PLoS ONE: En Pan-Cancer Analyse af Transkriptomet ændringer i forbindelse med somatiske mutationer i U2AF1 afslører Almindeligt Altered splejsningsbegivenheder

Abstrakt

Selvom tilbagevendende somatiske mutationer i splejsning faktor

U2AF1

(også kendt som

U2AF35

) er blevet identificeret i flere forskellige typer kræft, virkningerne af disse mutationer på cancer transkriptomet er endnu ikke fuldt belyst. Her har vi identificeret splejsning ændringer forbundet med

U2AF1

mutationer tværs distinkte kræftformer ved hjælp af DNA og RNA-sekventering data fra The Cancer Genome Atlas (TCGA). Brug RNA-Seq data fra 182 lunge adenokarcinomer og 167 akutte myeloide leukæmier (AML), hvor

U2AF1

er somatisk muteret i 3-4% af tilfældene, vi identificeret 131 og 369 splejsning ændringer, henholdsvis som var signifikant associeret med

U2AF1

mutation. Af disse 30 splejsning ændringer var statistisk signifikante i både lunge adenocarcinom og AML, herunder tre gener i Cancer Gene Census,

CTNNB1

,

CHCHD7

, og

PICALM

. Cell line eksperimenter udtrykker

U2AF1

S34F i HeLa celler og i 293T celler yde yderligere støtte, at disse ændrede splejsningsbegivenheder er forårsaget af

U2AF1

mutation. I overensstemmelse med funktionen af ​​U2AF1 i 3′-splejsningssted anerkendelse, fandt vi, at S34F /Y mutationer forårsager præferencer for CAG løbet UAG 3′-splejsningssted sekvenser. Denne rapport viser konsistente effekter af

U2AF1

mutation på splejsning i forskellige cancer celletyper

Henvisning:. Brooks AN, Choi PS, de Waal L, Sharifnia T, Imielinski M, Saksena G, et al. (2014) En Pan-Cancer Analyse af Transkriptomet ændringer i forbindelse med somatiske mutationer i

U2AF1

Afslører Almindeligt Altered splejsningsbegivenheder. PLoS ONE 9 (1): e87361. doi: 10,1371 /journal.pone.0087361

Redaktør: Gil Ast, Tel Aviv University, Israel

Modtaget: Juni 28, 2013; Accepteret: December 20, 2013; Udgivet: 31 Jan 2014

Copyright: © 2014 Brooks et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health Grant 5U24CA143867-03. ANB er en Merck Fellow af Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2138-12). JC er understøttet af en American Cancer Society AstraZeneca Postdoc Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De seneste hel-exome sekventering studier har identificeret tilbagevendende somatiske mutationer i splejsning faktorer i myelodysplastisk syndrom [1], kronisk lymfatisk leukæmi [2], akut myeloid leukæmi [3], brystkræft [4], lunge adenocarcinom [ ,,,0],5], og uveal melanom [6]. Mange af disse muterede splejsningsfaktorer er forgreningspunkt eller 3′-splejsningssted anerkendelse faktorer (fx

SF3B1

U2AF1

) og er involveret i reguleringen af ​​intron fjernelse fra præ-mRNA. 3′-splejsningssted anerkendelse kompleks er sammensat af U2AF1 og U2AF2 (også kendt som U2AF65), hvor U2AF1 er vigtig for anerkendelse af AG på 3′-splejsningssites [7] og U2AF2 genkender polypyrimidine tarmkanalen opstrøms for AG [8 ].

U2AF1

er blevet rapporteret at have betydelige hotspot mutationer ved aminosyre position 34 i myelodysplastisk syndrom [1], lunge adenocarcinomer [5], og AML [3].

U2AF1

mutationer co-forekomme med mutationer i kendte driver onkogener i lunge adenocarcinom [5], og det er endnu uklart, om disse mutationer er oncogenically omdanne. For yderligere at belyse centrale effekter af

U2AF1

mutationer på kræft biologi, vi havde til formål at identificere fælles transkriptom ændringer forbundet med

U2AF1

mutationer i forskellige typer kræft.

