PLoS ONE: KCN1, en roman Synthetic sulfonamid anticancermiddel: In vitro og in vivo Anti-bugspytkirtelkræft Aktiviteter og Prækliniske Pharmacology

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme den

in vitro Salg og

in vivo

anti-cancer aktivitet og farmakologiske egenskaber af 3,4-dimethoxy-

N

-[(2,2-dimethyl-

2H

-chromen-6-yl)methyl]-

N

-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi

in vitro

aktivitet af KCN1 på celleproliferation og cellecyklusfordeling af bugspytkirtelkræftceller, anvendelse af MTT og BrdUrd assays, og flowcytometri.

in vivo

anti-cancer effekter af KCN1 blev evalueret i to forskellige xenograftmodeller af kræft i bugspytkirtlen. Vi udviklede også en HPLC-metode til kvantificering af forbindelsen, og undersøgte dets stabilitet i mus plasma, plasma protein binding, og nedbrydning af mus S9 mikrosomale enzymer. Endvidere undersøgte vi farmakokinetik KCN1 efter intravenøs eller intraperitoneal injektion i mus. Resultaterne viste, at i en dosis-afhængig måde, KCN1 inhiberede cellevækst og induceret standsning af cellecyklus i humane bugspytkirtelkræftceller

in vitro

, og viste

in vivo

anticancer virkning hos mus med Panc -1 eller Mia Paca-2 tumorxenoplantater. HPLC metoden lineær detektion af KCN1 i alle matricerne i intervallet fra 0,1 til 100 um, og havde en nedre detektionsgrænse på 0,085 uM i museplasma. KCN1 var meget stabil i mus plasma, ekstensivt plasma bundet, og metaboliseres af S9 mikrosomale enzymer. De farmakokinetiske undersøgelser viste, at KCN1 kunne påvises i alle de undersøgte væv, mest i mindst 24 timer. Afslutningsvis vores prækliniske data viser, at KCN1 er et potentielt terapeutisk middel til kræft i bugspytkirtlen, der giver grundlag for sin fremtidige udvikling

Henvisning:. Wang W, Ao L, Rayburn ER, Xu H, Zhang X, Zhang X, et al. (2012) KCN1, en roman Synthetic sulfonamid anticancermiddel:

In vitro

In Vivo

Anti-bugspytkirtelkræft Aktiviteter og Prækliniske Farmakologi. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10,1371 /journal.pone.0044883

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Februar 16, 2012; Accepteret: August 15, 2012; Udgivet: 13 september, 2012 |

