PLoS ONE: Synergistisk antitumoraktivitet af Docetaxel og octreotid associeret med Apoptotisk-Opregulering i kastrationsresistent prostatakræft

abstrakt

Androgen deprivationsbehandling er blevet den knytnæve-line behandling af metastatisk prostatacancer; dog progression til kastrere resistens sygdom forekommer hos størstedelen af ​​patienterne. Således er der et presserende behov for forbedringer i terapi for kastrationsresistent prostatacancer. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at fastlægge effekten somatostatin analog octreotid (OLT) kombineret med en lav dosis af docetaxel (DTX) ved hjælp af kastrationsresistent prostatacancerceller og til at undersøge de involverede molekylære mekanismer in vitro. De antiproliferative og synergisme potentielle virkninger blev bestemt ved MTT-assayet. Induktion af apoptose blev analyseret under anvendelse annektere V og propidiumiodid-farvning og flowcytometri. VEGFA, CASP9, CASP3 og ABCB1 genekspression blev evalueret med RT-PCR og Q-RT-PCR-analyse. OLT kombination med DTX behandlinger på DU145 cellemigration blev også evalueret. Undersøgelsen viste, at kombinerede administration af DTX og oktober havde signifikant, synergistisk større cytotoksicitet end DTX eller OLT behandling alene. Kombinationen af ​​de to lægemidler forårsagede en mere markant stigning i apoptose og resulterede i større undertrykkelse af invasiv potentiale end enten individuel agent. Der var tydeligt stigning i caspase 3 ekspression i alene og to-drug kombineret behandlingsgrupper, dog VEGFA ekspression blev markant undertrykt i dem OLT. Disse resultater understøtter den konklusion, at somatostatin analoger kombineret med docetaxel kan øge kemoterapi effektiviteter via flere mekanismer i kastrationsresistent PCa cellelinje. Dette arbejde giver en præklinisk rationale for de terapeutiske strategier til at forbedre behandlingen i kastrationsniveau sygdomsresistens

Citation:. Zhu S, Oremo JA, Li S, Zhen M, Tang Y, Du Y (2014) Synergistiske antitumorvirkninger Docetaxel og octreotid associeret med Apoptotisk-Opregulering i kastrationsresistent prostatakræft. PLoS ONE 9 (3): e91817. doi: 10,1371 /journal.pone.0091817

Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: December 31, 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: 14. marts 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet i dele af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (81041102) og videnskabelig forskning Preferred Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars, Statens Uddannelsesstøtte ministeriet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform som udgør en stor trussel mod mænds sundhed. Androgen afsavn terapi (ADT), der involverer kirurgisk eller kemisk kastration er den standard behandling for patienter med fremskreden PCa [1]. Dog vil de fleste patienter bliver resistente over for androgen deprivation og i sidste ende fremskridt med kastrationsresistent sygdomme [2], normalt inden for 12-24 måneder fra indledningen af ​​hormonbehandling [3]. Fremkomsten af ​​aggressive kastrationsresistent kloner under ADT er rationale for taxan-baseret behandling, som er den eneste kemoterapi klasse til at vise en overlevelse fordel i metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) [4], [5].

Docetaxel (DTX) er den første linje kemoterapeutiske mulighed for symptomatiske CRPC patienter, der er kandidater til kemoterapi [6], som forbedrer den samlede respons, klinisk remission af patienter de prostatacancer [7]. DTX behandling øger Bcl-2-phosphorylering, nedregulerer Bcl-XL proteinniveauer, inducerer p53 og resulterer således i apoptose [8], [9]. Desuden blev DTX indberettet forstærket antiangiogene virkninger [10]. Den minder os om den tidlige tegn på, at taxotere kunne inhibere proliferationen af ​​humane navlevene endotelcelleproliferation gennem hæmning af VEGF-sekretion [11]. Derfor undersøgte vi VEGFA sekretion før og efter behandling med forskellige midler. Men cytotoksiciteter især perifer neurotoksicitet og bloddannende bivirkninger er betydelige og uundgåelige progression sker efter DTX behandling [12], [13]. Resistens kan udvikle sig gennem en række mekanismer omfatter inhibering af apoptose og aktivering af de ekstracellulære signal-relateret PI3 kinase /Akt overlevelse veje med udvikling af metastase [14]. På grund af modstand, er det ofte ikke helbrede patienterne, er det derfor vigtigt at identificere bedre eller alternative terapeutiske strategier, der omvendt kemoterapi modstand og øge følsomhed over for docetaxel-baserede kemoterapi narkotika.

