PLoS ONE: Anti-tumor effekt af Pinus massoniana Bark Proanthocyanidiner på kræft i æggestokkene gennem Induktion af Cell Apoptose og Hæmning af Cell Migration

Abstrakt

Pinus massoniana

bark proanthocyanidins (PMBPs), en aktive bestanddel isoleret fra

Pinus massoniana

bark, er blevet rapporteret at besidde en lang række biokemiske egenskaber. Her undersøgte vi antitumorvirkning af PMBPs på ovariecancer. Resultaterne indikerede, at PMBPs reducerede signifikant væksten af ​​ovariecancerceller og induceret dosisafhængig apoptose. De underliggende mekanismer involverede blev belyst at omfatte tabet af mitochondriemembranpotential, nedregulering af anti-apoptotiske protein Bcl-2 og aktiveringen af ​​caspase 3/9, hvilket antyder, at PMBPs udløste apoptose gennem aktivering af mitokondrier-associeret apoptotiske vej. Desuden sårheling og transwell kammer assays viste, at PMBPs kunne undertrykke migration og invasion af ovariecancerceller. PMBPs dramatisk inhiberede MMP-9-aktivitet og ekspression, blokerede aktiviteten af ​​NFKB og aktiveringen af ​​ERK1 /2 og p38 MAPK. Vores resultater tyder på, at PMBPs har potentialet til at blive udviklet som en anti-tumor lægemiddel til ovariecancer behandling og /eller sygdom management

Henvisning:. Liu J, Bai J, Jiang G, Li X, Wang J, Wu D, et al. (2015) Anti-tumor effekt af

Pinus massoniana

Bark Proanthocyanidiner på kræft i æggestokkene gennem Induktion af Cell Apoptose og Hæmning af Cell Migration. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10,1371 /journal.pone.0142157

Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institut for Biokemi og Bioteknologi, TAIWAN

Modtaget: May 1, 2015; Accepteret: 19 okt 2015; Udgivet: 5. november 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (No.81302282) (URL: https://www.nsfc.gov.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er stadig den femte mest almindelige form for kræft hos kvinder og den hyppigste årsag til dødsfald i gynækologiske maligniteter [1] .Den første linie behandling af ovariecancer er som regel traditionelle kirurgi kombineret med platin-paclitaxel kemoterapi [2]. På trods af den gode første reaktion i de fleste æggestokkene kræftpatienter, 5-års overlevelse er stadig lav på grund af relapses- en fælles begivenhed efter første linie behandling [3]. Der har været få udvikling i æggestokkene kræftbehandling siden standardisering af cisplatin og paclitaxel narkotika i de sidste 20 år [4]. Der er et presserende behov for at udvikle nye effektive lægemidler til kræft i æggestokkene behandling.

I øjeblikket er nogle naturlige bioaktive phytochemical bruges til at hæmme proliferation eller metastase af cancerceller [5]. En sådan phytochemical er ugiftige og blottet for bivirkninger, og dermed er de gode alternativer og /eller supplement til konventionel cytotoksisk kemoterapi [5]. Den fyr bark ekstrakt blev tidligere betragtet som en ubekvem affaldsprodukt i træindustrien, men nu anerkendt som rig på naturlige proanthocyanidiner med potentielle medicinske egenskaber [6]. Det er blevet påvist, at proanthocyanidins kan anvendes til at forhindre tumor grund af deres evne til at modulere aktiviteten af ​​flere mål, der er involveret i carcinogenese [7]. Derfor har anti-tumor aktivitet af fyrretræ bark ekstrakt fået mest opmærksomhed for nylig.

Pinus massoniana

Lamb af Pinaceae familien er hjemmehørende i syd og sydvest for Kina. Dens bark har været anvendt i traditionel kinesisk medicin til behandling af inflammation, ledsmerter, gigt og cancer [8]. Den vigtigste komponent i

Pinus massoniana

bark er også proanthocyanidiner. Dens antitumoraktivitet er blevet påvist i human hepatomaceller Hep G2-celler, livmoderhalskræft Hela-celler og murine sarcoma S180-celler [9,10,11]. Men virkningerne af

Pinus massoniana

bark proanthocyanidins (PMBPs) på kræft i æggestokkene, og de mekanismer der ligger til grund for processen er endnu ikke afgrænset.

