PLoS ONE: Methylering af DACT2 Fremmer papillære kræft i skjoldbruskkirtlen Metastase ved Aktivering Wnt Signaling

Abstrakt

Kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige endokrine malign sygdom og forekomsten er stigende.

DACT2

blev fundet hyppigt methyleret i human lungekræft og hepatocellulært carcinom. At udforske epigenetiske forandringer og den rolle,

DACT2

i kræft i skjoldbruskkirtlen, blev 7 skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer, 10 tilfælde af ikke-kræft i skjoldbruskkirtlen vævsprøver og 99 tilfælde af primær kræft i skjoldbruskkirtlen prøver involveret i denne undersøgelse. DACT2 blev udtrykt og umethyleret i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinjer. Tab af udtryk og komplet methylering blev fundet i TPC-1 celler. Genoprettelse af DACT2 blev induceret med 5-aza-2′-deoxycytidin behandling. Det viser, at ekspressionen af ​​

DACT2

blev reguleret af promotor-regionen methylering. I human primær papillær thyreoideacancer, blev 64,6% (64/99) methyleret og methylering af DACT2 var relateret til lymfeknudemetastaser (p 0,01). Re-ekspressionen af ​​

DACT2

undertrykker celleproliferation, invasion og migration i TPC-1 celler. Aktiviteten af ​​TCF /LEF blev inhiberet af DACT2 i vildtype eller mutant p-catenin celler. Aktiviteten af ​​TCF /LEF blev forøget ved co-transfektion af DACT2 og Dvl2 i vildtype eller mutant p-catenin celler. Overekspression af vildtype-β-catenin fremmer cellemigration og invasion i DACT2 stabilt udtrykt celler. Ekspressionen af ​​β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 blev reduceret, og niveauet af phosphoryleret β-catenin (p-β-catenin) blev forøget efter restaurering af DACT2 ekspression i TPC-1-celler. Ekspressionen af ​​β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 blev forøget, og niveauet af p-β-catenin blev reduceret efter knockdown af DACT2 i W3 og SW579 celler. Disse resultater antyder, at DACT2 undertrykker human papillær vækst thyroidcancer og metastase ved at hæmme Wnt signalering. Afslutningsvis

DACT2

ofte methyleres i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen. DACT2 ekspression blev reguleret af promotor-regionen methylering.

DACT2

undertrykker papillær kræft i skjoldbruskkirtlen proliferation og metastase ved at hæmme Wnt signalering

Henvisning:. Zhao Z, Herman JG, Brock MV, Sheng J, Zhang M, Liu B, et al. (2014) Methylering af

DACT2

Fremmer papillære kræft i skjoldbruskkirtlen Metastase ved Aktivering Wnt Signaling. PLoS ONE 9 (11): e112336. doi: 10,1371 /journal.pone.0112336

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget dateret 25. april 2014 Accepteret: 8 okt 2014; Udgivet: November 6, 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program (973 Program nr 2012CB934002, 2010CB912802), National Key Scientific instrument Special Program Kina (Grant nr 2011YQ03013405), National High-tech R 5′-AAC CCC ACG AAC GAC GCCG-3 ‘(MR); 5′-TTG GGG TGT GTG TAG ATT TTG TTT TTTGT-3 (UF) og 5’-CCC AAA CCC CAC AAA CAA CAC CA-3 ‘(UR). Størrelsen af ​​unmethylation PCR-produkt er 161 bp og methylering PCR-produkt er 152 bp. Bisulfit behandlede DNA blev amplificeret ved anvendelse BSSQ primere flankerer målrettede regioner, herunder MSP primere sites og transkriptionsstartstedet. Sekventeringsprimere var som følger: 5’-GGG GGA GGT YGY GGT GAT TT-3 ‘(F) og 5′-ACC TAC RAC RAT CCC AAC CC-3’ (R). Bisulfit sekventering blev udført som tidligere beskrevet [11].