Somatostatin (SST) blev opdaget som en inhibitor af væksthormon, som først blev isoleret fra hypothalamus af får. Det er fordelt på mange menneskelige organer og tumorer med en lang række funktioner, såsom hæmning af celleproliferation, til regulering af phosphotyrosin phosphatase aktiviteter hæmme PI3 kinase og MAP kinase aktiviteter [15]. Mange syntetiske somatostatinanaloger (octreotid, lanreotid, vapreotid, og depreotid) blev udviklet og fem forskellige undertyper af somatostatinreceptorer kan bindes af dem [16]. Somatostatinreceptorer er til stede på cellemembraner af kastrationsresistent PCA cellelinier kan imidlertid deres dynamiske ekspression varierer afhængigt af den fænotypiske træk ved hver cellelinje [17]. Den syntetiske somatostatinanalog octreotid (OCT) er blevet grundigt undersøgt som en af ​​SST-analoger og akkumulere beviser støtter dets antitumorvirkning i cancerterapi [18], [19]. Oktober er blevet godkendt af FDA til at blive brugt som en standard for pleje af den medicinske behandling i forskellige typer af kræft. Det har en stærkt forbedret stabilitet sammenlignet med naturlig somatostatin, der giver mulighed for langvarig behandling [20].

Combing forskellige anticancermidler er en fornuftig strategi med at opnå en potent cytotoksisk virkning i kræftceller. I vores undersøgelse har vi bestemt effekten af ​​kombineret behandling af DTX og OLT profilen af ​​gener udtryk forbundet med apoptose, angiogenese og lægemiddel-tolerance i DU-145 celler. Resultaterne præsenteret heri viste, at sammenslutningen af ​​DTX og oktober forudsat en mere end additiv apoptotisk respons. Denne roman stof kombination var mere effektive til induktion af apoptose og reducere migration end hvert lægemiddel alene. Disse resultater giver en overordnet forståelse af de kliniske strategier på prostatakræft og resistens vending.

Materialer og metoder

Celler og cellekultur

DU145 prostatacancerceller og PC3 celler blev leveret venligt som en gave af Prof. Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research center). De købes fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, USA), der blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone) og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO2. Sammenflydende celler blev passeret med trypsin-EDTA (0,05% trypsin og 0,53 mM tetranatrium EDTA) og høstet til fremstilling mRNA som beskrevet nedenfor.

Behandling og celleviabilitetstest

DU145 prostatacancerceller blev podet i plader med 96 brønde i fem eksemplarer med Dulbeccos basale medium plus 10% føtalt bovint serum og holdt i kultur i 24 timer. Cellerne blev behandlet med DTX (5, 10, 20, 50 eller 100 nM) og oktober (10, 10

2, 10

3, 10

4, 10

5 nM), anvendes alene eller i samtidige kombinationer til 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis. Ved afslutningen af ​​inkubationerne blev cellemedium fjernet og 100 pi /brønd MTT-opløsning (0,5 mg /ml i PBS) blev tilsat. Derefter blev pladerne inkuberet i 3 timer (ved 37 ° C, beskyttet mod lys). Efter inkubation ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 timer blev supernatanterne forsigtigt fjernet, og 150 pi DMSO blev sat til hver brønd. Cellerne blev derefter rystet i 10 minutter i mørke. Absorbans blev målt ved 450 nm i en mikropladelæser (Bio-Rad 680). Analyse af de opnåede resultater blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 4 computerprogram til at evaluere celleproliferation sats og cytostatisk sats. Ubehandlede celler blev anvendt som kontroller.

RNA og DNA-ekstraktion

Totale RNA’er fra dyrkede celler blev udvundet ved hjælp Trizol reagens (Takara, Dalian, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger og deres koncentrationer blev bestemt af et spektrofotometer (NanoDrop, Nyxor Biotech). Genomiske DNA’er fra dyrkede celler blev ekstraheret under anvendelse DNeasy Blood Tissue Kits (Qiagen) og deres koncentrationer blev målt med NanoDrop spektrofotometer. Alle de processer blev udført ifølge producentens anvisninger.