Copyright: © Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health tilskud R01 CA116804 (til EGVM). RZ blev også støttet af National Institutes of Health giver R01 CA112029 og R01 CA121211. EGVM blev også støttet af EmTechBio, Udvalget Universitets Forskningsfond for Emory University, Brain Tumor Foundation for Children, og V Foundation for Cancer Research. HW blev støttet af de hundrede talenter Program, Chinese Academy of Sciences, tilskud fra National Nature Science Foundation (30870513, 31.070.680, 91.029.715 og 81.025.017) og Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2007CB947100), National Science og Technology Major Project Key Nye Drug Creation and Manufacturing Program 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW blev støttet af National Institutes of Health tilskud R01 CA91980. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er fortsat et stort problem for folkesundheden i hele verden. Der er stigende prækliniske og kliniske opdagelser, der har fiaskoerne prognosen for patienter diagnosticeret med kræft, især brystkræft og prostatakræft. I modsætning hertil har der kun været minimale forbedringer i resultaterne for patienter med kræft i bugspytkirtlen. Kræft i bugspytkirtlen er kendetegnet ved sin invasive natur, evne til at unddrage sig aggressiv terapi, og hyppige sent tidspunkt diagnose [1]. Dødeligheden for kræft i bugspytkirtlen er fortsat høj, med en gennemsnitlig overlevelse på kun 10 måneder efter diagnosen [1] – [4]. Der er et presserende behov for udvikling af nye effektive og sikre midler til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Vi har været interesseret i at udvikle nye kræft terapeutiske midler til menneskelige kræftformer uden strøm effektiv behandling, såsom hjernesvulst og pancreascancer. En unik egenskab ved faste cancere er, at deres hurtige vækst ofte resulterer i reduceret tilgængelighed oxygen på grund af dannelsen af ​​utilstrækkelig eller afvigende vaskulatur [5]. Den hypoxiske fraktion af faste tumorer er resistente over for strålebehandling [6] og konventionel kemoterapi [7] – [10], og hypoxi korrelerer med dårlig terapeutiske resultater [7], [8], [11], [12]. På molekylært niveau, har transkriptionsfaktoren Hypoxi inducible factor-1 (HIF-1) blevet identificeret som den centrale orkestrator af det biologiske respons på hypoxi på grund af sin transaktivering af gener, der er involveret i mange aspekter af malign tumorvækst fra celleoverlevelse og metabolisme til angiogenese og invasion [13] – [16]. Overekspressionen af ​​HIF-1 resultater i konstitutiv aktivering af dets mål-pathways [13] – [18]. HIF-1 er en heterodimer transkriptionsfaktor bestående af to underenheder, HIF-1a, som er oxygen-reguleret, og HIF-1β, som udtrykkes konstitutivt. Adskillige inhibitorer er målrettet mod HIF-1α ekspression eller dets aktiviteter er blevet udviklet til behandling af cancere; imidlertid har ingen af ​​disse forbindelser endnu ikke været vellykket på grund af Forbindelse toksicitet, begrænset aktivitet, eller dårlige farmakologiske egenskaber [18] – [25]. Vi har for nylig udviklet en hidtil ukendt syntetisk arylsulfonamid, betegnet KCN1 (fig. 1A), der oprindeligt blev anset for at målrette HIF-1α pathway. Men i de seneste undersøgelser har KCN1 blevet vist, at udøve sine anti-cancer aktiviteterne under både normoxiske og hypoxiske betingelser i humane gliom cancercellelinier [26] – [31]. Vores efterfølgende mekanistiske undersøgelser har indikeret, at KCN1 har betydelige HIF-1a-uafhængig cytostatiske aktiviteter. Den foreliggende undersøgelse er designet til at bestemme

in vitro

in vivo

anti-cancer aktivitet KCN1 i bugspytkirtelkræft og dets farmakologiske egenskaber.

(A) Kemisk struktur af KCN1. (B) Cell vækstinhiberende aktivitet af KCN1 i humane bugspytkirtelkræftceller. Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af KCN1 i 72 timer, efterfulgt af en MTT-analyse. (C) Cell vækstinhiberende aktivitet af KCN1 i en tidsafhængig måde. Celler blev udsat for KCN1 for forskellige tidspunkter, efterfulgt af en MTT-analyse. (D) Hæmning af forankringsuafhængig vækst ved KCN1 i bugspytkirtelkræftceller. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af KCN1 i blød agar. Kulturerne blev holdt i inkubatoren i to uger, derefter cellekolonier blev observeret og scoret under et mikroskop. (E) Anti-proliferative effekt af KCN1 på humane bugspytkirtelkræftceller. Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af KCN1 i 24 timer, efterfulgt af måling af celleproliferation ved hjælp af BrdUrd assay. Proliferationsindekset blev beregnet over for ubehandlede kontrolceller. (F) Apoptotisk effekt af KCN1 på humane bugspytkirtelkræftceller. Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af KCN1 i 48 timer, efterfulgt af måling af apoptose ved en Annexin V assay. Den apoptotiske indeks blev beregnet over for ubehandlede kontrolceller. Alle assays blev udført tre gange. (

# p 0,05, * p 0,01).

Fordi distribution og disposition af en agent i kroppen er afgørende for at bestemme dets effektivitet og toksicitet, tidlig farmakokinetiske undersøgelser er af stor betydning for udvikling af lægemidler [32], [33]. Sådanne undersøgelser kan give oplysninger om den mest effektive rute og hyppigheden af ​​administration, samt en angivelse af, hvor effektiv agent vil være imod tumorer på forskellige steder i kroppen. De kan også angive brancher af akkumulering og /eller toksicitet [32], [33]. I den foreliggende undersøgelse, vi har forsøgt at karakterisere de farmakologiske egenskaber af KCN1 i præklinisk omgivelser, med hensyn til dens plasma stabilitet, plasmaproteinbinding, biotilgængelighed, og fordeling efter systemisk administration til mus. Disse resultater viser anti-tumor effekt og gunstige farmakologiske egenskaber af denne roman agent, støtte den videre udvikling i retning af klinik forsøg.