Immunhistokemi (IHC)

Immunhistokemi (IHC) blev udført på 5 um tykke serielle snit afledt af formaldehyd-fikserede paraffin blokke af papillær kræft i skjoldbruskkirtlen og parret tilstødende væv. Efter afparaffinering og rehydrering, blev endogen peroxidaseaktivitet blokeret i 30 minutter i methanol indeholdende 0,3% hydrogen peroxid. Efter antigen hentning, en fortrydelsesfrist på 20 minutter gik forud for inkubation med det primære antistof. DACT2 antistof (OriGene Tech, MD, USA) blev anvendt ved en 1/1000 fortynding natten over ved 4 ° C. Den farvning intensitet og omfang af de farvede område blev gradueret i henhold til NIS-ELEMENTS Imaging software (Nikon, Tokyo, Japan) farvning intensitet cytoplasmaet (svag farvning = 1; moderat farvning = 2; stærk farvning = 3); omfanget af farvede celler (0% = 0, 0-5% = 1, 5-10% = 2, 10-15% = 3, 15-20% = 4). Den endelige immuno-reaktiv score (0 til 12) blev bestemt ved at multiplicere intensitet score til omfanget af farvede celler score.

Konstruktion af Lentiviral DACT2 ekspressionsvektorer

Menneskelig fuld længde

DACT2

cDNA (GenBank accession nummer NM_214 462) blev amplificeret fra pCMV-DACT2 vektoren [11]. Primere var som følger: 5′-TGA TCA ATG TGG ACG CCG GGC-3 ‘(F) og 5′-GTC GAC TCA CAC CAT GGT CAT GAC-3’ (R). PCR-produktet blev derefter subklonet ind i pLenti6-GFP-vektoren. Indsatsene blev verificeret ved restriktionsspaltning og DNA-sekventering.

Lentivirale infektioner og stabil ekspression celler udvælgelse

293T cellelinie blev opretholdt i 90% DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplering med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO2. DACT2 udtrykte lentivirus vektor blev transficeret i HEK293T celler (5 x 10

6 pr 100 mm skål) under anvendelse af polyethylenimin (P.E.I.) opløsning ved en 3:01 ratio (P.E.I. masse: DNA masse). Efter 48 timer blev viral supernatant opsamlet og filtreret. Derefter viral supernatant blev tilsat til vækstmediet af TPC-1-celler og stabilt udtrykt celler blev selekteret ved Blasticidin (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) ved 0,2 ug /ml i 2 uger.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev målt dagligt i 72 timer under anvendelse af MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) Kit (keygen Biotech, Jiangsu, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Resultaterne blev plottet som middelværdi ± SD.

Kolonidannelse assay

DACT2 stabilt udtrykt TPC-1-celler og DACT2 uudtrykte TPC-1-celler blev fortyndet og genpodedes ved 200 celler per brønd i 6- godt dyrkningsplader in triplo. Vækst medium, condition med Blasticidin på 0,2 ug /ml, blev udskiftet hver 24 timer. Efter 14 d blev celler fikseret med 75% ethanol i 30 minutter og farvet med 0,2% krystalviolet til visualisering og optælling.

Flowcytometrianalyse

Efter 12 timers synkronisering af serum sult, DACT2 stabilt udtrykt TPC-1-celler og DACT2 uudtrykte TPC-1-celler blev dyrket med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 24 timer. Cellerne blev fikseret med 70% ethanol og farvet med 50 ug /ml propidiumiodid (Keygen Biotech, Jiangsu, Kina). Cellerne blev derefter sorteret ved FACS Caliber (BD Biosciences, San Jose, CA) og analyseret ved Modfit software.

Sårheling assay

TPC-1-celler blev dyrket til sammenflydende monolag på 6- brønd plader og en pipettespids blev brugt til at skabe lineære scratch sår. Medium uden føtalt bovint serum blev anvendt til at inhibere celleproliferation. Oprullede billeder blev taget med et digitalt kamera monteret på lysmikroskop ved 0, 36 og 72 timer. Såret spaltebredder blev målt under anvendelse Billede J software

Transwell assay

Migration:. TPC-1-celler blev tilsat til det øvre kammer på 8,0 um porestørrelse Transwell apparat (Corning, NY, USA ) ved en tæthed på 4 x 10