RT-PCR og Q-RT-PCR

Kvantitativ realtids-PCR blev udført med QPK-201 SYBR Green Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) og ABI 7300-systemet fra Applied Biosystems. Primerne anvendt i undersøgelsen blev opnået fra Invitrogen (Beijing, Kina) og vist i tabel 1. termocykling parametre omfattede en RT trin ved 50 ° C i 20 minutter, efterfulgt af en DNA-polymerase aktiveringstrin ved 95 ° C i 2 min og 50 PCR-cykler (95 ° C i 20 s, 60 ° C i 30 s). Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer. Den fold-ændring i differentiel udtryk for hvert gen blev beregnet ved hjælp af den sammenlignende C

Tmethod (også kendt som 2

-ΔΔCTmethod) som beskrevet af Lu et al [21].

Flowcytometrisk evaluering af annexin V-FITC /PI-farvede celler

Cancerceller blev dyrket på plader med 6 brønde i 24 timer, behandlet med DTX (20 nM) og oktober (10

3 nM) alene eller i samtidig kombination i yderligere 48 timer. For at detektere apoptotiske hændelser blev cellerne vasket to gange med PBS, og pelleten blev resuspenderet i 1 × Annexin bindingspuffer i en koncentration på 10

6cells /ml. Derefter blev 100 pi af cellesuspensionen overført til 5 ml kultur rør. Derefter blev 5 pi af Annexin V-FITC og 5 pi propidiumiodid tilsat til hver prøve, og prøverne blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter dette tidsrum blev 400 pi 1 × Annexin bindingspuffer til hvert rør, og celler blev analyseret under anvendelse af en BD FACSCanto flowcytometer (BD Biosciences). Hvert forsøg omfattede kontrolprøverne celler farvet med Annexin V-FITC (ingen PI) og celler farvet med PI (ingen Annexin V-FITC). Levedygtige celler var Annexin V-FITC- og PI-negative, celler i tidlig apoptose var Annexin V-FITC-positive og PI-negative og celler i slutningen apoptose eller døde var positive både for Annexin-FITC og PI. Resultater blev repræsenteret fold ændringer i de relative gennemsnitlige forhold mellem celler ubehandlede sammenlignet med de forskellige behandlingsmodaliteter. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

sårheling assay

ridse assay blev udført for at vurdere indflydelsen af ​​DTX og OLT prostatacancer cellemotilitet alene og i kombination. DU145-celler blev podet i en høj densitet ved 6-brønds plader og dyrket i 24 timer. Mediet blev fjernet og erstattet med medium indeholdende DTX og /eller OLT i yderligere 24 timer. De monolag celler blev fysisk såret af ridse overfladen med en pipettespids (1000 pi) som ensartet og lige som muligt. Billederne af celler invaderer ridse blev indfanget ved angivne tidspunkter (0, 4, 6, 8 og 24 timer) under anvendelse af fasekontrastmikroskopi (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Billederne blev vurderet ved måling af forskellen i arealet af sårene med et Leica billedanalysesystem (Leica, Mannheim, Tyskland) og vandringshastighed udtrykt som procentdel af bunden lukningen blev beregnet som følger:% af scratch lukning = a-b /a, hvor (a) er en afstand mellem kanterne af såret, og (b) er den afstand, som forblev cellefri under cellemigration at lukke såret. Eksperimenterne blev gentaget i tre brønde mindst to gange.

Statistisk analyse

Data fra forsøgene blev analyseret under anvendelse af SPSS 18.0 software og udtrykt i form af middelværdi ± SD. De to-sidet t-test blev anvendt til at analysere forskellene i eksperimenterne. Den p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant hvorimod p-værdi 0,01 eller 0,001 så meget signifikant

