PLoS ONE: Evaluering af nye morfometriske Parametre for neoangiogenese i human Tyktarmskræft Brug Konfokal Laser Endomicroscopy (CLE) og målrettet Panendothelial Markers

Abstrakt

Tumoren mikrocirkulationen er karakteriseret ved en unormal vaskulære netværk med forstørrede, snoede og Sækformet fartøjer. Derfor billeddannelse tumorvaskulaturen og bestemme dets morfometriske egenskaber udgør en kritisk mål for at optimere kræftbehandling, der retter sig mod blodkarrene (dvs. angiogenese terapi). Formålet med denne undersøgelse var at evaluere nye vaskulære morfometriske parametre i colorektal cancer, vanskeligt at opnå gennem konventionel immunohistokemi, ved hjælp af konfokale laser endomicroscopy metode. Friske biopsier fra tumor og normalt væv blev opsamlet under koloskopi fra fem patienter med T3 colorectal carcinom uden metastase og blev mærket med fluorescerende mærkede anti-CD31-antistoffer. En række optiske skiver, der spænder over 250 um inde i vævet blev straks opsamlet for hver prøve under anvendelse af et konfokalt laser endomicroscope. Alle målinger blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Middeldiameteren af ​​tumorkar var signifikant større end de normale kar (9,46 ± 0,4 um vs. 7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166). Fartøjet tæthed var også signifikant højere i kræft vs normale vævsprøver (5541,05 ± 262.81 vs. 3755.79 ± 194.96 kar /mm

3, p = 0,0006). Disse resultater blev bekræftet ved immunhistokemi. Derudover tortuosity indekset og længder fartøj var ikke signifikant forskellige (1,05 ± 0,016 og 28.30 ± 3.27 um i normalt væv, vs. 1,07 ± 0,008 og 26.49 ± 3.18 um i tumorvæv, p = 0,5357 og p = 0,7033). Datteren /mor-forholdet (forholdet mellem summen af ​​kvadraterne af datter fartøj radier over pladsen af ​​radius mor fartøj) var 1,15 ± 0,09 i normalt væv, og 1,21 ± 0,08 i tumorvæv (p = 0,6531). Den konfokale laser endomicroscopy er muligt for at måle flere vaskulære parametre fra friske tumor biopsier end konventionel immunhistokemi alene. Forudsat nye kontrastmidler vil være klinisk tilgængelig, fremtid

in vivo

brug af CLE kan føre til identifikation af nye biomarkører baseret på morfometriske karakteristika tumorvaskulatur

Henvisning:. Ciocalteu A, Săftoiu A , Cârţână T, Gruionu LG, Pirici D, Georgescu CC, et al. (2014) Evaluering af nye morfometriske Parametre for neoangiogenese i human Tyktarmskræft Brug Konfokal Laser Endomicroscopy (CLE) og målrettede Panendothelial Markers. PLoS ONE 9 (3): e91084. doi: 10,1371 /journal.pone.0091084

Redaktør: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, Italien

Modtaget: November 13, 2013; Accepteret: 7 februar 2014; Udgivet: 10 marts 2014

Copyright: © 2014 Ciocalteu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet fra to forskningsbevillinger finansieret af National Research Council (CNCS), Rumænien, med titlen “Klinisk og Biomathematical Modellering af Vascular Ændringer efter antiangiogene Terapi i Advanced Colorectal Carcinoma,” kontrakt nummer PN-II-ID-PCE-2011- 3-0664, og “Real-time Evaluering af behandling effekter i Advanced Colorectal Carcinoma,” kontrakt nummer PN-II-CT-ERC-2012-1. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ubalance af pro- og anti-angiogene signalering inden tumorer skaber en unormal vaskulær netværk, der er karakteriseret ved dilaterede, indviklede, og hyperpermeable fartøjer [1], [2]. Derfor tumorvaskularisering og især væksten af ​​nye fartøjer (angiogenese) har tiltrukket øget opmærksomhed i de sidste to årtier til mulige ansøgninger til diagnose, prognose lagdeling og målrettet behandling [1].