I denne undersøgelse har vi vurderet, om proanthocyanidiner fra

Pinus massoniana

bark kunne udøve anti-tumor effekt på kræft i æggestokkene celler og yderligere undersøgt de detaljerede mekanismer bag denne proces. Vores data kan danne grundlag for den fremtidige udvikling af PMBPs som et effektivt lægemiddel til ovariecancer behandling.

Materialer og metoder

Materialer, reagenser og kemikalier

Antistoffer mod caspase -3, caspase-9, Bcl-2 blev købt hos Cell Signaling Technology (Denver, MA). Antistoffer mod MMP-9, NFKB, kBa og β-actin blev opnået fra Protein Tech Group, Inc. (Chicago, USA). Antistoffer mod phosphoryleret kBa blev ERK1 /2, p38 og JNK opnået fra Sangon Biotech, Kina. Den forbedrede kemiluminescens (ECL) kit blev købt fra Amersham Life Science, Inc. (USA). Den Annexin V-konjugeret FITC apoptose afsløring kit og JC-1 mitokondrie membranpotentiale afsløring kit blev købt fra Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina). Transbrøndene blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, USA). MTT (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid) og DAPI (2- (4-amidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrochlorid) blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). PMBPs pulver blev købt fra Shaanxi Sciphar Hi-tech Industry Co, Ltd (Shanxi, Kina). Det indeholdt ca. 95% proanthocyanidiner og stabil i mindst to år ved 4 ° C.

cellelinier og cellekultur

Ovariecancer cellelinie A2780 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC ) og dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS (begge erhvervet fra Gibco BRL, Grand Island, NY, USA). OV2008 blev venligst stillet til rådighed af Prof. Shiying Cui (Dalian Medical University, Kina) og dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) suppleret med 10% FBS. Normal ovarie epitelcellelinie IOSE80 blev opnået ved canadisk ovarievæv Bank og dyrket i medium 199 (Invitrogen) og MCDB 105 (Sigma) suppleret med 10% FBS. Når cellerne var 80% konfluente, blev de høstet med 0,25% trypsinisering. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af PMBPs med passende tilsvarende kontroller.

Cellelevedygtighed assay

Virkningen af ​​PMBPs på levedygtigheden af ​​celler blev detekteret ved MTT-assayet. Cellerne (1 x 10

4 /brønd) blev podet i 96-brønds plade og inkuberet i 24 timer. Derefter 200 pi medium indeholdende 0, 10, 25, 50, 75, 100 og 120 ug /ml PMBPs blev tilsat til hver brønd. Hver koncentration af PMBPs var seks gange større. Efter 24 timer og 48 timer PMBPs behandling, 20 pi MTT (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. MTT-opløsning blev fjernet, og formazankrystallerne blev opløst i 150 pi DMSO. Opløsningens absorbans blev målt ved anvendelse af et Multiskan Ascent pladelæser ved 540 nm bølgelængde.

DAPI farvning assay

Ca. 4 × 10

4 celler /brønd af ovariecancerceller blev udpladet i 6-brønds plade og efterfølgende behandlet med PMBE ved 0, 25, 50 og 100 ug /ml i 24 timer. Celler i hver brønde blev farvet med DAPI før fastsættelse med 3,7% formaldehyd. Cellerne blev derefter vasket med PBS og analyseret ved fluorescensmikroskopi.

Cell apoptose ved flowcytometri

Efter behandling med 0, 10, 25, 35 og 50 ug /ml PMBPs i 24 timer, ovariecancerceller blev høstet og vasket med PBS tre gange, og derefter inkuberet med Annexin V-FITC og PI i 10 minutter i mørke. Cellerne blev detekteret ved en FACS /Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

Assay for mitokondrie membranpotentiale

Ændringerne om mitokondriel membranpotentiale af ovariecancerceller blev påvist ved flowcytometri under anvendelse JC-1 detektion kit. Efter behandling med 0, 25, 35, 50 ug /ml PMBPs i 24 timer, cellerne blev høstet og inkuberet med JC-1 farvestof i 15 min ved 37 ° C ifølge fabrikantens protokol. Cellerne blev detekteret ved en FACS /Calibur flowcytometer.