4-celler (100 ul) pr kammer og inkuberes i 13 timer efterfulgt af fjernelse af cellerne, der forblev i den øverste kammer med vatpinde. Invasion: øvre kammer blev coatet med Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). TPC-1-celler blev tilsat til det øvre kammer med en tæthed på 6 x 10

4-celler (100 ul) pr kammer og inkuberes i 36 timer efterfulgt af fjernelse af de celler, der forblev i den øverste kammer med vatpinde. Celler, som trængte til den nedre membranoverfladen blev fikseret i 4% paraformaldehyd, farvet med 0,2% krystalviolet og talt i høj powered felter (100 ×) med lysmikroskop.

Dual-Luciferase reporter assay

Tpc-1-celler blev podet ved 8 × 10

4 celler per brønd i 24-brønds dyrkningsplader 24 timer før transfektion. For at undersøge transkriptionsaktivitet drevet af TCF /LEF, Tpc-1-celler blev transficeret med 100 ng /brønd TOP flash reporter vektor (TCF /LEF-responsiv reporter), 10 ng /brønd pRL-TK og pCl-neo-β-catenin udtrykkende vektor (150 ng /brønd) blev anvendt til at aktivere reportergenet; Som en negativ kontrol blev en anden gruppe af Tpc-1-celler transficeret med 100 ng /brønd Fopflash reporter vektor, 10 ng /brønd pRL-TK styrevektor og β-catenin udtrykkende vektor (150 ng /brønd). Derefter stigende mængder af 150 ng /brønd DACT2 vektor og 150 ng /brønd Dvl2 vektor blev transficeret ind i celler sammen med Topflash reporter vektor, pRL-TK styrevektor og pCI-neo-β-catenin at vurdere regulative funktion DACT2 i Wnt signalvejen.

48 timer efter transfektion blev relative luciferaseaktiviteter målt med Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Shanghai, Kina) ifølge fabrikantens protokol. For hvert forsøg blev luciferase reporter assay udført tre gange [35].

DACT2 slået ned af siRNA

Et valgt siRNA (siRNA618) [11] målrettet DACT2 og RNAi Negative Control Duplex var anvendt i denne undersøgelse. Sekvenserne var som følger: siRNA duplex (sense: 5-GUC GGU UGA UGA GAC UAC UTT-3; antisense: 5-AGU AGU CUC AUC AAC CGA CTT-3); RNAi negativ kontrol duplex (sense: 5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3; antisense: 5-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3). RNAi oligonukleotid eller RNAi negativ kontrol duplex (Gene Pharma Co, Shanghai, Kina) blev transficeret ind W3 celler i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Protein forberedelse og western blotting

Transficerede celler blev lyseret i RIPA Lysis Buffer (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kina). De proteinlysater blev derefter separeret ved SDS-PAGE og elektro-blottet på PVDF-membraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk og 0,1% Tween-20 i TBS blev membranerne inkuberet med antistoffer. Antistofferne var som følger: DACT2 (OriGene Tech, MD, USA), cyclinD1 (Bioworld Tech, MN, USA), c-myc (Bioworld Tech, MN, USA), MMP-9 (Bioworld Tech, MN, USA), β-catenin (Bioworld Tech, MN, USA), phospho-β-catenin (Bioworld Tech, MN, USA) og β-actin (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kina) .De blots blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens (Beyotime Biotech, Jiangsu , Kina).

Statistisk analyse

foreningen af ​​DNA methylering og klinik-patologisk faktorer i menneskets papillær kræft i skjoldbruskkirtlen blev analyseret af

χ

2

test for uafhængighed dikotome variabler og Student t-test for kontinuerlige variabler. Resultaterne blev vurderet til at være statistisk signifikant ved p 0,05 (*), s 0,01 (**), s 0,001 (***). Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS 19,0 software.

Resultater

DACT2

er bragt til tavshed af promotor-regionen hypermethylering i skjoldbruskkirtlen kræftceller

At udforske udtrykket af

DACT2

i kræft i skjoldbruskkirtlen, var almindelig PCR ansat.