Blandt metoder til at vurdere tumor vaskularisering, er bestemmelsen af ​​mikrokardannelse densitet (MVD) fra immunhistokemisk (IHC) prøver almindeligvis anvendes i prækliniske og kliniske undersøgelser. MVD repræsenterer det gennemsnitlige antal fartøjer pr mm

2 i en vævsprøve, men denne foranstaltning alene er utilstrækkelig til at overvåge vaskulære forandringer over en behandlingsperiode [3]. Andre funktionelle og morfologiske parametre såsom blodvolumen, permeabilitet, mikrokardensitet densitet, kardiameter, forgrening mønstre, andre foranstaltninger af fartøjets form og tumor metabolisme kan være forbundet med tumorangiogenese.

Mekanismerne bag de forbedrede antitumorvirkninger af de kombinerede behandlinger kan variere blandt de antiangiogene midler, og er ikke bestemt endeligt. Antiangiogene midler, som forstyrrer vaskulær endotel vækstfaktor pathway er blevet demonstreret at normalisere tumorvaskulatur. Nogle forfattere mener, at de normaliserede vaskulære net er kendetegnet ved nedre kar snoning og nedre kar densitet. [4], [5], [6].

Den kliniske overvågning af virkningerne af antiangiogenisk terapi kræver en imaging modalitet, der registrerer de morfologiske karakteristika tumor fartøjer med høj følsomhed og specificitet. Da endvidere antiangiogen terapi kræver gentagne behandlinger, en ikke-invasiv teknik er meget ønskeligt [7]. Konventionelle billeddiagnostiske metoder såsom computertomografi, magnetisk resonans eller ultralyd ikke giver et detaljeret billede af tumor fartøjer, hvilket resulterer i begrænset brug for

in vivo

kræft evaluering [7]. Ikke-invasiv karakterisering af tumor fartøjer fører til en bedre forståelse af terapi effekter og hjælper med at optimere og tilpasse terapeutiske indgreb. [8].

Konfokal laser endomicroscopy (CLE) tillader

in vivo

mikroskopisk analyse af den gastrointestinale slimhinde og dens microvascularization under endoskopi ved hjælp topisk eller systemisk administrerede kontrastmidler [7], [9 ]. Målretning markører for angiogenese, i association med molekylære CLE undersøgelser (immunoendoscopy), tilføjer funktionel analyse til den morfologiske aspekt af den neoplastiske proces [7]. Således i modsætning til de konventionelle metoder til vaskulær vurdering, CLE giver en enestående mulighed for selektivt forbedre forskellige niveauer af mikrovaskulaturen.

I en tidligere undersøgelse viste vi, at CLE metode er gennemførlig til billeddannelse forskellige aspekter af tumorvaskulaturen fra friske biopsiprøver ligner de aktuelt anerkendte histopatologi teknikker [9]. I denne undersøgelse evaluerede vi nye vaskulære netværksparametre vanskelige at vurdere med konventionel immunohistokemi i patienter med klinisk iscenesat T3 primær colorektal carcinom, uden metastatisk spredning, ved hjælp CLE kombineret med fluorescensmærkede anti-CD31 antistoffer til mærkning af både normale og tumor blodkar .

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af den etiske komité fra University of Medicine og Pharmacy Craiova . Et skriftligt informeret samtykke blev givet til hver patient før studere indrejse.

Patient Kendetegn

De biopsi prøver blev indhentet fra fem patienter rekrutteret på Research Center of Gastroenterology og hepatologi Craiova, Rumænien, før de undergik enhver terapi (tabel S1). Patienterne var tidligere diagnosticeret med primær kolorektal adenocarcinom (G1-G2 histologisk klasse) under rutinemæssige koloskopi procedurer. Patient 1 undergik behandling med bortezomib i kombination med kemoterapi og strålebehandling efterfulgt af kirurgi. Patient 2 havde en historie af kirurgi efterfulgt af kemoterapi for malign neoplasme af rectosigmoid junction fire år før og blev diagnosticeret med lokalt recidiv ved follow-up. Han blev behandlet med kirurgi og adjuvans kemoterapi med 5-fluorouracil (5-FU). Patienter 3 og 5 undergik kirurgisk resektion efterfulgt af kemoterapi, med neoadjuverende stråling til en med rektal carcinom. Patient 4 havde en historie af hjerteklapfejl, kronisk hepatitis C-infektion og lavt antal blodplader og blev oprindeligt behandlet med FUFOL regime, men nægtede yderligere behandling inklusive resektion. På tidspunktet for denne analyse, alle fem patienter var i live ved mere end et år efter den første evaluering.