sårheling assay

A2780 og OV2008 celler blev podet i plader med 6 brønde og dyrket for at skabe et konfluent monolag. Cellemonolaget blev ridset i en lige linje med en p200 pi pipettespids. Pladerne blev vasket med PBS for at fjerne løsnede celler og derefter inkuberet med komplet vækstmedium indeholdende 0, 5, 10 og 25 ug /ml PMBPs opløsning i 24 timer. Cellemigrering observeret under et fasekontrastmikroskop ved 100 × forstørrelse ved 0 og 24 timer efter induktion af skade. Migrerede celler i det blottede område i hver af seks tilfældige felter blev målt og kvantificeret ved hjælp af en computer-assisteret mikroskop.

Transwell kammer assay

Cell migration og invasion blev kvantificeret ved transwell kammer-analysen. Ovariecancerceller blev behandlet med 0, 5, 10 og 25 ug /ml PMBPs i 24 timer og høstet. 1 × 10

5-celler i serumfrit DMEM blev tilsat til hver øvre kammer og DMEM med 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev celler, der forbliver på den øvre overflade af membranen blev fjernet, og celler, der migrerede til undersiden af ​​membranen farvet med 0,1% krystalviolet i 10 minutter. De migrerede celler på undersiden af ​​membranen blev talt under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. Seks vilkårlige områder af hver transwell membran taltes og gennemsnittet beregnes.

gelatinezymografi

Aktiviteten af ​​MMP-9 blev detekteret ved gelatinezymografi. Tumorcellerne blev behandlet med 0, 5, 10, 25 pg /ml PMBPs i 24 timer. Derefter cellemediet blev opsamlet og centrifugeret for at fjerne cellerester. Lige volumen af ​​klaret medium blev elektroforeret gennem 10% SDS-PAGE-gel indeholdende 0,1% (vægt /volumen) gelatine ved 4 ° C. Gelen blev vasket med vaskebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM NaCI og 2,5% Triton X-100) og efterfølgende inkuberet i aktivering buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2, 0,02% NaN

3 og 1 pM ZnCl

2) ved 37 ° C natten over. Derefter blev gelen farvet med 0,25% (vægt /volumen) Coomassie brilliant blue i 45% (v /v) methanol og 1% (v /v) eddikesyre og affarves med 10% isopropanol /10% eddikesyre (volumen /volumen ) løsning. MMP-9 bånd blev observeret ved 92 kDa.

Udarbejdelse af total cellelysat og

nukleare fraktion

For total cellelysat, cellerne blev homogeniseret i RIPA buffer (Beyotime, Jiangsu, Kina). Cellelysater blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev opsamlet. Nuklear fraktion blev ekstraheret ved en modificeret fremgangsmåde (Yeh, 2012). Kort beskrevet blev celler behandlet med buffer A (10 mM HEPES, 10 mM KC1, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 0,2% NP-40, 1 mM DTT og 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid) og nukleare pellets blev opsamlet ved centrifugering ved 3000 rpm i 30 sekunder ved 4 ° C. Den nukleare fraktion blev derefter ekstraheret med buffer B (20 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl

2, 0,1 mM EDTA, 420 mM NaCl, 1 mM DTT og 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid).

Western blot assay

totale cellelysater eller nukleare ekstrakter blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og derefter overført på en nitrocellulosemembran ved halvtør apparat i 1 time. Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time og derefter inkuberet med det specifikke primære antistofopløsning natten over ved 4 ° C. Efter inkubation med det passende anti-arter sekundært antistof i 1 time, blev proteinbåndene visualiseret ved ECL kit. Salg

Statistisk analyse Salg

Dataene blev analyseret statistisk ved anvendelse af Students t-test og præsenteret som gennemsnit ± SD for tre uafhængige forsøg. SPSS 15,0 software blev anvendt til analyser. Værdien af ​​P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Virkningerne af PMBPs på levedygtigheden af ​​ovariecancerceller

Virkningerne af PMBPs på levedygtighed i æggestokkene. cancerceller og normale ovarieceller blev først påvist ved MTT-assayet. Ovariecancerceller A2780 og OV2008 samt normale ovarieceller IOSE80 blev behandlet med forskellige koncentrationer af PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) i 24 timer eller 48 timer. Æggestokkene kræftceller efter PMBPs behandling viste en dramatisk reduktion i cellernes levedygtighed fra 25 pg /ml i en dosisafhængig måde (

P

0,01), mens samme koncentrationer ikke væsentligt påvirker levedygtigheden af ​​normale ovarieceller IOSE80 (fig 1A). IC50-værdien af ​​PMBPs var 48 ± 2,4 pg /ml for A2780 og 67 ± 2,7 pg /ml til OV2008 ved 48 h (Fig 1a).