Resultater

Somatiske mutationer i

U2AF1

tværs 12 cancertyper

at se på transkriptom ændringer i forbindelse med

U2AF1

mutationer i forskellige typer kræft, vi anvendes Cancer Genome Atlas ( TCGA) data, der giver både somatiske mutationer på DNA-niveau og high-throughput sekventering af mRNA (RNA-Seq) i de samme individuelle prøver på tværs af flere typer kræft. Brug tilgængelige data fra 12 TCGA cancertyper [9], identificerede vi kræft huser somatiske mutationer i

U2AF1

. På tværs 2.979 kræft prøver med både hel-exome sekvensering og RNA-Seq, 26 havde missense mutationer i

U2AF1

-17 ved aminosyrestilling 34 (tabel S1 i dokument S1, figur 1).

U2AF1

S34F mutationer blev fundet i otte lunge adenocarcinomer (4%), fire AML prøver (2%), to endometriske carcinomer (1%), og en blærecancer prøve (1%). Der var også to

U2AF1

S34Y AML prøver (1%).

U2AF1

blev rapporteret at være signifikant muteret i både lunge adenokarcinomer [5] og AML [3]; dog ikke signifikant muteret i endometriske carcinomer [10], hvilket sandsynligvis skyldes den lave frekvens inden denne cancertype. Foruden S34F /Y mutationerne blev otte andre somatiske mutationer observeret i

U2AF1

. For at identificere transkriptom ændringer forbundet med

U2AF1

mutation, vi fokuseret på lunge adenocarcinom og AML som disse kræftformer har en højere frekvens af mutationer og dermed ville have mere magt til at opdage statistisk signifikante ændringer i forbindelse med den mutation og kontrol for forskelle mellem væv af oprindelse. De S34F og S34Y mutationer resulterer i aromatiske aminosyrer; Derfor anser vi S34F og S34Y mutationer til at være funktionelt ens.

(A) Repræsentation af somatiske mutationer i

U2AF1

observeret på tværs af 12 TCGA cancertyper [9]. Fem kræftformer havde ingen somatiske mutationer i

U2AF1

. Aminosyrepositionerne er angivet. Zn, zinkfinger; UHM, U2AF homologi motiv. (B) JuncBASE analyse af RNA-Seq data identificeret 131 og 369 splejsningsbegivenheder markant forskelligt splejset i lunge adenocarcinom og AML eksemplarer bærer

U2AF1

S34F /Y mutationer hhv.

Transkriptomet ændringer i forbindelse med

U2AF1

S34F /Y mutationer i lunge adenocarcinom og akut myeloid leukæmi

Vi brugte JuncBASE [11] for at identificere alternative splejsning begivenheder, der blev væsentligt forskelligt splejset mellem

U2AF1

vildtype kræft prøver og

U2AF1

S34F /Y prøver. JuncBASE identificerer og klassificerer former for alternativ splejsning (f.eks, kassette exon, alternative 5 ‘splejsningssites, alternative 3’ splejsningssteder), kvantificerer overflod af optagelsen eller udelukkelse af hvert alternativ exon, beregner så en “procent splejset i” (PSI ) værdi for hvert splejsning begivenhed i hvert kræft prøve. En Wilcoxon rank-sum test blev udført på PSI-værdier mellem kræft med eller uden

U2AF1

S34F /Y mutationer for at identificere splejsningsbegivenheder, der var signifikant forskellig mellem de to grupper. For at kontrollere for væv af oprindelse, vi sammenlignet

U2AF1

vildtype og S34F /Y prøver inden for samme kræftform.

U2AF1

S34F lunge adenokarcinomer blev fundet på tværs af de tre udtryk undertyper (TCGA,

indsendt

) og

U2AF1

S34F /Y AML prøver forekom tværs fem fransk-Amerika- Britisk (FAB) AML undertyper [3]; derfor, vi ikke yderligere at kontrollere for undertype. Somatiske mutationer i

U2AF1

har vist sig at være gensidigt udelukkende med andre splejsningsfaktorer [1], [3], [5], hvilket antyder, at spliceosome pathway mutationer kan have samme funktionelle virkninger på onkogenese. For at fjerne potentielle konfoundere fra mutationer i andre splejsning faktorer, vi kiggede for forskelligt splejsede begivenheder mellem prøver med

U2AF1

S34F /Y mutation og prøver huser ingen mutation i nogen splejsning faktor gen, der tidligere er blevet rapporteret til at blive ændret væsentligt i cancer (tabel S1-S2 i dokument S1).