Immunhistokemi evaluering blev udført på kirurgiske prøver fra fire patienter, mens endoskopiske biopsier indsamlet før indledningen af ​​kemoterapi blev brugt for patienten, der nægtede operationen.

patienterne blev forberedt til koloskopi ved at indtage en almindeligt ordineret oral elektrolyt lavage løsning. Parrede biopsier blev opsamlet under anvendelse af en colonoscope (CFQ160ZL, Olympus, Tokyo, Japan) fra normal mucosa taget ved omtrent 10 cm fra tumoren og fra alle makroskopisk synlige læsion og straks nedsænket i fysiologisk saltvand. De friske biopsi prøver blev inkuberet i mørke med en Alexa-Fluor 488-mærket anti-CD31 (PECAM) antistof (muse-anti-humant IgG1, fortyndet som 1:10 i PBS med 1% BSA, Exbio, Prag, Tjekkiet) i 1 time ved 37 ° C. Inkubationstiden og fortyndingsforhold blev optimeret for at give den højeste dækningsgrad inde i vævet og den stærkeste fluorescens signal for friske biopsiprøver som tidligere beskrevet [9]. Umiddelbart efter inkubering blev biopsiprøver anbragt på objektglas, der skal afbildes med CLE metode.

Konfokal Laser Endomicroscopy

Billeddannelse blev udført ved anvendelse af et dedikeret endomicroscopy-system (Pentax EF-3870 CIFK, Tokyo, Japan), med en excitationsbølgelængde på 488 nm og med en maksimal laser udgangseffekt på ≤1 mW ved overfladen af ​​vævet styres af brugeren under behandlingen for optimal billeddannelse kontrast. Proceduren for CLE blev udført som følger: Den distale spids af endoskopet blev placeret på den respektive mucosale område fra histologi objektglas, efterfulgt af samling af serielle konfokale billeder (7 um tykke, 0,7 um lateral opløsning og synsfeltet på 475 um × 475 um) op til en maksimal dybde på 250 um ved at trykke på en fodkontakt pedal.

CLE billedbehandling og -analyse

placering med den bedste vaskulære dækning i hele dybden af biopsiprøve blev valgt for de morfometriske målinger. For hver patient 80-100 serielle billeder for hver biopsiprøve, tumor vs. normalt væv blev kombineret i billedstakke. Z projektion af hvert billede stak blev opnået ved anvendelse af ImageJ NIH software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, SUA) at analysere hele vaskulære netværk fanget i biopsiprøve (fig. 1 A og B). Alle billeder blev kalibreret og en farve overlay blev brugt til en tydeligere skelnen vaskulaturen. For at tage højde for geografisk heterogenitet inden for hver prøve, to 50 × 475 um rektangulære områder af interesse (ROI’er) centreret i midten af ​​hvert billede i vandret og lodret retning blev markeret på billedet (Figur 1 C og D). Den 50 um bredde ROI blev valgt ved inspektion af alle prøver at tillade flere bifurkationer og hele skibssegmenter i hver prøve. De morfometriske parametre blev målt i hver ROI og derefter beregnes et gennemsnit til opnåelse af en enkelt værdi for hver prøve.

Z projektion af stakken billedet til normal (A) og tumor (B) mikrovaskulaturen, tilsyneladende med mere indviklet forgrenet fartøjer. Længden fartøj blev målt ved hjælp af segmenterede linje værktøj og rapporteres i mikrometer. Den tortuositet indeks blev beregnet som forholdet mellem segmenterede og lige linje længde for både normale (C) og maligne (D) humant colorektalt væv. * Målestokken er 50 um.

Vaskulær parametermålinger

kardiametre, fartøj tæthed, fartøjets længde, snoning indeks og datter /mor-forholdet blev målt for hvert fartøj i ROI. Værdierne for de to ROI per patient blev midlet til opnåelse af en gennemsnitlig værdi per patient. Endelig blev værdierne for hver patient et gennemsnit for alle patienter, og resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse (tabel 1). Fartøjet densitet blev beregnet som det gennemsnitlige antal fartøjer pr ROI divideret med (ROI område multipliceret med en dybde på 250 um i Z-retningen) scannet volumen og derefter normaliseret til en 1 mm

3 volumen.