Resultater

KCN1 har

in vitro

Anti- cancer aktivitet mod kræft i bugspytkirtlen celler

Hæmning af kræft cellevækst.

in vitro

anti-cancer aktivitet KCN1 blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen. Fire humane pancreas cancer cellelinjer (HPAC, Panc-1, BxPC3, og Mia Paca-2) blev dyrket med forbindelsen ved forskellige koncentrationer fra 0-100 uM i 72 timer, og cellernes levedygtighed blev bestemt. De inhiberende virkninger af forbindelsen på cellevækst blev illustreret i fig. 1B. KCN1 inhiberede cancercellevækst på en dosis-afhængig måde, der tegner sig for 83% (P 0,01), 53% (P 0,01), 81% (P 0,01) og 61% (P 0,01) inhibering ved 100 uM i den HPAC, Panc-1, BxPC3, og Mia Paca-2-celler, hhv. Den Panc-1-cellelinien er kendt for at udtrykke multilægemiddelresistens-associeret protein 1 (MRP1) og er kendt for at vise modstand til adskillige cancer terapeutiske lægemidler. Dette kan være grunden til at de var mere modstandsdygtige over for KCN1 behandling sammenlignet med andre celler. Fig. 1C viste tidsforløbet for vækstinhibering med KCN1 behandling i alle fire cellelinjer, hvilket tyder på det respektive følsomhed for forbindelsen som BxPC3 HPAC Mia Paca-2 Panc-1. Som vist i fig. 1D, HPAC og Panc-1cells blev suspenderet i blød agar og kolonier blev optalt efter 14 dages inkubation af KCN1. KCN1 faldt antallet af dannede kolonier i HPAC og Panc-1-celler ved 4- og 3-gange.

Inhibering af cancercelleproliferation.

Den dosisafhængige virkning KCN1 på celleproliferation blev undersøgt med en BrdUrd inkorporering assay (fig. 1E). De antiproliferative virkninger blev set i alle de fire cellelinier. Ved en koncentration på 50 uM, KCN1 inhiberede proliferation med ca. 80% (P 0,01), 56% (P 0,01), 88% (P 0,01) og 60% (P 0,01) i HPAC, Panc- 1, BxPC3, og Mia Paca-2-celler. BxPC3 celler var mere følsomme over for KCN1 behandling ved den højeste koncentration end de tre andre cellelinjer.

Virkninger på apoptose.

Vi har også examinedwhetherKCN1 havde en effekt på celle apoptose i bugspytkirtelkræftceller (Fig . 1F). Efter en 48 timer behandling, viste KCN1 ubetydelige eller svage apoptotiske virkninger efter eksponering for en 50 uM koncentration af forbindelsen. KCN1 var i stand til at inducere apoptose kun i HPAC celler (apoptotisk indeks: 1,4 gange). Lægemidlet viste ingen detekterbar apoptotisk aktivitet i de andre tre cellelinier. Disse resultater viste, at induktion af apoptose kan ikke være de store anti-cancer mekanismer for KCN1.

Cell cyklus anholdelse i G1 fasen.