DACT2

udtryk blev opdaget i den humane kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinje K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C ved regelmæssig PCR. Tab af

DACT2

ekspression blev detekteret i TPC-1-cellelinien (Fig. 1A). Vi undersøgte dernæst

DACT2

methylering under anvendelse methyleringsspecifik PCR (MSP) i disse cellelinjer. Komplet methylering blev fundet i TPC-1-celler og unmethylation blev fundet i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinjer (fig. 1B). Tab af

DACT2

udtryk var korreleret med promoter region hypermethylering. For yderligere at validere

DACT2

ekspression blev reguleret af promotorregionen methylering blev skjoldbruskkirtlen cancercellelinier behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza). Re-ekspressionen af ​​

DACT2

blev fundet i TPC-1-cellelinje og ingen udtryk ændringer blev afsløret i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinier efter 5-Aza behandling (fig. 1A ). Disse resultater viser, at

DACT2

ekspression blev reguleret af promotorregion methylering. For at se effektiviteten af ​​methylering specifikke PCR (MSP) primere og methylering tæthed i

DACT2

promoter region, vi udførte bisulfit sekventering (BSSQ;. Figur 1C). MSP resultater er i overensstemmelse med bisulfit sekventering resultater meget godt og

DACT2

promotor-regionen blev tæt methyleret i TPC-1 celler. Spare methylering steder i promotor-regionen blev fundet i K1, W3 og SW579 celler

A:.

DACT2

udtryk blev analyseret ved regelmæssig PCR før (-) og efter (+) 5-Aza behandling. K1, TPC-1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C er kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer. H2O: double-destilleret vand. GAPDH: intern kontrol. B: MSP resultater viser

DACT2

methylering status. IVD (in vitro denatureret DNA) tjente som methylering kontrol. NL (normal lymfocyt DNA) tjente som unmethylation kontrol. M: methylerede alleler; U: methylerede alleler. C: Repræsentative bisulfit sekventering resultater i

DACT2

promoter region. Dobbelt pil repræsenterer MSP forstærkning region. Udfyldte cirkler repræsenterer methylerede CpG sites og åbne cirkler betegner umethylerede CpG sites. TSS:. Transskriptionsstartstedet

DACT2

ofte methyleres i primær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen og methylering af DACT2 er forbundet med lymfeknude metastaser

At udforske methylering ændringer i

DACT2

i udviklingen kræft i skjoldbruskkirtlen, 99 tilfælde af primær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen blev opdaget af MSP. 64 tilfælde af fremskreden kræft i skjoldbruskkirtlen (64,6%) blev methylerede (Fig. 2A). Ingen methylering blev fundet i 10 tilfælde af ikke-kræft i skjoldbruskkirtlen vævsprøver (Fig. 2B). Som vist i tabel 1 blev methylering af

DACT2

forbundet med lymfeknudemetastaser signifikant (p 0,01). Ingen association blev fundet mellem

DACT2

methylering og alder, køn, rygning, alkohol, slægtshistorie og stråling historie. Resultaterne antyder, at methylering af

DACT2

er associeret med skjoldbruskkirtlen cancermetastase. Ovenfor resultater viser, at methylering af

DACT2

kan tjene som detektiv og metastatisk markør for papillær kræft i skjoldbruskkirtlen

A:. Repræsentant MSP resultater af

DACT2

i human primær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen . B: Repræsentant MSP resultater af

DACT2

i normale skjoldbruskkirtlen væv fra noncancerous patienter. C: Repræsentative DACT2 farvningsresultater i papillær thyroidcancer og tilstødende væv bestemt ved IHC. (A, b, 200 × c, d, 400 ×). D: DACT2 udtryk scoringer vises som box plots, vandrette linjer repræsenterer median score; bunden og toppen af ​​boksene repræsenterer 25. og 75. percentiler; lodrette søjler repræsenterer området ekspression. DACT2 udtryk er væsentligt anderledes i 50 tilfælde af matchede tumor og tilstødende vævsprøver, s 0,001. E: Foreningen for tab /reduktion af DACT2 udtryk og promotor hypermethylering blev analyseret

x

2

test i 50 tilfælde af matchede primær skjoldbruskkirtlen papillær kræft og tilstødende vævsprøver. (P 0,05)