Brug af ImageJ s lige linje funktion, diameteren af ​​hver vaskulære segment, der helt eller delvist faldt i ROI blev målt mellem to tilstødende forgreningspunkter.

længden fartøj til både normal og kolorektal cancer tumor prøver blev målt ved at spore midtlinjen af ​​hvert fartøj segment hjælp af segmenterede linie værktøjet. Den tortuositet indeks for hvert fartøj segment blev beregnet som forholdet mellem segmenterede og lige linje længder. Datteren /mor-forholdet (DMR) blev beregnet som forholdet mellem summen af ​​kvadraterne af datter fartøj radier over pladsen af ​​radius mor fartøj, overvejer moderen som den største skib på et forgreningspunkt. Denne måling er en indikation af afgang fra en træstruktur topologi i hvilket tilfælde DMR er omkring en.

histopatologisk Assessment

Den histopatologiske vurdering blev udført på kirurgiske prøver (i stedet for friske biopsi prøver, der anvendes til CLE), med en enkelt undtagelse, når en endoskopisk biopsi blev brugt fra en patient, der nægtede kirurgisk indgreb. Prøverne blev fikseret i 4% neutral bufret formalin og bearbejdet til rutinemæssig paraffin indlejring og sektionering som 4 um-tykke snit. (Støtte Information S1).

Fra hver blok, et dias blev farvet med hematoxylin- eosin for patologisk diagnose, og de næste serielle snit blev anvendt til immunhistokemi at visualisere CD31 antigenet. Kort fortalt, efter tilberedning i mikrobølgeovn i citratbuffer (pH = 6), som et antigen hentning metode blev sektionerne afkølet til stuetemperatur og inkuberet i 30 minutter i 1% hydrogenperoxid for at standse endogen peroxidase. For at blokere uspecifikke antigene steder blev prøverne blokeret i 30 minutter i 2% skummetmælk (Bio-Rad, Munchen, Tyskland) og det første antistof blev inkuberet natten over ved 4 ° C (anti-CD31, muse-anti -human, IgG1, klone JC70A, Dako, Glostrup, Danmark, fortyndet som 1:100 i PBS med 1% BSA). Den næste dag blev objektglassene vasket, signalet fra det første antistof blev amplificeret ved anvendelse af en peroxidase-konjugeret polymersystem (EnVision Dako, Redox, Bukarest), og detekteres derefter med 3,3′-diaminobenzidin – DAB (Dako) . Alle vasketrin blev udført i 1 x PBS buffer. Efter en hæmatoxylin farvning blev slides coversliped og evalueres ved hjælp af et Nikon Eclipse 55i mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) koblet til en 5 Mp CCD kamera (Nikon), og et billede-analyse station (Billede ProPlus AMS software, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA).

Fire billeder fra de højeste vaskulære tæthed områder blev fanget under de samme belysning betingelser og med en 40x mål for hver enkelt sag, og arkiveres som ukomprimerede TIFF-billeder. En stylus-design pen blev udnyttet til at tegne konturerne af skibene (som visualiseret ved DAB farvning) i Image ProPlus softwarepakke. Alle disse områder af interesse (ROIs) var pseudo-farvet i sort og måles automatisk som totale vaskulære områder og totale vaskulære numre pr 40x område, hvorefter resultaterne blev normaliseret til 1 mm

2 områder. Alle endelige målinger udnyttet middelværdierne for alle de billeder taget fra hver enkelt sag og histopatologisk profil.