I de fire forskellige bugspytkirtelkræft cellelinier, efter 24 timer behandling, KCN1 signifikant induceret standsning af cellecyklus i G1-fasen i en dosisafhængig måde, med første virkninger begynder ved 5 uM i HPAC (P 0,01), BxPC3 (P 0,01), og Mia Paca-2 (P 0,01 celler), og 12,5 uM i Panc-1 (P 5 dage /uge) blev indledt, når tumoren lydstyrke nået ~ 100 mm

3

. Forbindelsen faldt betydeligt væksten af ​​pancreas-xenotransplantattumorer på en dosis-afhængig måde. I Panc-1-xenograft model, tumorvækst inhibering af ca. 46% (P 0,01) blev observeret ved den /kg dosis 30 mg og 61% (P 0,01) på /kg dosis 60 mg på dag 21 (fig . 3A1). Lignende resultater blev observeret i Mia Paca-2 xenograftmodel. Denne model syntes at være næsten ligeså følsomme over for lægemidlet, med den lave dosis (30 mg /kg) og høj dosis (60 mg /kg) aftagende tumorvækst med ca. 43% (P 0,01) og 57% (P 0,01 ) henholdsvis (fig. 3B1). Derudover var der ingen signifikante forskelle i kropsvægt mellem kontrol og dyr behandlet med KCN1 i begge xenograftmodeller (fig. 3A2 og B2), hvilket indikerer ingen indlysende vært toksicitet ved de terapeutiske doser af KCN1.

KCN1 blev administreret af ip injektion til nøgne mus med Panc-1 (A1) eller Mia Paca-2 (B1) xenotransplantattumorer. KCN1 blev administreret ved i.p. injektion i doser på 30 og 60 mg /kg /d, 5 dage /uge i 3 uger for Panc-1 xenograftmodel og 6 uger for Mia Paca-2 xenograftmodel henholdsvis. Kontrolgrupper modtog kun vehikel. Tumorer volumener blev målt hver tredje dag. Dyrene blev også overvåget for ændringer i kropsvægt som et surrogat markør for toksicitet, når det blev administreret til nøgne mus, der bærer (A2) Panc-1 eller (B2) Mia Paca-2 xenotransplantattumorer.

An HPLC metode til KCN-1 Analyse er udviklet og valideret

HPLC-metoden gav en lineær kalibreringskurve i mus plasma for den undersøgte koncentrationsområde 0,1-100 uM. Den gennemsnitlige Korrelationskoefficienten (

r

2) for daglige kalibreringskurver var = 1,000. Kalibreringskurver blev også produceret i homogenater af forskellige musevæv, herunder hjernen, skeletmuskulatur, nyrer, lunger, milt og hjerte, som havde korrelationskoefficienter på mindst 0,992 for de samme koncentrationer. De nøjagtighed, præcision, intradag-og inter-dages variationer var acceptable, med variationskoefficienter (CV) mellem 4,25% og 12,62%, og den nedre detektionsgrænse (LOD) i plasma var 0,085 pM. Genopretningen af ​​forbindelsen i de forskellige matricer varierede fra ~96% til ~107%. Repræsentative kromatogrammer af blank museplasma, kontrol museplasma tilsat 1, 5, 25, og 50 uM KCN1 er vist i fig. 4A-E. Lignende kromatogrammer blev opnået for de andre undersøgte væv (data ikke vist). Specificiteten blev demonstreret ved mangel af endogen indblanding i de biologiske prøver ved retentionstiden for toppene af KCN1.

(A) KCN1 i kontrol (stoffri) mus plasma og mus plasma tilsat til at indeholde 1, 5, 25, og 50 uM KCN1; En blindprøve mus plasmaprøven og museplasma tilsat 1 uM (B), 5 pM (C), 25 pM (D) og 50 pM (E) KCN1.

KCN1 er stabilt i museplasma på Various temperaturer i længere varigheder

KCN1 var stabil i museplasma ved 37 ° C, med mere end 80% af forbindelsen er tilbage efter en 8 timers inkubation til både den lave (1 uM) og høj ( 10 uM) koncentrationer. Vi fandt også, KCN1 kan opbevares ved 4 ° C i mindst 24 timer med mere end 90% af forbindelsen er tilbage (fig. 5A1), eller ved 37 ° C i mindst 8 timer med mere end 85% af forbindelsen resterende (fig. 5A2), eller ved -80 ° C i op til 4 uger med mere end 92% af forbindelsen er tilbage (fig. 5A3).