Brug JuncBASE, vi identificeret 131 og 369 alternative splejsning begivenheder, der blev væsentligt forskelligt splejset i tilstedeværelsen af ​​en

U2AF1

S34F /Y mutation i lunge adenocarcinom og AML (False Discovery Rate (FDR) 5%), hhv. Derudover disse splejsningsbegivenheder har en forskel på 10% i den mediane PSI af kræft uden splejsning faktor genmutation og kræft med

U2AF1

S34F /Y mutationer (File S1-S3). Sammenligning

U2AF1

S34F /Y mutation med

U2AF1

prøver vildtype (nogle med mutationer i andre splejsning faktorer) gav lignende resultater i lunge adenocarcinom (TCGA,

indsendt

) og AML (File S4). JuncBASE kvantificering af

U2AF1

S34F /Y-associerede splejsningsbegivenheder i AML blev i overensstemmelse med en analyse af

U2AF1

mutationer i 20 AML prøver [12] (r

2 = 0,84, figur S1 i dokument S1).

Som både en positiv og negativ kontrol for denne analyse, vi sammenlignet 10 lungeadenokarcinom prøver med et

MET

exon 14 splejsningsstedmutationen eller sletning med alle andre lunge adenocarcinom prøver at kigge efter betydelig differentiel splejsning mellem de to grupper.

MET

exon 14 ændringer forekomme på et tilsvarende frekvens som

U2AF1

mutationer i lunge adenocarcinom (TCGA,

indsendt

). Denne analyse fungerer som en positiv kontrol, fordi de mest stærkt forbundet differential splejsning begivenhed bør være

MET

exon 14. Denne analyse også fungerer som en negativ kontrol, da ændringerne ikke kan forventes at forårsage globale ændringer i splejsning siden mutationerne forekommer ved

cis

virkende splejsningssite ændringer. Faktisk JuncBASE analyse kun identificeret den splejsning af

MET

exon 14 som væsentligt forskelligt splejset med en forskel i PSI . 10%

Som en ekstra kontrol, vi identificerede alternative splejsningsbegivenheder signifikant associeret med

STAG2

mutationer i lunge adenocarcinom og AML, som

STAG2

forventes ikke at være en splejsning regulator og det er muteret på et tilsvarende frekvens i begge typer kræft. Kun én splejsning begivenhed var signifikant associeret med

STAG2

mutation i lunge adenocarcinom og ingen i AML.

Svarende til hvad der blev observeret i en omfattende karakterisering af lunge adenocarcinom (TCGA,

indsendt

), de splejsningsbegivenheder forbundet med

U2AF1

S34F mutationer i AML viser også berigelse af kassette exons og alternativ 3 ‘splejsningssites (Figur 1B). Vi har ikke observere brede virkninger på intron fastholdelse, som menes at forekomme i nærværelse af en spliceosome mutation. Hvis

U2AF1

mutationer forårsage mange introns skal splejset, måske er det ikke på en ensartet måde og disse forekomster er ryddet bort af nonsens-medieret henfald (NMD). For at se, om kassetten exon og 3′-splejsningssted bias er et generelt træk ved alternativ splejsning i disse kræfttyper eller specifikke for splejsning ændret af

U2AF1

mutation, vi identificerede proportioner af hver type alternativ splejsning begivenhed i top 10% mest variable splejsning begivenheder i lunge adenokarcinomer uden splejsning faktor mutationer (figur S2 i dokument S1).

U2AF1

S34F /Y cancere fortrinsvis udviser ændringer i kassette exon og 3′-splejsningssites i forhold til sættet af meget varierende splejsningsbegivenheder (chi i anden-test, P = 6.6e-26).

Selvom der er splejsning ændringer, der er forbundet med

U2AF1

S34F /Y mutation i disse cancer prøver, er det uklart, om splejsnings- ændringer skyldes mutationen eller hvis der er ukendte genomiske ændringer, som også korrelerer med splejsningsfaktorerne ændringer. For at evaluere yderligere forholdet mellem splejsning ændringer og

U2AF1

S34F mutationer, vi analyserede tidligere offentliggjorte RNA-Seq data, der sammenligner ektopisk udtryk for

U2AF1

S34F eller

U2AF1

Wild- skriv ekspression i HeLa-celler [1]. JuncBASE analyse sammenligner ikke-induktion kontrol med

U2AF1

vildtype eller

U2AF1

S34F induktion identificeret 1.221 og 5,399 væsentlige splejsning ændringer, henholdsvis (File S5 og S6). Vi finder en betydelig overlapning af 165 splejse ændringer efter induktion af