For at udforske sammenslutning af DACT2 udtryk og promoter region hypermethylering i primær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, blev DACT2 udtryk beregnet ved immunhistokemi (IHC) i 50 tilfælde af. tilgængelig matchede papillær thyroidcancer og tilstødende vævsprøver. DACT2 farvning blev observeret overvejende i cytoplasmaet som rapporteret i de andre kræftformer. Vi fandt, at DACT2 ekspression blev reduceret i papillære skjoldbruskkirtlen cancervæv sammenlignet med de hosliggende vævsprøver (p 0.001, Fig 2C og D.). Og reduceret ekspression var forbundet med DACT2 promoter region hypermethylering signifikant (p 0,05;. Figur 2E). Disse resultater tyder på, at DACT2 udtryk er reguleret af promotor-regionen hypermethylering i primær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen.

Restaurering af DACT2 udtryk undertrykker cellevækst og inducerer G1 anholdelse i skjoldbruskkirtlen cancerceller

For at vurdere effekten af DACT2 på skjoldbruskkirtlen carcinogenese, cellelevedygtighed og kolonidannelse blev evalueret før og efter restaurering af DACT2 ekspression i TPC-1-celler (fig. 3A). Cellernes levedygtighed og kolonidannelse blev undertrykt efter fornyet udtryk for DACT2 i TPC-1 celler (Fig 3B og C, s. 0,01). Resultaterne indikerer, at DACT2 inhiberer thyroidcancer celleproliferation. For yderligere at forstå mekanismen, flowcytometri assay blev anvendt. Fordelingen af ​​cellefaser i DACT2 uudtrykte og re-udtrykte TPC-1cells var som følger: G0 /1 fase:. 32,24 ± 1,61%

vs

55,49 ± 3,09% (p 0,001); S fasen: 38,06 ± 2,34%

vs

25,23 ± 1,15% (p 0,05);. G2 /M fase: 29,70 ± 3,38%

vs

. 19.27 ± 2,32% (p 0,05). Resultaterne antyder, at G0 /1 fase blev forøget, S-fasen og G2 /M-fase blev reduceret efter restaurering af DACT2 ekspression i TPC-1cells (fig. 3D). Som vist i figur S1, blev der ikke apoptose induceret af DACT2 i TPC-1-celler (p 0,05)

A:. Re-ekspression af DACT2 blev fundet efter transfektion af DACT2 ekspressionsvektor i TPC-1-celler. B: MTT resultater: DACT2 undertrykker levedygtigheden af ​​TPC-1 celler (p 0,001). C: kolonidannelse resultater før og efter re-udtryk DACT2 i TPC-1 celler. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange (p 0,01). Hvid bar: tom vektor; sort bjælke: DACT2 ekspressionsvektor. D: G1 anholdelse blev induceret af DACT2 i TPC-1 celler. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange (p 0,001). Hvid bar: tom vektor; sort bjælke:. DACT2 ekspressionsvektor

Restaurering af DACT2 udtryk hæmmer celle migration og invasion i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen

Som DACT2 methylering er forbundet med papillær kræft i skjoldbruskkirtlen metastase, effekten af ​​DACT2 på celle invasion og migration blev analyseret i papillære skjoldbruskkirtlen kræftceller. Sårheling og transwell assay blev anvendt i denne undersøgelse. Som vist i fig. 4A og 4B, blev migration celle hæmmede tilsyneladende efter re-ekspressionen af ​​DACT2 i TPC-1 celler (p 0,001). I Transwell assay uden ECM belægning, antallet af migrerede celler af hver høj powered felt var 354,50 ± 47,44

vs.