Stabilitet af KCN1 i museplasma ved 37 ° C ( A1), 4 ° C (A2), og -80 ° C (A3). (B) Nedbrydning af KCN1 af isolerede mus S9 lever fraktioner.

KCN1 Binder til plasmaprotein Ekstensivt

KCN1 bundet i udstrakt grad til proteiner i mus plasma, med lav (1,0 uM) og høj (10,0 uM) koncentrationer demonstrerer 90,96% og 99,32% af forbindelsen binding til plasmaproteiner, hhv.

KCN-1 metaboliseres af S9 Enzymes (fase i)

Fordi KCN1 dukkede skal metaboliseres i udstrakt grad eller nedbrydes i mus plasma, udførte vi en indledende undersøgelse af den potentielle mekanisme (r), hvorved KCN1 metaboliseres ved hjælp af S9-analysen. Denne analyse kan anvendes til at bestemme, om forbindelsen metaboliseres

via

fase I (NADPH-regenererende systemer) eller fase II (UDPGA og PAPS) enzymer udvundet af mus mikrosomer. S9 undersøgelser indikerede, at KCN1 har en forholdsvis lang halveringstid i overværelse af fase II (konjugation) mikrosomale enzymer. Der var imidlertid et fald mere end 60% i mængden af ​​KCN1 observeret, når det blev inkuberet med muse-fase I (oxidation) enzymer (fig. 5B), hvilket antyder, at det sandsynligvis metaboliseres af fase I enzym (er).

KCN1 har en lang halveringstid og Wide Tissue Distribution i mus efter intravenøs og intraperitoneal forvaltninger

Analyse af plasmaprøver indsamlet fra mus doseret med KCN1 (35 mg /kg) viste, at plasmakoncentrationen af ​​den forbindelse var stadig påviselige for begge stammer i mindst 6 timer efter intravenøs (IV) injektion, og var påviselig for endnu 24 timer efter intraperitoneal (IP) administration (fig. 6A og 6B). Efter bolus LV administration, plasmakoncentrationerne var større end 5 ug /ml ved 5 minutter for både CD-1 (9,98 ug /ml) og nøgne mus (5,19 ug /ml). Disse niveauer faldt til 0,3 mg /ml efter 6 timer efter dosering i begge stammer. Efter I.P. dosering, plasmaniveauerne nået deres maksimum ved 30 minutter i CD-1 mus og ved 2 timer i nøgne mus. Samlet, I.V. administration gav højere plasma AUC og C

max værdier, men lavere T

1/2 værdier i forhold til I.P. administrationsvej (tabel 2).

Plasma koncentration-tid kurver for KCN1 følgende (A) IV og (B) IP injektion af 35 mg /kg i CD-1 og nude (nu /nu) mus. Tidsafhængig fordeling af KCN1 i forskellige væv efter (C) IV administration eller (D) IP administration af 35 mg /kg af forbindelsen. Søjlerne repræsenterer nøgne mus, mens pyramiderne repræsenterer cd-1-mus.

Af interesse, kunne påvises KCN1 i de fleste af vævsprøverne (hjerte, lunger, lever, milt, nyrer og skeletmuskel;. figur 6C og 6D) af begge stammer i mindst 24 timer efter indgivelse af enten rute. Imidlertid kunne forbindelsen ikke påvises efter 6 timer i hjernen af ​​enten stamme af mus efter begge administrationsveje. Farmakokinetiske parametre blev beregnet for plasma og de forskellige væv (tabel 2). De højeste AUC værdier i både nøgen og CD-1 mus efter I.V. injektion var i lunger, lever og milt, og vævene med de laveste AUC værdier efter I.V. injektion var plasmaet, hjerne og skeletmuskel. Den høje koncentration observeret i lungerne efter I.V. injektion var sandsynligvis på grund af ophobning af udfældet lægemiddel, selv om dette ikke blev verificeret eksperimentelt. I begge stammer af mus, milten havde den højeste AUC efter i.p. injektion, efterfulgt af leveren. Plasmaet og hjerne havde de laveste AUC-værdierne for begge stammer efter i.p. injektion.

