11) i tre uger. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved envejs variansanalyse og Tukey post-hoc test. * P 0,05. Scale barer, 100 um.

C) Tumor volumen, fartøj længde og spredning indeks blev opdaget, da de vigtigste faktorer af forskelle i multivariate analyser. Det hyperplan viser, at to af grupperne (køretøj i sort og høj dosis i grønt) var lineært adskilles, når de tre faktorer blev behandlet samlet. (Hyperplan: 100,55 = 0,104 × Tumor volumen + 0,895 × Proliferation indeks + 21,1 × Vessel længde)

for at vurdere de faktorer, der var mest afgørende for at skelne den højdosis PKE gruppe fra kontrolgruppen, blev en udtømmende test af MD for forskellige kombinationer af de 6 kovariater udført. De mest fremtrædende virkninger blev detekteret som en kombination af tumorvolumen, proliferationsindeks og fartøjets længde. Undersøgelse af samspillet mellem disse tre markører viste, at selv om de enkelte kovariater alene ikke var informativ nok til at skelne de to grupper, når de betragtes samlet, køretøjet og høj-dosis PKE grupper var lineært adskilles med en hyperplan (fig. 5C). Endvidere omend køretøjet og lavdosis-gruppen forskel ikke var statistisk signifikant, den generelle tendens på tværs af de tre grupper foreslog en øget antitumorvirkning med et stigende dosisniveau (som set i rækkefølgen af ​​de sorte, røde og grønne skyer i fig. 5C).

koncentrationer af phenolforbindelser i serum og urin af tumorbærende mus

blev fundet mikromolære koncentrationer af NTG, og MEP’er i serum hos dyr udsat for den højere dosis af PKE ( tabel 2). Harpikssyrer, der var til stede i PKE blev ikke detekteret i serummet eller urinprøver. Interessant væsentlige koncentrationer af RV, som er den monohydroxylerede metabolit af PS, samt pinostilbene, en metabolit af MEPS, blev påvist i serum og urin fra mus fodret med PKE (tabel 2). Desuden koncentrationerne af MR og HMR og deres metabolitter enterolacton, enterodiol, og 7-hydroxyenterolactone samt koncentrationer af parlamentsmedlemmer, PS, NTG, og pinostilbene betydeligt øget i forhold til kontrolgruppen (tabel 2). Stilbenderivater og lignan metabolitter var til stede i serum 15 min-3 timer efter den sidste administration (data ikke vist), og de højeste koncentrationer blev målt ved 2 h (tabel 2). Metabolitprofilen i urinen (24 timer samling) var meget lig den i serum (data ikke vist).

Diskussion

Epidemiologiske og prækliniske studier tyder på en omvendt forhold mellem forbrug af polyphenol-rige fødevarer og forekomsten af ​​kroniske sygdomme, herunder cancer [3], [7], [31]. Især lignaner og stilbener, og deres metabolitter, er attraktive kandidater til reduktion PCa risiko. I denne undersøgelse har vi vist anticarcinogenic virkninger af skovfyr knude ekstrakt (PKE), en blanding rig på lignaner og stilbenoider,

in vitro

in vivo

i en orthotopisk PCa xenograftmodel