64,83 ± 4,48 før og efter fornyet ekspression af DACT2 i TPC-1-celler (fig. 4C , p 0,001). Under invasionen afsløring, den invasive celle antallet af hver høj powered felt var 1091,40 ± 119,55

vs

31,58 ± 16,36 før og efter restaurering af DACT2 udtryk (Fig 4C, s. 0,001).. Det indikerer, at DACT2 hæmmer celle invasion og migration i kræft i skjoldbruskkirtlen. Ovenfor resultater antyder, at DACT2 undertrykker kræft i skjoldbruskkirtlen metastaser

A:. Cellemigrering undertrykt af DACT2 betydeligt i TPC-1-celler under sårheling afsløring. B: Blå linie repræsenterer sårheling resultat af tom vektor gruppe og den røde linje repræsenterer sårheling resultat af DACT2 re-udtrykte gruppe i TPC-1-celler i 72 timer (p 0,001). C:. Cell migration og invasion blev undertrykt af DACT2 i TPC-1-celler under transwell studiet (p 0,001)

DACT2 hæmmer Wnt /β-catenin signalering i kræft i skjoldbruskkirtlen

i den kanoniske Wnt /β-catenin signalvej, vil forøget β-catenin i cytoplasmaet fremme translokation af β-catenin til kernen. β-catenin i kerner binder til TCF /LEF i flere typer af cancere for transkriptionel aktivering af downstream gener, såsom cyclinD1, c-myc og MMP’er [15] – [21], som spiller en vigtig rolle i carcinogenese og metastase. At udforske effekten af ​​DACT2 på Wnt signalering i human cancer i skjoldbruskkirtlen, blev Topflash og (TCF /LEF) reporter-system anvendt. Som vist i figur 5A, blev aktiviteten af ​​TCF /LEF signifikant inhiberet af DACT2. Det er den samme med vores tidligere rapport i human lungecancer [11], blev aktiviteten af ​​TCF /LEF steget med co-transfektion DACT2 og Dvl2 med vildtype eller mutant-typen β-catenin. For yderligere at validere virkningen af ​​DACT2 på cellemigrering og invasion, blev β-catenin overudtrykt i DACT2 stabilt udtrykt TPC-1-celler. Antallet af migrerede celler af hver høj powered felt var 646 ± 158

vs

867 ± 118 før og efter overekspression af β-catenin i DACT2 stabilt udtrykt TPC-1 celler (Fig 5B, s. 0,05). . Antallet af invasive celle for hver høj powered felt var 35 ± 32

vs

100 ± 50 før og efter overekspression af β-catenin i DACT2 stabilt udtrykt TPC-1 celler (Fig 5B, s. 0,05). . Resultaterne antyder endvidere, at DACT2 undertrykker cellemigration og invasion ved at hæmme Wnt signalering i human cancer i skjoldbruskkirtlen. Phosphoryleret β-catenin (p-β-catenin) er en vigtig komponent, der repræsenterer β-catenin nedbrydning. I vores undersøgelse blev ekspressionen af ​​c-myc, cyclinD1 og MMP-9 reduceret, og niveauet af p-β-catenin blev forøget efter fornyet ekspression af DACT2 i TPC-1-celler (fig. 5C). For yderligere at validere virkningen af ​​DACT2 på Wnt signalering, blev siRNA knockdown anvendte teknik. Ekspressionen af ​​c-myc, cyclinD1 og MMP-9 blev forøget, og niveauet af p-β-catenin blev reduceret i DACT2 udtrykte W3 og SW579-celler (fig. 5C). Ovenfor resultater antyder, at DACT2 undertrykker kræft i skjoldbruskkirtlen celledeling og metastase ved at hæmme Wnt signalering

A:. Resultater af TCF /LEF luciferase reporter assay. β-catenin-ekspressionsvektor blev cotransficeret med TCF /LEF Topflash reporter eller dens mutant, Fopflash i TPC-1-celler. Luciferaseaktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Relativ luciferaseaktivitet (forholdet mellem ildflueluciferase at Renilla luciferase) blev undertrykt af DACT2. Forsøget blev gentaget i tre gange (* p 0,05). Øget luciferaseaktivitet blev induceret ved co-transfektion DACT2 og Dvl2. Forsøget blev gentaget i tre gange (* p 0,05). B: Cell migration og invasion blev forøget med β-catenin i DACT2 stabilt udtrykt TPC-1-celler under transwell undersøgelsen. Forsøget blev gentaget i tre gange (p 0,05). C: Ekspressionen af ​​β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 blev reduceret, og niveauet af phosphoryleret β-catenin (p-β-catenin) blev forøget efter restaureringen af ​​DACT2 ekspression i TPC-1-celler. Ekspressionen af ​​β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 blev forøget, og niveauet af p-β-catenin blev reduceret efter knock down DACT2 i W3 og SW579 celler.