(A) ovariecancerceller A2780 og OV2008, samt normalt ovarie celler IOSE80 blev behandlet med PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) i 24 timer eller 48 timer. Cellernes levedygtighed ved de forskellige koncentrationer af PMBPs blev detekteret ved MTT-analyse og udtrykkes i forhold til den for ikke-behandlede celler. Forsøgene blev gentaget tre gange. (B) ovariecancerceller A2780 og OV2008, og normale ovarieceller IOSE80 blev behandlet med PMBPs (0, 25, 75, 100 ug /ml) i 24 timer, og cellerne blev fotograferet med inverteret kontrast mikroskopi (forstørrelse, 40 ×).

Desuden blev de morfologiske forandringer af ovariecancerceller undersøgt under et fasekontrastmikroskop. A2780 og OV2008 celler dyrket uden PMBPs viste karakteristiske normal form med 70% sammenløb efter 24 timer. Imidlertid blev cellernes sammenflydning dramatisk reduceret med indlysende morfologiske ændringer efter PMBPs behandling. Cellerne begyndte at skrumpe, mistede deres normale form, blev runde og i sidste ende frigøres fra dyrkningsskålen (Fig 1B). I modsætning hertil har vi ikke overholde disse morfologiske ændringer i normale æggestokkene celler, IOSE80, følgende PMBPs behandling (Fig 1B). Alle sammen, disse data viser, at PMBPs selektivt hæmmer levedygtighed ovariecancerceller med mindre effekt på ikke-maligne celler.

PMBPs inducerer æggestokkene kræftceller ‘apoptose

For at vurdere, om de anti-tumor effekt af PMBPs på A2780 og OV2008 celler blev associeret med apoptose, blev ovariecancerceller farvet med DAPI og observeret under et fluorescensmikroskop (figur 2A). Efter behandling med forskellige koncentrationer af PMBPs i 24 timer, nuklear chromatinkondensering og fragmenterede punktformig blå nuklear fluorescens blev observeret i ovariecancerceller på en dosis-afhængig måde, der ligner de morfologiske ændringer i de apoptotiske celler, men kontrol- celler udviste normale og intakte kerner. Den foreslår, at PMBPs kan inducere apoptose af ovariecancerceller.

(A) A2780 og OV2008-celler blev behandlet med PMBPs (0, 25, 50, 100 ug /ml) i 24 timer. De morfologiske ændringer af kerner blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af DAPI-farvning. Pilene angiver cellekernekondensation og apoptotiske legemer (forstørrelse, 100 ×). (B) A2780 og OV2008-celler blev behandlet med PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 timer. Flowcytometri blev anvendt til at analysere Annexin V-FITC /PI dobbelt farvede A2780 celler. Den lave højre (LR) kvadrant af histogrammerne viser de tidlige apoptotiske celler, og den øvre højre (UR) kvadrant viser de sene apoptotiske og nekrotiske celler. (C) Behandlingen af ​​A2780 og OV2008 celler med PMBPs resulterede i dramatisk stigning i procentdelen af ​​apoptotiske og nekrotiske celler (herunder tidlig apoptose, sen apoptose og nekrose). Forsøgene blev gentaget tre gange.