U2AF1

S34F i HeLa-celler og splejsning ændringer i human cancer med

U2AF1

S34F /Y-mutationer (Figur 2, Fishers eksakte test, P 2.2E-16). I modsætning hertil finder vi en mindre andel af splejsning ændringer på

U2AF1

vildtype induktion at svare til ændringer i humane cancere (15/1221, Fishers eksakte test, P = 0,72). I alt 35% af

U2AF1

S34F /Y-associerede splejsning ændringer set i lunge adenocarcinom eller AML understøttes af splejsning ændringer forårsaget af

U2AF1

S34F udtryk i HeLa-celler. Vi forventer ikke alle splejsning ændringer, der skal overholdes i HeLa celle eksperimenter som splejsning ændringer er kendt for at være kontekst afhængig (revideret i [13]) og

U2AF1

induktion forårsager overekspression af genet [1], som kan påvirke spliceosome kompleksdannelse.

En sammenligning af ændringer i splejsning forbundet med

U2AF1

somatisk mutation i humane kræftformer og

U2AF1

S34F induktion i HeLa-celler.

U2AF1

S34F /Y fortrinsvis splejsninger til CAG stedet UAG 3 splejsningssted sekvenser

U2AF1 er den lille underenhed af U2AF heterodimeren der anerkender AG konsensus på 3 ‘ splejsningssteder. En tidligere undersøgelse, der identificerede differentieret splejsning af 35 exons forbundet med

U2AF1

mutation identificeret en sekvens signatur på 3 ‘splejsningssteder af de alternative exons [12]. I betragtning af de betydelige ændringer i kassette exons og alternative 3’-splejsningssted begivenheder forbundet med

U2AF1

S34F /Y mutation, vi undersøgte sekvenser af 3 ‘splejsningssteder der blev fortrinsvis anvendt i

U2AF1

S34F /Y muterede cancere. For enkelhed, vi undersøgte kun splejsning ændringer mellem to alternative 3 ‘splejsningssteder.

Som splejsning faktor binding kan variere afhængigt af splejsning aktivering eller repression (revideret i [14]), så vi på splejsningssted sekvenser af exon inklusion og eksklusion begivenheder, hver for sig. Fra det sæt af

U2AF1

S34F /Y-associeret kassette exons og alternative 3′-splejsningssted ændringer i AML, fandt vi en signifikant bias i retning af at springe af en exon (69% af kassette exons) eller brugen af ​​en mere distale 3′-splejsningssted (75% af alternative 3′-splejsningssteder) (binomialtest, P 1e-4, figur 3A). Vi fandt en lignende skævhed i retning af exon skipping og distal splejsningssted brug af

U2AF1

S34F-associerede splejsning begivenheder i lunge adenocarcinom (Figur S3 i dokument S1). Til sammenligning vi identificeret alternative splejsningsbegivenheder signifikant forbundet med

RBM10

mutation i lunge adenocarcinom (File S7). RNA bindende protein

RBM10

viste sig at være betydeligt muteret i lunge adenokarcinomer med tilbagevendende læserammeforskydning, nonsense eller splejsningssite mutationer [5]. Den observerede exon skipping er specifik for

U2AF1

S34F-associerede splejsningsbegivenheder som observeres den modsatte skævhed i

RBM10

tab af funktion (LOF) associeret splejsningsbegivenheder (Figur S4A-B i Document S1).

(A) Andel af ændret kassette exon og alternative 3′-splejsningssted begivenheder, der viser exon springe versus exon inklusion. (B) Konsensus sekvensmotiver identificeret ved den nærmeste (prox 3’ss) og distale 3 ‘splejsningssites (dist 3’ss) af exon springe begivenheder. (C) Consensus sekvensmotiver ved den proximale og distale 3′-splejsningssteder af exon inklusion begivenheder. Splejsning ændringer udtrykte og kommenterede 3’-splejsningssted valg, hvor splejsningsstedet valget er TAG vs. CAG eller TAG vs. AAG i (D) HeLa-celler + induceret

U2AF1

S34F eller (E) HeLa-celler + induceret

U2AF1

vildtype.

i overensstemmelse med tidligere resultater [12], fandt vi en trinukleotid konsensus TAG sekvens ved proksimale 3 ‘splejsningssteder af oversprungne kassette exons. Desuden har vi også finde dette motiv på proksimale splejsningssteder alternative 3’-splejsningssted begivenheder i