fra 35 mg /kg af KCN1 administreret intravenøst, mindre end 1% af den totale KCN1 dosis blev udvundet som parental KCN1 fra urin fra både CD-1 og nøgne mus i de første 24 timer , med mindre end 0,5% bliver inddrevet fra begge stammer følgende IP indsprøjtning. Ca. 1% af den oprindelige dosis af den parentale forbindelse blev udvundet i fæces fra mus efter i.p. injektion, og mindre end 1% blev genfundet efter I.V. injektion (data ikke vist).

Diskussion

HIF pathway hæmmere udgør en ny målrettet terapeutisk middel. Selvom succes er set ved brug agenter rettet mod enkelte molekyler (fx Herceptin, Gleevec), er disse midler typisk begrænset med hensyn til de typer af kræft, og underklasser i de typer af kræft, der kan behandles. Fordi KCN1 hæmmer en fysiologisk proces (hypoxi), som er fremkommet ved dannelsen af ​​tumorer, snarere end en kræft typespecifikke mål, kan agenten potentielt anvendes til at behandle en række forskellige kræftformer, herunder dem, for hvilke der i øjeblikket ingen effektiv behandlinger, især kræft i bugspytkirtlen.

testforbindelsen KCN1 blev oprindeligt designet som en HIF-1α-inhibitor, men dens hæmmende effekt på celledeling og vækst førte os til at spekulere, om det kan have en effekt under normoxisk tilstand. HIF-1α spiller også en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellecyklussen. Under hypoxiske betingelser, bliver det stabiliseret fører til tumor overlevelse

via

øget angiogenese og anaerob glykolyse. Overraskende HIF-1α også opregulerer gener, der fremmer cellecyklus og apoptose, såsom p21, p27, p53 [34], [35]. I lyset af dette, at fordelene ved HIF-1α inhibering i cancerterapi synes tvivlsom, da det kan fortryde cellecyklusstop under hypoxiske betingelser og forhindre celledød. Disse modstridende virkninger kan begrænse den anti-cancer effekt af HIF-1α hæmmere [34], [35]. Men hvis HIF-1α inhibitorer har den yderligere virkning at inducere cellecyklusstandsning eller celledød, kan de være bedre udsagn som anticancermidler. Således er det bydende nødvendigt samtidig udvikle HIF-1α hæmmere som anti-cancer midler til at evaluere deres virkninger på cellecyklus og celledød.

Den aktuelle undersøgelse er den første til systematisk at undersøge den

in vitro

og

in vivo

anti-tumor effekt af KCN1 i bugspytkirtelkræftceller i en HIF-1α-uafhængig måde. Vi observerede, at KCN1 faldt betydeligt kræft i bugspytkirtlen cellevækst og spredning, og førte til cellecyklus arrest under normoxisk (20% O

2) dyrkningsbetingelser. Efter vurdering af virkningerne af forbindelsen på

in vitro

proliferation, cellecyklusprogression og apoptose, konkluderede vi, at cellecyklusstandsning var den vigtigste mekanisme, hvormed forbindelsen udøver sine cytostatiske virkninger i cellekultur. Cellecyklusstop er en af ​​de mest effektive strategier til inhibering af tumorvækst [36]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at KCN1-medieret cellecyklusstandsning blev opnået