Resultater

Apoptotiske egenskaber DU145 celler behandlet af DTX alene, OCT. alene og deres kombination i 48 timer

i den første undersøgelse blev væksthæmmende effekt af DTX, OLT og kombinationen af ​​dem på prostatacancerceller DU145 undersøgt. Efter disse midler behandling, dele af cellerne begynder at krympede, inter-celleafstand blev større og blev observeret aflejring cytoplasmatisk partikel i DTX og oktober behandlede celler. Denne virkning var meget mere kraftfuld i kombinationen behandlingsgruppen end i de enkelte behandlingsgrupper. Der var mere flydende og skummende celler viste morfologiske træk af apoptose i kombinationen behandlingsgrupper og stigningen i koncentrationen behandlingen forbedrede de apoptotiske optrædener. Fig. 1 viser cellemorfologien af ​​forskellige koncentrationer af DTX og /eller OLT behandling i 48 timer. Hertil kommer, som behandlingen tiden skred frem, cellevækst blev langsom, og der var et øget antal flydende celler kan observeres i mediet.

A. Ubehandlede celler; B. 1 nM DTX; C. 100 nM OLT D. 10 nM DTX; E. To lægemiddelkombinationen på 10 nM DTX og 100 nM OLT F. 100 nM DTX.

væksthæmmende af DTX og oktober alene henholdsvis

væksthæmmende effekt af DTX og oktober blev undersøgt henholdsvis. Det er indlysende, at hver af de to midler viste anti-proliferation virkning på DU145-celler (fig. 2a og 2b). Både DTX og OLT faldt celleproliferation i et tidsrum og dosisafhængig måde. Som vist i fig. 2C, sammenlignet med ubehandlede kontroller, der var 14%, 31% og 43% inhibering i proliferationen af ​​DU145 celler udsat for 10 nM af DTX ved 24 timer, 48 timer og 72 timer. Som for oktober (fig. 2D), sammenlignet med kontrollen, det der var en 10%, 18% og 29% inhibering i proliferationen af ​​DU145 celler eksponeret for 100 nM af lægemidlet ved 24 timer, 48 timer og 72 timer . Data viste, at den højeste cytotoksicitet var efter 72 timer og IC

50 værdier af DTX (fig. 2A) og oktober (fig. 2B) blev beregnet ud fra celleproliferation plots hhv. DTX udstillet en stærkere cytotoksiciteten med lavere IC

50 med en værdi på 10,784 ± 3,122 nM end OLT viste en svagere hæmning effekt med IC

50 være 2,342 ± 0,262 pM.

Cell levedygtighed var bestemt ved MTT-assay og udtrykt som en procentdel af kontrolværdien (middel ± SEM af tre eksperimenter udført i triplikat); fejlsøjler = SEM (n = 6).

DTX sammen med OLT producerer synergistisk hæmning af væksten i humane DU145 celler

For at vurdere de mulige synergistiske virkninger af DTX-OLT kombineret på væksten af ​​cancerceller, blev DU145 celler udsat for forskellige koncentrationer af DXT og oktober kombineret i 72 timer (fig. 3B). observeredes den synergistiske virkning af DTX og OLT DU145 celler proliferation. Procentdelen af ​​cellevækst hæmning fremkaldt af DTX i kombination med oktober var større end hvert enkelt middel alene. Ved en koncentration på 10

3 nM, OCT reducerede signifikant IC50-værdi (P 0,05) og fremmes apoptose (P 0,05) i DU145 celler som reaktion på DTX. Som vist i fig. 3A, 10 nM DXT og 10

2 nM oktober resultat i en 39% og 14% inhibering i proliferation i DU145-celler, henholdsvis mens både kombineres i samme doser forårsagede et fald i celleproliferation 68% i forhold til ubehandlet kontrol som angivet en stærk synergi. Salg

Resultaterne er den procentdel af kontrolværdien opnået med ubehandlede celler (gennemsnit ± SEM af tre eksperimenter udført i triplikat). (**) Proliferation blev signifikant nedsat (

s

0,001); fejllinjer = SEM.