** P .. 0

01

sammenlignet med kontrolgruppen

For yderligere at kvantificere apoptose forårsaget af PMBPs, A2780 og OV2008 celler blev mærket med annexin V-FITC /PI og analyseret ved flowcytometri. Den nedre højre kvadrant (LR) angiver den procentdel af tidlige apoptotiske celler (Annexin V

+ og PI

-) og den øvre højre kvadrant (UR), procentdelen af ​​sent apoptotiske og nekrotiske celler (Annexin V

+ og PI

+). Resultaterne viste, at PMBPs udløste apoptose af ovariecancerceller, begyndende ved 25 ug /ml, i en dosisafhængig måde (Fig 2B). Den procentdel af de samlede apoptotiske og nekrotiske celler A2780 celler var 1,17% i kontrol- celler (LR: 0,2% og UR: 0,97%), 2,46% i celler behandlet med 10 mg /ml PMBPs (LR: 2,42% og UR: 0,04% ), 17,63% i celler behandlet med 25 mg /ml PMBPs (LR: 16,12% og UR: 1,51%), 49,24% i celler behandlet med 35 mg /ml PMBPs (LR: 41,87% og UR: 7,37%) og 77,23% i celler behandlet med 50 mg /ml PMBPs (LR: 71,44% og UR: 5,79%) (figur 2B). Ligeledes dem i OV2008-celler var 5,78% i kontrolceller (LR: 0,83% og UR: 4,95%), 6,46% i celler behandlet med 10 ug /ml PMBPs (LR: 1,38% og UR: 5,08%), 21,45% i celler behandlet med 25 mg /ml PMBPs (LR: 13,88% og UR: 7,57%), 59,94% i celler behandlet med 35 mg /ml PMBPs (LR: 24,79% og UR: 35,15%) og 55,31% i celler behandlet med 50 ug /ml PMBPs (LR: 10,21% og UR: 45,1%) (figur 2B). Vores resultater viser, at PMBPs væsentlig grad kan fremkalde både tidlige og sene apoptose i æggestokkene cancerceller (

s

0,01). (Fig 2C)

PMBPs fremkalde mitokondrielle membran potentielle tab

det er kendt, at mitokondrier beskadigelse under apoptose ændrer den mitokondriske membranpotentiale [12]. At udforske virkningerne af PMBPs på mitochondriemembranpotential blev cellerne behandlet med PMBPs detekteret ved JC-1 farvestof. Som vist i figur 3, er den gennemsnitlige procentdel af grøn fluorescens-positive A2780-celler var 2,41% uden behandling, 20,63% ved 25 ug /ml, 43,77% ved 35 ug /ml og 66,6% ved 50 ug /ml PMBPs behandling. Ligeledes dem i OV2008-celler var 0% uden behandling, 36,28% ved 25 ug /ml, 43.81% ved 35 ug /ml og 78,79% ved 50 ug /ml (Fig 3A). Der var signifikant dosisafhængig stigning i grønne fluorescens-positive celler (Fig 3B) (

s. 0

01

), hvilket tyder på tabet af mitokondrielle membran potentiale korreleret med stigende dosis af PMBPs behandling. Derfor er apoptose af ovariecancerceller af PMBPs forbundet med beskadigelse af det mitokondrielle membran.

(A) A2780 og OV2008-celler blev behandlet med PMBPs (0, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 timer og derefter høstet, farvet med JC-1 farvestof, og endelig analyseret ved flowcytometri. (B) PMBPs behandling resulterede i en signifikant stigning af grøn fluorescens positive (GFP) celler, som indikerede tab af mitochondriemembranpotential. Forsøgene blev gentaget tre gange.

** P .. 0

01

sammenlignet med kontrolgruppen

PMBPs opregulere apoptose-relaterede proteiner og undertrykke Bcl-2

Da PMBPs kunne inducere apoptose i æggestokkene cancerceller, vi undersøgte yderligere nogle apoptose relaterede proteiner ved Western blot. Niveauet af β-actin-tjente som intern kontrol. Vi fandt, at ekspressionen af ​​anti-apoptotiske protein Bcl-2 i ovariecancerceller behandlet med PMBPs faldt betydeligt på en dosis-afhængig måde (

s. 0

01

) (Fig 4A , 4B og 4C). Caspasen medlemmer er afgørende mediatorer af apoptose [13]. Udtrykkene for caspase-3 og caspase-9 blev vurderet. Spaltet-caspase-3 og spaltede-caspase-9 ekspressionsniveauer blev dramatisk opreguleret efter PMBPs behandling i ovariecancerceller (

s. 0

01

) (fig 4A, 4B, 4D og 4E). Disse resultater antyder, at PMBPs aktivere caspase-afhængig apoptose pathway.