via

en modulering af cyclin kinaseinhibitor (CKI) – cyclin- cyclin-afhængig kinase (CDK) maskiner opererer i G1 fasen af cellecyklus. En familie af protein kinase komplekser orchestrates cellecyklusprogression i eukaryoter [37]. Hvert kompleks er sammensat minimalt af en katalytisk underenhed, CDK, og dets væsentligste aktiverende partner, cyclin. Forskellige kombinationer af cycliner og cdk’er styre cellecyklussen på forskellige punkter [37]. For eksempel er cyclin E udtrykkes transient i G1 /S overgang og bliver hurtigt nedbrudt, når cellen træder ind i S-fase [38]. Cyclin E regulerer Cdk2 mens cyclin D1 regulerer Cdk4 og Cdk6 [38]. Disse komplekser aktiveres ved forskellige checkpoints efter bestemte intervaller under cellecyklussen, men kan også induceres og reguleres af eksogene faktorer [37] – [39]. Cdk’erne underkastes inhibering ved binding af CKI såsom CIP /KIP (p21, p27) og INK4 familier af proteiner [37] – [39]. Transkriptionen af ​​gener, der er nødvendige for G1 /S overgang, såsom cyclin E og cyclin D1 er initieret af E2F1, som er under kontrol af den Rb tumorsuppressor [37] – [39]. I denne undersøgelse undersøgte vi indflydelsen af ​​KCN1 på ekspressionen af ​​adskillige proteiner vides at være involveret i disse processer. I alle fire bugspytkirtelkræft testede cellelinjer, fandt vi faldt udtryk for celle cycleproteins, herunder E2F1, cyclin D1, cyklin E, Cdk2, Cdk4 og Cdk6, og forøget ekspression af p21 og p27. Mens KCN1 induceret cellecyklusstop i bugspytkirtelkræft cellelinjer, det havde ringe cytostatisk virkning på gliom celler og udødeliggjort fibroblaster, hvilket tyder på, at dens virkninger kan være celletype-afhængige [31]. For at bekræfte den terapeutiske virkning af forbindelsen, blev det også undersøgt for

in vivo

effekter. KCN1 faldt væksten i både Panc-1 og Mia Paca-2 xenotransplantattumorer.

Da der ikke er offentliggjorte rapporter om farmakokinetiske, toksicitet eller biotilgængelighed af KCN1, vi foretaget en vurdering af disse farmakologiske egenskaber. Vi udviklede et egnet HPLC-metode til påvisning af KCN1 i forskellige biologiske matricer, og viste, at KCN1 er stabilt i museplasma (fig. 5A1-A3), at det er kraftigt bundet til plasmaproteiner, at det sandsynligvis metaboliseres af fase I enzym (er) (fig. 5B), og at den fordeles til forskellige musevæv efter både IV og LP administration (fig. 6 og tabel 2). Vores indledende farmakologiske undersøgelser afsløret flere interessante karakteristika om KCN1. Først var der omfattende akkumulering af forbindelsen i lungerne hos mus efter I.V. injektion, og i milt og lever fra mus efter i.p. indsprøjtning. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at bestemme de mekanismer for den unikke fordeling mønster af dette stof. Det blev administreret intraperitonealt i en dosis på op til 60 mg /kg dagligt i en cremophor: ethanol formulering til op til 12 uger, og dette regime blev godt tolereret af dyrene. Der var ingen synlige tegn på toksicitet i disse dyr, og deres adfærd og udseende var ikke skelnes fra kontroldyr. Vores foreløbige analyser indikerede, at værdierne af blod cellepopulationer og blodkemi var inden for normale grænser (data ikke vist). Desuden patologisk undersøgelse af de store organer ved obduktion viste ingen ultra-strukturelle ændringer i hjernen, nyrerne, mavetarmkanalen eller lungerne (data ikke vist). Leveren er det eneste organ, hvor en behandlingsrelateret ændring blev observeret. Hævelse blev observeret i lever fra dyr på obduktion, blev vævet ødem med galdegang stasis angivet med patologisk undersøgelse, men uden tegn på hepatocyt død. Den observerede hævelse af leveren blev vendt i musene inden for 2-3 uger efter seponering af behandlingen, og kan er blevet forårsaget af cremophor:. Ethanol formulering, der kan forstyrre med nedsat blodgennemstrømning [40] – [42]