U2AF1

S34F /Y AML prøver (figur 3B). Derudover er en konsensus CAG splejsningssted ved mere distale 3′-splejsningssted observeret, som ikke tidligere er blevet rapporteret (figur 3B). En lignende præference for CAG splejsningssteder (med en mindre AAG sekvens) i løbet af TAG splejsningssteder er observeret i exons fortrinsvis indgår i

U2AF1

S34F /Y AML prøver (figur 3C). Disse præferentielle splejsningssted sekvensmotiver forskellige fra splejsningssted motiver observeret nær proksimale og distale 3′-splejsningssteder kontrol alternative splejsningsbegivenheder (Figur S4C i dokument S1, Wilcoxon rank-sum test, FDR 95%).

slående, ser vi de samme sekvens præferencer i kassette exon og alternative 3′-splejsningssted ændringer i

U2AF1

S34F lunge adenokarcinomer (Figur S3 i dokument S1) og i HeLa-celler transduceret med

U2AF1

S34F mutant konstruktioner (Figur S5A-B i dokument S1). Desuden ser vi ikke denne konsensus 3 ‘splejsningsstedsekvens i

RBM10

LOF-associeret splejsning i lunge adenocarcinom (Figur S4A-B i dokument S1) heller ikke i splejsning ændringer i HeLa-celler transduceret med vildtype

U2AF1

(Figur S5C-D i dokument S1), støtter, at præference sekvens er specifik for

U2AF1

S34F /Y mutationer.

Disse konsensus sekvens motiver blev genereret fra splejsning begivenheder, der var stærkt forbundet med

U2AF1

mutation og ikke løser sekvens præferencer mellem to splejsningsstedet valg fra en individuel splejsning begivenhed. For yderligere at undersøge KAG splejse webstedet præferencer end UAG splejsningssteder undersøgte vi splejsningsstedsekvens skifter mellem alle par af udtrykt og kommenteret CAG versus TAG 3 ‘splejsningssteder. Ved hjælp af en sænkning af identifikation splejsnings- afbrydere, fandt vi, at 57% af CAG versus TAG 3’-splejsningssteder blev ændret i HeLa-celler, der udtrykker

U2AF1

S34F mutation, mens 36% blev ændret, når der udtrykker en

U2AF1

vildtype-konstruktionen (figur 3D). Af

U2AF1

S34F-associerede splejsningssite switche, 83% (884/1065) var en TAG til en KAG splejsningssted, mens kun 53% (347/660) skiftede fra et tag til en KAG, når udtrykke U2AF1 vildtype (Fishers eksakte test, P 2.2E-16). En lignende forspænding af omskiftere fra TAG til AAG 3 ‘splejsningssteder blev observeret (Fishers eksakte test, P = 2.518e-5, figur 3D).

Vores analyse viser, at

U2AF1

S34F /Y mutation forårsager ændringer i 3′-splejsningssted forbrug, hvor en [C /a] AG 3′-splejsningssted foretrækkes over en UAG splejsning site. Vi har ikke observere ændret splejsning af alle UAG 3 ‘splejsningssteder; men det er vanskeligt at skelne mellem uændret splejsning eller nedbrydning af afvigende udskrift af nonsens-medieret forfald, hvilket synes at være uændret.

transkriptom ændringer i cellecyklus gener og andre kræft gener er forbundet med

U2AF1

mutation

Somatisk mutation i

U2AF1

kan forårsage splejsning ændringer i vigtige cancer gener, hvilket resulterer i ændrede gen funktion eller ændrede veje. For at identificere potentielle nedstrøms biologiske konsekvenser af

U2AF1

mutation, vi udførte en Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [15], [16] for at identificere gen sæt positivt korreleret med

U2AF1

S34F /Y mutation i lunge adenocarcinom og AML. Ingen gensæt nåede statistisk signifikans givet en FDR cutoff på 25%. Det blev tidligere rapporteret, at transduktion af

U2AF1

S34F mutationer i HeLa-celler forårsaget opregulering af komponenter af nonsens-medierede henfald (NMD) pathway [1]. Vi har ikke oplever en betydelig opregulering i ekspressionen af ​​NMD faktorer i forbindelse med

U2AF1

mutation i lunge adenocarcinom eller AML.