(A, B) De A2780 og OV2008-celler blev behandlet med PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 timer og derefter høstet. Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blot analyse. Protein- niveauerne af Bcl-2, spaltes-caspase-3 og spaltes-caspase-9 blev målt ved Western blot. (C, D, E) Histogrammer viser betyde ekspressionsniveauer af Bcl-2, spaltes-caspase-3 og spaltes-caspase-9 (± SD) henholdsvis fra tre uafhængige forsøg. Bcl-2, spaltes-caspase-3 og spaltede-caspase-9-niveauer blev udtrykt i forhold til ladningskontrol, β-Actin. Alle forsøg blev gentaget tre gange

** P .. 0

01

sammenlignet med kontrolgruppen

PMBPs hæmme migration og invasion af kræft i æggestokkene. celler

Cell migration og invasion er kendetegnende for tumorceller. For at undersøge om PMBPs forringet migration og invasion af ovariecancerceller, udførte vi sårheling assay med forskellige, ikke apoptotiske (5 ug /ml og 10 ug /ml), koncentrationer af PMBPs i 24 timer. Vi fandt, at PMBPs dosisafhængigt reduceret bevægelsen af ​​A2780 og OV2008-celler (figur 5). De sår lukning satser PMBPs behandlede celler var lavere end for ikke-behandlede celler (

P. 0

01

) (Fig 5B og 5C). Derudover undersøgte vi invasionsevne af disse celler under anvendelse af en 24-brønds transwell kammer i nærvær af forskellige koncentrationer af PMBPs i 24 timer. PMBPs hæmmede migration og invasion potentiale for kræft i æggestokkene celler i en dosisafhængig måde signifikant (

P. 0

01

) (figur 6). Behandling med 5-25 pg /ml PMBPs hæmmede migration og invasion med 27% -66%, henholdsvis A2780 celler, og 11% -40% i OV2008 celler sammenlignet med kontroller (Fig 6B og 6C). Både sårheling assay og transwell kammer assay antyder, at PMBPs kunne undertrykke migration og invasion af ovariecancerceller.

Monolag af A2780 og OV2008-celler blev ridset med en pipettespids og behandles med PMBPs (0, 5, 10 , 25 pg /ml) i 24 timer. (A) Repræsentative billeder af migrerende celler under mikroskop ved 100 × forstørrelse felt, før og efter skaden. (B, C) Migrationen af ​​A2780 og OV2008-celler blev kvantificeret ved måling af sårlukning områder før og efter skaden. Forsøgene blev gentaget tre gange. **

P 0

01

***

P … 0

001

sammenlignet med kontrolgruppen

A2780 og OV2008-celler blev behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. (A) Repræsentative billeder af celler, som migrerede og invaderet på undersiden af ​​Transwell membran ved 100 ganges forstørrelse under et mikroskop. (B, C) Antal celler i hvert område blev talt, og gennemsnittet. Invaderede celler blev udtrykt i forhold til den for kontrolgruppen. Forsøgene blev gentaget tre gange. **

P 0

01

***

P … 0

001

sammenlignet med kontrolgruppen

Hæmning af MMP-9-aktivitet og udtryk ved PMBPs

i betragtning af de virkninger af PMBPs på kræft i æggestokkene celle migration og invasion, vi yderligere undersøgt mekanismerne i denne proces. Eftersom MMP-9 spiller en vigtig rolle i cancer invasion, næste detekterede vi MMP-9 enzymaktivitet og ekspression efter PMBPs behandling. MMP-9-aktivitet i konditionerede medium blev undersøgt ved gelatinezymografi, og MMP-9-ekspression blev undersøgt ved Western blot. PMBPs dosisafhængigt undertrykte MMP-9-aktivitet (Fig 7A) og reduceret MMP-9 proteinekspression niveau (

P. 0

05

) (Fig 7B). Således kan den inhiberende aktivitet af PMBPs på invasivitet af ovariecancer være, i det mindste delvist, på grund af undertrykkelsen af ​​MMP-9-aktivitet.