Diskussion

Det er ønskeligt at styre kræft i skjoldbruskkirtlen personligt baseret på biomarkører. Hidtil ingen pålidelig biomarkør blev fundet for at forudsige prognosen og radio eller kemo-følsomhed i kræft i skjoldbruskkirtlen [22], [23]. Epigenetiske ændringer blev fundet hyppigt i humane cancere, herunder kræft i skjoldbruskkirtlen [24] – [29]. DNA methylering kan tjene som diagnostiske, prognostiske, kemo-sensitive og radio-følsomme markører [30] – [35]. Lyddæmpet udtryk for nøglekomponent ved DNA methylering i cancer relateret signalvej kan blive det terapeutiske mål [34] – [37]

Xenopus Dapper og Xenopus Frodo er Dishevelled proteiner, som viser 89% total-amino. -syre identitet [38]. Xenopus Dapper hævdes at inhibere β-catenin pathway samt JNK-vejen, mens Xenopus Frodo hævdes at aktivere β-catenin pathway [6], [39]. DACT1 og DACT2 er menneskelige homologer af Xenopus Dapper og Frodo, som er Dishevelled proteiner. DACT1 og DACT2 gener, der består af fire exoner, blev fundet at kode DACT1 protein (799-aminosyrer) og DACT2 protein (774-aminosyrer), hhv. DACT1 og DACT2 viste 28,8% total-amino-syre-identitet. Syv Daph domæner, herunder DAPH2 (leucin zipper), DAPH3 (serin rig) og DAPH7 (PDZ binding) blev bevaret mellem DACT1 og DACT2. DACT1 og DACT2 gener blev kortlagt til humant kromosom 14q22.3 og humant kromosom 6q27 henholdsvis [7]. Menneskelig kromosom 14q22.3-32.1 slettes i astrocytom [40]. Humant kromosom 6q27 er en region af hyppig tab af heterozygositet i humane cancere [41] – [47]. Baseret på Evolutionær og funktionel bevarelse af Wnt signalmolekyler samt menneskelig kromosomal lokalisering blev DACT1 og DACT2 gener forventes at være potente cancer-associerede gener. Nylig undersøgelse foreslået, at DACT2 hæmmer Pitx2 aktivering Wnt signalering i embryonale tand udvikling [8]. Vores tidligere undersøgelser vist, at DACT2 ofte methyleres i lunge og lever kræft, og methylering af DACT2 aktiverer Wnt signalering [10], [11]. For yderligere at forstå den rolle DACT2 i kræft i skjoldbruskkirtlen, vi har registreret promotorområdet methylering i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen først. DACT2 ofte methyleres i human papillær thyreoideacancer og methylering af DACT2 er forbundet med lymfeknudemetastaser. Disse resultater tyder på, at DACT2 methylering kan tjene som detektiv og prognostisk markør for papillær kræft i skjoldbruskkirtlen. Sårhelingen og transwell assay blev anvendt til at evaluere effekten af ​​DACT2 på skjoldbruskkirtlen cancermetastase. Som forventet, re-ekspressionen af ​​DACT2 hæmmer celle migration og invasion i TPC-1cells. Udtrykket af MMP-9 blev reduceret efter restaurering af DACT2 udtryk i TPC-1cells og steg efter knockdown af DACT2 i W3 og SW579 celler. Som DACT2 ekspression blev reguleret af promotor-regionen hypermethylering i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, kan DACT2 methylering inddrage i skjoldbruskkirtlen carcinogenese. For at besvare disse spørgsmål, blev funktionen af ​​DACT2 yderligere undersøgt. Celledeling og kolonidannelse blev hæmmet, og G1 fasen anholdelse blev induceret af DACT2 i skjoldbruskkirtlen kræftceller.