VEGFA, CASP3, CASP9 og ABCB1 mRNA-ekspression i DU145 celler

For at udforske det potentielle mekanisme, hvormed DTX plus oktober inducerer apoptotisk celledød, udtryk for gener involveret i apoptotisk signal, blev celle resistens overfor DTX og angiogenese evalueret ved RT-PCR og QRT-PCR efter 48 timer (fig. S3) og 72 timer af behandlingen. Sammenlignet med kontrollen, 10 nM DTX og 100 nM OLT, to agenter kombination gruppe markant nedsat VEGFA mRNA-ekspression (figur 4A.) (P 0,01). Som for CASP9 og CASP3, det basale mRNA niveau af CASP9 og CASP3 var lave, men påviselige og mRNA ekspression blev øget væsentligt som vist i fig. 4B og fig. 4C (P 0,01). Proteinet Ekspressionsniveauet af de to caspase-gener blev også undersøgt og i overensstemmelse med resultatet af QRT-PCR (Fig. S4). Derudover blev ekspressionen af ​​ABCB1, der er anerkendt som et gen associeret med medikamentresistens [22], ikke påvirket i behandlingsgrupperne (Fig. 4D). Disse resultater antyder, at anti-tumor effekt af DTX i kombination med oktober kan være involveret i at fremme apoptose forbundet med høj ekspression af caspase 9 og caspase 3.

M: Marker, Ekspressionsniveauerne af objektive gener blev undersøgt ved RT-PCR (A, B, C og D) og kvantitativ real-time -PCR (B, D, F og H) henholdsvis under anvendelse af celler behandlet med testlægemidlerne i 72 timer. Ekspressionsniveauet af hvert mRNA blev normaliseret til det niveau af β-actin mRNA. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre eksemplarer analyser (*

s

0,05, **

s

0,01).

Virkninger af DTX, OCT alene og to-lægemiddelkombination behandling på DU145-celler apoptose

Ifølge QRT-PCR-resultater, blev forsøgene opdelt i fire behandlingsgrupper, herunder kontrol, DTX (10 nM), OCT (100 nM) og de to-drug kombination grupper (fig. 5). Efter behandling i 48 timer blev en apoptose test udført ved flowcytometri ifølge instruktionerne i Annexin V-FITC /PI farvning kit (fig. 5A). I modsætning til kontrolgruppen, blev apoptose induceret i både DTX og OLT grupper (P 0,05). I overensstemmelse med tidligere observationer, blev andelen af ​​apoptotiske celler markant forøget ved anvendelse af DTX plus OLT sammenlignet med DTX eller OLT behandling alene (fig. 5B). Disse resultater indikerer, at kombinationsbehandlingen forstærket apoptotisk celledød i DU145-celler.

Data er gennemsnit ± SEM af to uafhængige forsøg udført in triplo. ***

s

. 0,000 vs. kontrol

Effekt af DTX, OCT alene og to-drug kombination på migrationen af ​​de DU145 celler

at påvise virkningen af ​​kombinationen to-drug for migration af DU145 celler, blev en sårhelende assay udført efter 24 timer behandling. Resultaterne af sårheling assays viste, at en af ​​lægemiddel alene har den inhiberende virkning på migration celler. Men cellerne i kombinationsgruppen migrerede langsommere end i lægemidlet alene og ubehandlede kontrolgrupper (Fig. 6A). Sammenlignet med kontrollen, den relative migrerede afstand af cellerne i DTX, OLT og DTX /OLT kombinerede grupper (. Figur 6B), henholdsvis var 76,5 ± 10,21, 53,2 ± 12.13, 79,4 ± 13,04 (P 0,05). De celler inkuberet i kontrolgruppen vandrede over et område, der var markant større end den for celler inkuberet i den lægemiddel-kombinerede gruppe, hvilket indikerer, at DTX i kombination med oktober inhiberede migration af DU145 celler.

( A) Sårheling assay til bestemmelse af virkningen af ​​angivne stoffer på migration DU145 celler. (B) Den samlet migration ratio (%) efter 72 h behandling målt ved sårheling assay. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM. **

s

. 0,01, vs. kontrol

Diskussion

mikrotubulus-targeting kemoterapi er den mest udbredte metode til behandling af prostatakræft [23]. Imidlertid resulterer ofte langvarig behandling i bivirkninger og kemoterapi modstand, normalt bidrager til de variable kliniske resultater hos patienter med tilsyneladende tilsvarende typer tumor. I et forsøg på at overvinde medikamentresistens, besluttede vi at undersøge de effektive cytotoksiske og apoptotiske koncentrationer af mikrotubulus-targeting drug docetaxel (DTX) og somatostatin analog octreotid (OLT) og deres synergistiske virkning af de to lægemidler i kastrationsresistent prostatacancer-cellelinie DU145.