Selv om der ikke gen-sæt passerede FDR betydning, top-to beriget GO ontologi gen sæt i AML med den højeste normaliserede berigelse scoringer var “mitotitc cellecyklus” og “M fase af mitotisk cellecyklus” (Figur S6 i dokument S1, nominelt P 0,05). En undergruppe af disse cellecyklus gener blev opreguleret i AML prøver med

U2AF1

S34F /Y mutation. I overensstemmelse med den virkning,

U2AF1

mutation på cellecyklus, RNAi udtømning af

U2AF1

[17] og

U2AF1

S34F udtryk i HeLa celler [1] resulterer i en øget fraktion af celler i G2 /M-fasen. Vi kan ikke se nogen sammenhæng med cellecyklus gen sæt i

U2AF1

S34F lunge adenokarcinomer. Dette kan forklares ved den høje forurening normale væv i denne kræfttype [18], hvilket kan påvirke genekspression signaturer.

I overensstemmelse med disse observationer, er der 31 gener med

U2AF1

S34F /Y-associerede splejsningsbegivenheder repræsenteret i “mitotiske cellecyklus” og “M fase af mitotiske cellecyklus” gen-sæt, herunder

CHEK2

,

CDC27

, og flere underenheder af anaphase- fremme kompleks (tabel S3 i dokument S1).

Splejsning ændringer forbundet med

U2AF1

S34F /Y mutation i både lunge adenocarcinom og AML er af særlig interesse, da disse ofte ændrede gener kan gøre kernebidrag til selektive fordel i disse kræftformer. Vi fandt en betydelig overlapning af 30 ændrede splejsningsbegivenheder, der var forbundet med

U2AF1

S34F /Y mutationer i både lunge adenocarcinom og AML (figur 2 og tabel 1, Fishers eksakte test p 2.2E-16). For alle 30 splejsningsbegivenheder, retningen af ​​splejsning var den samme i begge kræftformer, hvor

U2AF1

mutation forårsagede et skift til exon springe eller exon inklusion for samme splejsning begivenheden. Størstedelen (63%) af de almindeligt ændrede begivenheder viste mere distalt 3 splejsningssted brug i

U2AF1

muterede prøver. Desuden blev 17/30 splejsningsbegivenheder signifikant påvirket ved induktion af

U2AF1

S34F i HeLa-celler men havde ingen ændring efter induktion af

U2AF1

vildtype (tabel 1). 60% af disse almindeligt ændrede splejsningsbegivenheder viser 3′-splejsningssted sekvens præference for en CAG, eller AAG, splejsningssted over en TAG-splejsningssted (tabel 1, a eller b), i overensstemmelse med den samlede observerede splejsningsstedsekvens præference

U2AF1

S34F /Y-associerede begivenheder. Derudover kiggede vi for gener med ændrede splejsning begivenheder, der også var i Cancer Gene Census [19] (Tabel S4 i dokument S1). Tre Cancer Gene Census gener var blandt de 30 almindeligt ændrede splejsningsbegivenheder og er af særlig interesse:

CTNNB1

(TCGA,

indsendt

),

CHCHD7

, og

PICALM

(tabel 1 og tabel S4 i dokument S1).

Den ændrede splejsning begivenhed i

CTNNB1

i

U2AF1

mutant kræftformer resulterer i et skift mod splejsning af en mere proximal splejsningssted i 3’UTR af

CTNNB1

(Figur 4A-B). Betydelig opregulering af proksimal brug splejsningssite blev også observeret i HeLa celler, der udtrykker

U2AF1

S34F (figur 4C). Den opreguleret isoform har vist sig at være et mindre stabilt mRNA i HeLa-celler [20]; derfor kan det ændrede splejsningsbegivenhed resultere i en reduktion af CTNNB1 proteinniveauer. Selv

CTNNB1

aktivering er en kanonisk driver mutation, et fald i normale niveauer af CTNNB1 kan også være fordelagtigt at cancerceller som RNAi udtømning af

CTNNB1

har vist sig at øge cellemigrering [21 ].