Cellerne blev behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. (A) Aktivitet af MMP-9 i cellesupernatanten ved forskellige koncentrationer af PMBPs blev undersøgt ved gelatinezymografi assay. De hvide bånd repræsenterer MMP-9 medieret gelatine fordøjelse. (B) Protein ekspression af MMP-9 i A2780 celler ved forskellige koncentrationer af PMBPs blev vurderet ved Western blot. Histogrammet viser gennemsnitshøjden af ​​MMP-9 (± SD) fra tre uafhængige forsøg. MMP-9-protein-niveauet blev udtrykt i forhold til ladningskontrol, β-actin og standardiseret til den ikke-behandlede kontrolgruppe. *

P. 0

05

**

P .. 0

01

sammenlignet med kontrolgruppen

PMBPs forringer NFKB nukleare translokation og MAPK-aktivering

Mange undersøgelser har vist, at hæmme NFicB aktivitet kunne undertrykke kræft celle invasion [14,15,16]. Vi har derfor undersøgt effekten af ​​PMBPs på NFicB aktivitet i æggestokkene kræftceller. Behandling af A2780 celler med PMBPs reducerede signifikant nukleare translokation af NFKB og fosforylering af kBa (

P. 0

05

) (fig 8A og 8C). Disse bedt at PMBPs kan, i det mindste delvis, undertrykke ovariecancer celleinvasion ved at inhibere NFKB-aktivitet. Adskillige undersøgelser har vist, at aktivering af mitgen-activatied proteinkinaser (MAPK’er), herunder ERK1 /2, p38MAPK, JNK er involveret i tumor migration og invasion, og at disse MAPK’er handle opstrøms for NFKB [17,18,19]. Derfor aktiveringsstatus af ERK1 /2, p38MAPK og JNK blev undersøgt i A2780-celler behandlet med forskellige koncentrationer af PMBPs. PMBPs signifikant hæmmede ERK1 /2 og p38MAPK aktivering, men ikke JNK (

P . 0

05

) (fig 8B og 8D). Således kan undertrykkelse af ERK1 /2 og p38MAPK aktivering ved PMBPs bidrage til nedsat invasion potentiale ovariecancerceller.

(A, B) Cellerne blev behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. Cellelysater blev fremstillet og underkastet Western blot analyse. Proteinet niveau af nuklear p65, p-kBa, kBa, p-ERK, p-p38 og p-JNK blev målt. (C, D) Histogrammer viser middelværdien (± SD) niveau af nuklear p65, p-kBa, kBa, p-ERK, p-p38 og p-JNK fra tre uafhængige forsøg. Den nukleare p65, p-kBa, blev kBa, p-ERK, p-p38 og p-JNK ekspressionsniveauer udtrykt i forhold til ladningskontrol β-actin-og standardiseret til den ikke-behandlede kontrolgruppe. *

P. 0

05

**

P .. 0

01

sammenlignet med kontrolgruppen

diskussion

kræft i æggestokkene er fortsat den hyppigste dødsårsag i gynækologiske kræftformer i høj grad på grund af sent stadium diagnose og begrænsede effektive behandlinger, især i den tilbagevendende sygdom [20]. Naturlige produkter fra planter er lovende terapeutiske midler til kræftbehandling [21]. Derfor vi undersøgt den potentielle nytte af proanthocyanidiner fra

Pinus massoniana

bark på æggestokkene kræftceller i en søgen efter at finde nye effektive lægemidler til kræft i æggestokkene behandling. Vores data her vist, at PMBPs reducerede proliferation, apoptose og undertrykt migrering af æggestokkene cancerceller.

Pinus massoniana

bark ekstrakt er blevet rapporteret til at hæmme væksten af ​​flere former for kræft. Det forhindrede selektivt spredning af menneskelige hepatomceller BEL-7402 og HepG2-celler, men lidt fremmet væksten af ​​humane normale leverceller L-02 in vitro [8,9,22]. Det undertrykte også væksten af ​​humane livmoderhalskræft Hela-celler og induceret apoptose. I denne undersøgelse fandt vi, at proanthocyanidiner udvundet fra

Pinus massoniana Lamb

bark væsentligt hæmmede spredning af kræft i æggestokkene celler, men påvirkede ikke normale æggestokkene celler. Vi observerede også, at cancerceller skrumpede og frigjort fra dyrkningsskåle efter PMBPs behandling, hvilket tyder på, at PMBPs selektivt at forhindre væksten af ​​ovariecancerceller og forårsage celledød.