i denne undersøgelse har vi vurderet den kombinerede effekt af DTX og oktober mod prostatakræft DU145 og PC3 celler (fig. S1). Kombinationen af ​​DTX og octen inducerede et større fald i cellelevedygtighed end alene enten agent. Oktober reducerede IC

50 værdi DTX i DU145 og PC3-celler på en dosisafhængig måde, inhiberet PCa celleproliferation (Fig. S2), øget DTX følsomhed, cellulær cytotoksiske og apoptose. Selvom vi fundet, at PC3 celler viste mere følsomme over for DTX end DU145 celler, som er forenelige med undersøgelsen in vivo (fig. S5). Disse resultater antyder dette OLT synergistisk potenserer virkningen af ​​mikrotubulus-målrettede midler i PCA-celler in vitro. Disse er i overensstemmelse med den seneste undersøgelse fra Lattanzio et al. docetaxel kombineret med octreotid synergistisk forstærket effekt af kombineret behandling på særlig docetaxel-resistente PC-3-cellelinjen [24]. Vi fandt imidlertid en af ​​de to lægemidler alene stimulerer proliferation af DU145 celler i en lavere koncentration af DTX 1 nM eller OLT. 10 nM, som ikke blev observeret i deres samlede gruppe

Den anti-proliferative virkningen af ​​DTX og oktober kan skyldes enten celle nekrose eller celle apoptose. Derfor undersøgte vi apoptotiske effekt af DTX, OCT alene og deres kombinationsbehandling i DU145 celler. Resultaterne viste, at kombinationen af ​​DTX og octen nedsat cellelevedygtighed og øge caspase 9/3 aktivitet i højere grad end enten en enkelt middel alene på en tidsafhængig måde (Fig. S4). Sammenlignet med kontrollen er indlysende stigning i caspase 3-ekspression især i alene og to-drug kombineret behandling OLT grupper. Dette er i overensstemmelse med den Rapporten viste dette OLT øgede caspase 3 mRNA-ekspression og induceret celle apoptose i HepG2-celler [18]. Det blev oplyst, at apoptotisk program af celledød blev fyret ved at aktivere initiativtager caspase-8, overtalelse mitokondrie ydre membran permeabilisering (MOMP), mitokondrie fragmentering, og i sidste ende aktivering af de nedstrøms proteaser caspase-9 og -3. MOMP inducerede afgangen af ​​cytochrom c, dannelsen af ​​apoptosome og i sidste ende aktivering af caspase-9 [25]. I den foreliggende undersøgelse blev Caspase 9-aktivitet steg betydeligt efter behandling af DU145 celler efter kombinationen af ​​DTX og oktober behandling, implicerer den MOMP og mitokondriel fragmentering induktion, hvilket resulterer i den observerede aktivering af apoptose i DU145-cellelinje.

VEGF-signalering fremmer angiogenese ved at stimulere vaskulær endotelcelle formering, migrering og rør-dannelse og markant øger vaskulære permeabilitet [26]. Den VEGF familien omfatter fem medlemmer, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D og placenta vækstfaktor (PIGF) og VEGF-A er kendt for sine vigtigste roller i tumor-relaterede angiogenese [27]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​OLT DTX og kombinationen af ​​de to lægemidler på VEGFA ekspression i DU145-celler. Undersøgelse viste, at kombinationen af ​​DTX og oktober udøve en stor inhibitorisk virkning på VEGFA mRNA-ekspression, men havde en moderat effekt af DTX alene behandling. Rapport viste, at VEGF-ekspression blev signifikant undertrykt i gliomceller OLT-dosisafhængigt. Imidlertid OCT haft ringe effekt i mikromiljø hypoxi-induceret VEGF-produktion in vivo [28].