“Procent splejset i” (PSI) værdier af den proksimale 3′-splejsningssted af

CTNNB1

3’UTR splejsning begivenhed i (A) lunge adenocarcinom og (B) AML. (C) RNA-Seq læse dækning af 3’UTR begivenhed i HeLa-celler med to

U2AF1

ikke-inducerede kontrol, induktion af

U2AF1

vildtype, og induktion af

U2AF1

S34F.

for yderligere test eksperimentelt, om splejsningsbegivenheder observeret i

U2AF1

mutant kræftformer er direkte forårsaget af

U2AF1

mutation, vi transficeret 293T celler med enten

U2AF1

vildtype eller

U2AF1

S34F konstruktioner og analyseret ændringer i fem splejsning begivenheder ved hjælp kvantitativ RT-PCR (figur 5, figur S7 i dokument S1). Vi var i stand til at validere ændringer i splejsning i

CTNNB1

,

CHCHD7

, og

PTBP1

i celler transficeret med

U2AF1

S34F konstruktioner og ikke i celler transficeret med

U2AF1

vildtype (Figur 5, uparret t-test, P 0,1). Splejsning begivenheder i

KARS

CHEK2

ikke validere og kan være kontekstafhængig, falsk-positive i transkriptomet analyse, falske negativer i transfektion eksperiment eller indirekte forsinkede mål for

U2AF1

aktivitet.

en fold forskellen mellem total genekspression og inddragelse isoformen af ​​hver splejsningsbegivenhed blev normaliseret ved folden difference af en no-transfektion kontrolprøve, hvilket gav en relativ inklusionsniveau for hver prøve. De genomiske koordinater for testede splejsning begivenheder i (A)

CTNNB1

, (B)

CHCHD7

, og (C)

PTBP1

er givet i tabel 1.

diskussion

Vores analyse af splejsning og genekspression ændringer i forbindelse med

U2AF1

mutation på tværs af flere typer kræft har afsløret ændringer i 3 ‘splejsningsstedsekvens anerkendelse og fremhæver potentielle biologiske konsekvenser gennem ændrede cancer gener, såsom

CTNNB1

,

PICALM

, og

CHCHD7

. Desuden har vi valideret, at i det mindste nogle af disse splejsnings- ændringer er en direkte følge af

U2AF1

mutation i transfektionsforsøg.

Mange faktorer er involveret i korrekt splejsningssted anerkendelse i kompleks med U2AF1, herunder U2AF2. Det har været velkendt, at 3′-splejsningssted konsensus motiv indbefatter en C eller U nukleotid før AG i slutningen af ​​introner og mutationer i

U2AF1

giver den første indikation af, at en faktor har en særlig præference for denne -3 position [12]. U2AF1 har vist sig at svagt binde til RNA via det UHM domæne [22]. Måske S34F mutation i den opstrøms zinkfingerdomænet påvirker 3′-splejsningssted sekvens anerkendelse via direkte interaktion med præ-mRNA eller via protein-protein interaktioner med U2AF2, hnRNP A1 [23], eller DEK [24]. Yderligere biokemisk karakterisering af U2AF1 S34F proteinet i kompleks med andre proteiner kan føre til en mere generel forståelse af 3′-splejsningssted sekvens anerkendelse.

Sammenfattende fandt vi multiple gener, herunder adskillige kendte cancer-gener med ændret splejsning i tilstedeværelsen af ​​

U2AF1

mutation både i human cancer og i

U2AF1

mutant transfekterede celler. Virkningen af ​​disse splejsning ændringer på gen-funktionen er et vigtigt emne for fremtidig undersøgelse. Vores identifikation af splejse ændringer markant og konsekvent forbundet med somatiske mutationer i

U2AF1

splejsning faktor understreger behovet for fremtidig undersøgelse af funktionen af ​​alternative splejsede former for gener for fuldt ud at forstå de genome ændringer, der er forbundet med kræft.

Metoder

Somatiske mutationer

somatiske mutation opkald fra de 12 TCGA Pan-cancer cancer typer blev anvendt (doi: 10,7303 /syn1710680.4), med undtagelse af lunge adenocarcinom. Lung adenocarcinom somatiske mutation opkald blev taget fra TCGA lungeadenokarcinom analyse arbejdsgruppe (TCGA,

indsendt

).

RNA-Seq behandling

RNA-Seq justering filer til 230 lung adenokarcinomer og 173 akutte myeloide leukæmier (AML) var tilgængelige via CGHub (https://cghub.ucsc.edu). AML alignments downloadet fra CGHub brugt en ældre version af det humane genom reference (hg18); derfor blev de AML BAM filer konverteret til FASTQ hjælp SamToFastq [25] og derefter udrettet mod hg19 hjælp TopHat [26] med følgende parametre: “-G [Gencode v7 udskrifter [27]] -mate-indre-dist 300 -mate -std-dev 500 “. Én AML prøve mislykkedes RNA-Seq re-tilpasning og forarbejdning og blev udelukket: TCGA-AB-2977. RNA-Seq opstillinger af lunge adenocarcinom prøver brugte MapSplice [28].