Det andet punkt af interesse er, at der var forskelle i farmakokinetik KCN1 mellem CD-1 og nøgne mus. Mens nogle af disse forskelle kan have været på grund af de normale variationer mellem mus, forskelle i den tid af året (sæson), når studierne blev udført, og forskelle på grund af kilden til mus (Harlan vs. Frederick), nogle af de forskelle mellem stammer af musene var stadig værd at bemærke. For eksempel viste CD-1-mus en meget højere koncentration i lungerne end de nøgne mus, trods modtagelse af den samme dosis. Men i de fleste tilfælde viste en højere optagelse af midlet til de forskellige undersøgte væv (lever, nyrer, milt, hjerte, skeletmuskel og hjerne), den nøgne mus. Der var også forskelle i intraperitoneal biotilgængelighed KCN1, med forbindelsen absorberes meget bedre efter intraperitoneal injektion i nøgne mus sammenlignet med CD-1-mus. Denne øgede biotilgængelighed sandsynligvis var ansvarlig for den højere vævsoptagelse. Hvis der findes lignende resultater i gentagne undersøgelser, vil det være nødvendigt at belyse mekanismen (r) ligger til grund for disse forskelle i optagelsen for at afgøre, om sådanne faktorer kan forventes at påvirke farmakokinetik KCN1 i andre arter, herunder mennesker. Endvidere mens CD-1-mus ofte anvendes til at evaluere farmakokinetikken af ​​hidtil ukendte forbindelser, nøgne mus er de mest almindeligt anvendte musestamme for anti-cancer virkningsundersøgelser. Forskelle i farmakokinetik mellem stammerne kan føre til over- eller undervurdering af effekten eller toksicitet af en forbindelse.

Vi bemærkede også, at KCN1 tilsyneladende undergår enterohepatisk recirkulation. Ikke kun var den stadig forbindelse til stede i mange væv, men i nogle tilfælde var højere efter 24 timer end i 4 eller 6 timer (fx lever og milt). Derudover KCN1 stadig kunne påvises på et lavt niveau i mindst fem dage efter intraperitoneal dosering (data ikke vist). Disse resultater antyder, at det kan være muligt at give KCN1 relativt sjældent, da forbindelsen kan forblive i målvævet i flere dage. Imidlertid vil det være nødvendigt at sikre, at forbindelsen ikke udøver toksiske effekter på leveren, galdeblæren eller andet væv, der udsættes for høj koncentration af forbindelsen i længere perioder.

Ud over ændringer i frekvensområdet dosering for undersøgelser af effekten, ændre formuleringen kan også forbedre aktiviteten af ​​forbindelsen. Selvom forbindelsen var effektivt, når det indgives i.p. i cremophor: ethanol, formuleringen er ikke ideel. Endnu vigtigere, mens KCN1 selv ikke syntes at udøve nogen væsentlig toksicitet, køretøjet førte til leveren hævelse efter flere ugers dosering i kontroldyrene. Således ændrer formuleringen kan nedsætte toksiciteten af ​​forbindelsen, og det er muligt at optimere formuleringen og indgivelsen af ​​forbindelsen også ville øge sin anti-cancer effekter.

Sammenfattende har vi vist, at KCN1 kan øve potente cytotoksicitet og celleproliferation hæmningseffekter retning bugspytkirtelkræftceller, og førte til nedregulering af vigtige onkogene og pro-vækst /pro-spredning proteiner. Vi har præsenteret et gyldigt metode til påvisning og kvantificering KCN1 i forskellige matricer. Vi har også fremlagt indledende farmakokinetiske data om forbindelsen, indikerer, at det er godt fordelt, stabil og detekterbar i forskellige væv i et relativt langt tidsrum. De oplysninger, der genereres i denne undersøgelse vil være nyttigt for den videre udvikling af forbindelsen.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

KCN1 blev syntetiseret og renset som tidligere rapporteret [ ,,,0],29], [43] – [44], og strukturen blev bekræftet ved UV, IR, MS og NMR-spektroskopi. Renheden af ​​forbindelsen blev bestemt til at være større end 99%.

Alle kemikalier og opløsningsmidler anvendt til prøveforberedelse og højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse var af analytisk kvalitet. Methanol (HPLC-kvalitet) blev købt fra Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) og triethylamin blev købt fra Sigma (St. Louis, MO).