I den foreliggende undersøgelse viste vi et signifikant fald i cellemigrering in vitro efter udsættelse for to-drug kombinationsbehandling . Undersøgelse antyder, at DTX i kombination med oktober inhiberer DU145 proliferation eller migrering gennem hæmning af frigivelse af peptidet VEGFA og efterfølgende medfører inhiberingen af ​​cellemigrering. Undersøgelse rapporterede, at stigningen af ​​VEGF /VEGFR interaktion øger migrationen af ​​tyktarmskræft celler [29]. Men nogle inkonsistente undersøgelsesresultater opdaget. For eksempel i hepatisk iskæmisk-reperfusionsbeskadigelse model, viste oktober den inhiberende virkning på hepatocellulær apoptose og svækket skader hepatocyt forårsaget af iskæmisk-reperfusion [30]. Kortsigtede anvendelse OLT kunne fremkalde oktober receptor SSTR2 desensibilisering og internalisering, hvilket hæmmede apoptotiske effekt af OLT liver kræftceller [31]. Disse strid resultater kan skyldes de forskellige celle egenskaber, celle mikromiljø, udtryk for koncentrationen behandling receptorer og oktober

Det er rapporteret, at ABCB1 udtrykkes i over halvtreds procent af resistente kræftformer og anerkendt som en vigtigste mekanisme underliggende resistens [32]. ABCB1 ekspression blev opreguleret efter kemoterapi i forskellige tumorer som en generaliseret stressrespons [33], [34]. I vores undersøgelse ingen signifikant forskel blev bemærket mellem de forskellige grupper, der blev behandlet med kombineret DTX og OLT hver enkelt middel alene og untreatment kontrol. Høj ekspression af ABCB1 gen før og efter disse lægemidler behandling indikerer et DTX og /eller OLT lægemiddelresistent cellelinje af prostatacancer DU145 celler, som er blevet observeret i vores tidligere undersøgelse muse xenotransplantationsmodel ved in vivo (data ikke offentliggjort).

Disse data antyder, at kombineret behandling af DTX og OLT DU145 og PC3-celler, som udøves en større inhibering af tumorcelleproliferation og markant induceret apoptose, hvilket kan være relateret til opregulering af caspase 9/3 aktivitet og nedsat ekspression af VEGFA in vitro. Selvom vores resultater skal udvides til in vivo-modeller i fremtidige undersøgelser, de hæve spændende mulighed, at målrette mikrotubuli med et taxan kombinerede en somatostatin-analog kan være en nyttig tilgang til at forbedre resultaterne i prostatakræft.

Støtte Information

Figur S1.

Virkning af DTX alene, synergistiske virkning af DTX i kombination med 100 nM OLT PC3 celler proliferation efter 48 timer (A) og 72 timer (B) behandling. Resultaterne er den procentdel af kontrolværdien opnået med ubehandlede celler (gennemsnit ± SEM af tre eksperimenter udført i triplikat). (**) Proliferation blev signifikant nedsat (

s

0,001); fejllinjer = SEM

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s001

(TIF)

Figur S2.

synergistiske virkning af DTX i kombination med OLT DU145 celler proliferation efter 48 timer af behandlingen. Resultaterne er den procentdel af kontrolværdien opnået med ubehandlede celler (gennemsnit ± SEM af tre eksperimenter udført i triplikat). (**) Proliferation blev signifikant nedsat (

s

0,001); fejllinjer = SEM

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s002

(TIF)

Figur S3. Salg Virkninger af DTX alene, OCT alene og kombinationen af ​​DTX /OLT-på ekspressionen af ​​VEGFA, caspase 9, caspase 3 og ABCB1 i DU145-celler ved QRT-PCR henholdsvis anvendelse af celler efter 48 timers behandling. Ekspressionsniveauet af hvert mRNA blev normaliseret til det niveau af β-actin. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre eksemplarer analyser (*

s

0,05, **

s

0,01)

doi: 10,1371 /journal.pone.0091817.s003. Hotel (TIF)

figur S4.

Påvisning af caspase 3 og caspase 9 ekspression i DU145-celler ved Western blot (A). Resultater viser, at væsentligt øgede caspase 3 og caspase 9 ekspressionsniveauer i DTX alene og i kombination med oktober følgende 48 h behandling. (B) Densitometrisk analyse blev udført under anvendelse af Kodak endimensional billedanalysesoftware. (P 0,01)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s004

(TIF)

Figur S5. Salg Vækstkurver for prostatacancer xenotransplantat PC3 (A) og DU145 (B) i kontrolmus, kastrerede mus og mus behandlet med docetaxel herunder to grupper på 10 mg /kg og 20 mg /kg docetaxel behandling. Tumor måling starter fra narkotikabehandling (p 0,015). (N = 5)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091817.s005

(TIF)