RNA-Seq FASTQ filer fra HeLa celle eksperimenter blev hentet fra DDBJ arkivet med tallene tiltrædelse DRR001796-DRR001799. Læser blev justeret ved hjælp TopHat [26] ved hjælp Gencode v7 [27] som en udskrift guide.

Splejsning analyse

lungeadenocarcinom prøver, AML prøver og prøver fra HeLa celle line eksperimenter (HeLa +

U2AF1

vildtype ikke-induceret, HeLa +

U2AF1

S34F ikke-induceret, HeLa +

U2AF1

vildtype inducerede, HeLa +

U2AF1

S34F induceret ) blev kørt gennem JuncBASE v0.6 [11] som tre separate analyser sæt. For lunge adenocarcinom og AML prøver, de JuncBASE parametre, der anvendes til at identificere alternative splejsning events og beregne “procent splejset i” (PSI) værdier var følgende:

-c 2 -j [introns fra Gencode v7

[27]

] -jcn_seq_len 88

. For HeLa celle eksperimenter, de JuncBASE parametre var følgende:

-c 2,5 -j [introns fra Gencode v7

[27]

] -jcn_seq_len 202

. For lunge adenocarcinom, Manchetknapper [29]

de novo

udskrift anmærkninger var til rådighed til at indarbejde potentielt nye exons i splejsning analyse (TCGA,

indsendt

). UCSC knownGenes hg19 udskrift anmærkning blev brugt til at definere kommenteret exons [30].

For at identificere

U2AF1

S34F /Y-associerede differential splejsning begivenheder i lunge adenocarcinom og AML,

compareSampleSets.py

af JuncBASE v0.6 pakken blev anvendt med følgende parametre:

-thresh 10 -mt_correction BH -which_test Wilcoxon -delta_thresh 5.0

. Splejsning begivenheder med en signifikant forskel (FDR 5%) i PSI-værdier mellem prøver uden peppe faktor mutation og prøver med

U2AF1

S34F /Y-mutation blev yderligere filtreret for arrangementer med en forskel i median PSI større end 10%. For at identificere splejsningsbegivenheder berørt af ekspressionen af ​​

U2AF1

S34F i HeLa-celler,

pairwise_fishers_test_getASEvents_w_reference.py

blev brugt til at sammenligne inklusion og eksklusion isoform læse tæller mellem HeLa +

U2AF1

vilde -typen ikke-induceret sekventeret bibliotek og HeLa +

U2AF1

S34F-induceret sekventeret bibliotek med følgende parametre:

-thresh 25 -min_dpsi_threshold 5,0 -metoden BH -sign_cutoff 0,05

. For at identificere splejsningsbegivenheder specifikke for

U2AF1

S34F induktion, begivenheden kunne ikke også være signifikant forskellig mellem de to kontroller eller når man sammenligner den

U2AF1

vildtype ikke-induceret til

U2AF1

vildtype induceret. Denne sidste begrænsning blev pålagt at skelne splejsning ændringer som følge til S34F mutationen i stedet for overekspression af

U2AF1

. I nogle tilfælde, såsom 3’UTR splejsningsbegivenhed af

CTNNB1

,

U2AF1

vildtype induktion forårsagede en ændring i splejsning, men i modsat retning som

U2AF1

S34F induktion. At være konservativ, mener vi en

U2AF1

S34F-ramte splejsning begivenhed, der har enhver ændring på

U2AF1

vildtype induktion at være ikke-specifikke for

U2AF1

mutation ; Men gør vi note i tabel 1 i

CTNNB1

begivenhed, der også viste en splejsning ændring i

U2AF1

vildtype induktion, men i den modsatte retning.

I de tilfælde hvor der er mere end to alternativer for en splejsning begivenhed (f.eks tre alternative 3 splejsningssted valg), den mest betydningsfulde differentielt udtrykte isoform er rapporteret.

for at identificere

U2AF1

S34F /Y associeret forskellen splejsning i både lunge adenocarcinom og AML, kontrolleres vi for overlap i de genomiske koordinater for splejse begivenhed fra hver kræftform. Vi fandt 31 splejsning hændelser, der forekom på det samme genomiske placering af generne;