Vi undersøgte de anti-tumor mekanismer ansat af PMBPs yderligere på æggestokkene kræftceller. Apoptose spiller en meget vigtig rolle i at eliminere muteret eller hyper voksende tumorceller [23]. Der er flere typer af naturlige produkter, som er rapporteret at forhindre væksten af ​​tumorceller via apoptose induktion [24]. Nogle undersøgelser har vist, at

Pinus massoniana

barkekstrakt inducere apoptose i human cervikal cancer Hela-celler, humane hepatom HepG2 celler og murine sarcoma S180-celler på en dosis-afhængig måde [9,10,11]. I den foreliggende undersøgelse afslørede DAPI farvende data, som celler behandlet med PMBPs vises specifikke apoptotiske morfologiske ændringer. Flowcytometri data viste yderligere, at andelen af ​​apoptotiske celler steg betydeligt efter PMBPs behandling. Alle disse resultater viser, at PMBPs inducerer apoptose i ovariecancerceller.

induktion af apoptose er relateret til undertrykkelse af anti-apoptotiske proteiner og opregulering af pro-apoptotiske proteiner [25]. Det er blevet rapporteret, at Bcl-2-protein er altafgørende i regulering af mitokondrier-associerede apoptotiske vej [26]. Nedregulering af Bcl-2 resulterer i tab af mitokondrielle membranpotentiale og frigivelse af cytochrom

c

fra mitochondrierne til cytosolen for at aktivere caspase-9 [27]. Den spaltede-caspase-9 aktiverer endvidere caspase-3, et af de vigtigste enzymer i den intrinsiske apoptotiske vej, til at inducere efterfølgende apoptotiske begivenheder [28]. Heri viste vores resultater, at PMBPs inducerede et betydeligt tab af mitochondriemembranpotential. Derudover observerede vi reduktionen af ​​Bcl-2-ekspression ledsaget med forhøjede niveauer af spaltet-caspase-9 og spaltes-caspase-3 i ovariecancerceller behandlet med PMBPs. Det kunne overvejes at PMBPs kan inducere apoptose gennem mitokondrier-associerede apoptosecyklus.

Vi fandt, at PMBPs effektivt undertrykt ovariecancer migration og invasion. En vigtig faktor, der letter den metastatiske spredning af cancerceller er proteolytiske enzymer, som nedbryder den omgivende ekstracellulære matrix, og således lette cellemigrering gennem basalmembranen. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er involveret i matrix remodeling [29]. Med hensyn til kræft i æggestokkene, har ekspressionen af ​​MMP-9 er forbundet med invasive undertyper [30]. Vores arbejde viser, at PMBPs kunne nedregulere MMP-9-ekspression og aktivitet. Derfor kan PMBPs undertrykke MMP-9-aktivitet til at forringe migrations- og invasion kapaciteter af æggestokkene kræftceller.

Aktivering af NFKB er afgørende for migration og invasion af æggestokkene cancerceller [31,32,33]. Vi foreslog, at PMBPs kan undertrykke NFicB aktivitet og hæmme kræft i æggestokkene invasion. Phosphorylering af kBa kan frigive NFKB underenheder, der transporteres fra cytoplasmaet til cellekernen af ​​celler til at regulere målgener [34]. I denne undersøgelse har vi observeret, at kBa phosphorylering og NFKB translokation fra cytoplasmaet til cellekernen inhiberet af PMBPs behandling (fig 8A og 8C). NFKB tjener som transskription faktor for MMP-9 regulering [35,36]. Vores resultater viser, at PMBPs undertrykke NFKB aktivitet og dette positivt korrelerer med nedregulering af MMP-9-ekspression.

MAPK signaleringskaskade, herunder ERK1 /2, p38 MAPK og JNK, er blevet impliceret i migrationen og invasion af talrige kræft celletyper [37,38,39]. I denne undersøgelse har vi spekuleret på, at PMBPs kan antagonisere MAPK signaleringsveje at undertrykke migration og invasion af ovariecancerceller. Vores data indikerer at PMBPs behandling inhiberede aktiveringen af ​​ERK1 /2 og p38 MAPK i en dosisafhængig måde, men havde ringe virkning på JNK-vejen (fig 8B og 8D).