Statistisk analyse

De morfometriske målinger opnået i ImageJ blev eksporteret til dataanalyse i Microsoft Office Excel (Microsoft , Redmond, Washington, USA). Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Alle målte parametre fartøj blev anset for at være afledt af en normal fordeling som før [9], [10], og derfor statistiske forskelle mellem normal og tumorvaskulatur blev beregnet ved anvendelse af t-test, og p-værdier ≤0.05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

Konfokal Laser Endomicroscopy

proceduren for CLE gav en detaljeret observation af tilstødende tumor og normal mucosa sektioner med synligt fluorescerende signal (fig. 1). Både normale og tumor fartøjer synes indviklet samlet, men det var ikke klart af visuel analyse af billederne om der er en signifikant forskel mellem normale og tumor fartøjer eller om tortuosity fastholdes på de enkelte vaskulære fragmenter.

middeldiameteren af ​​fartøjer i tumorprøverne (9,46 ± 0,4 um) var signifikant større end i den normale prøve (7,60 ± 0,3 um, p = 0,0166) (tabel 1). Tilsvarende kardensitet var signifikant højere i colorektal cancer (5541.05 ± 262.81 fartøjer /mm

3) end den normale colorektal mucosa (3755,79 ± 194.96 fartøjer /mm

3, p = 0,0006).

i modsætning til visuel vurdering, at tortuosity indekset og fartøjets længde var ikke statistisk forskellige mellem normal (snoning indeks var 1,05 ± 0,016 og fartøjets længde var 28,30 ± 3,27 um) og tumorvæv (snoning indeks var 1,07 ± 0,008 og fartøjslængde 26.49 ± 3,18 um) (tabel 1). Den gennemsnitlige datter /mor-forholdet var 1,15 ± 0,09 i den normale prøve og 1,21 ± 0,08 i tumor prøver (p = 0,6531). Dataene for hver patient er vist i tabel 2. Selv om en lille stikprøve, er der ingen store variationer mellem patienterne. Som en mulig undtagelse, i patient 2 værdierne for datter /mor-forhold var større end 1 i både tumor og normale prøver og (1,53 og 1,46 henholdsvis), som kan afspejle en særdeles vaskulariseret og heterogen karrene, men i gennemsnit over alle patienter, værdierne var tæt på 1.

Immunhistokemi

for at se, om CLE fartøj signaler blev korreleret med histologiske data, diameter fartøj og det fartøj, tæthed opdaget af CLE var kvalitativt sammenlignet med CD31-farvede fartøjer i en histologisk snit fra den samme patient. Den vaskulære område var 8,19 ± 1,35% i kolorektal cancer, betydeligt højere end i normal slimhinde, 3,17 ± 0,48% (p = 0,0084). Den MVD for kolorektal normal slimhinde og tumorvæv var også signifikant forskellige (185,73 ± 33,21 /mm

2 og 309,28 ± 32,26 /mm

2, p = 0,0280, tabel 3).

Diskussioner og konklusioner

Typisk, i tumor vaskulære undersøgelser mikrovaskulaturen er kun beskrevet fra punkt diameter og densitet fartøj synspunkter, fordi disse funktioner kan måles fra histologiske skiver. Vi har også udført en immunhistokemisk undersøgelse af vores prøver, og opnåede lignende resultater som litteraturen (større MVD og vaskulær område i tumorer vs. normalt væv) [9], [11], [12], [13]. Desuden har vi vurderet flere parametre af vaskularisering fra volumetriske prøver, såsom fartøjets længde, indekset for snoning og datter /mor-forhold, som let kan kvantificeres med CLE grund af sin større indtrængningsdybde ind i vævet (op til 250 um). Til vores viden, dette er den første rapport af datter /mor nøgletal og snoning indeks i kolorektal cancer kar.

Anatomisk, tumor mikrokar er generelt mere dilateret, snoet, og Sækformet med uregelmæssige mønstre af sammenkobling og forgrening [ ,,,0],14]. Overekspressionen af ​​nogle pro-angiogene faktorer, ligesom VEGF, fører til dannelse af en ny vaskulatur, der er strukturelt unormal på makroskopiske og mikroskopiske niveauer, og det er generelt anses, at disse abnormiteter forværres tumoren fortsat udvikler [15]. Derfor mikrokar tæthed stiger gradvist fra lav kvalitet til high-grade neoplasi til kræft [16]. Ligeledes i den foreliggende undersøgelse har vi fundet en signifikant højere kardensitet og diameter tumorkar.

Det meste af litteraturen giver kun en kvalitativ analyse af fartøjets længde og snoning i colorektal cancer. Yuan et al. (1996), forudsat tidligt tegn på, at neutralisering af tumor-celle-afledt VEGF kunne vende nogle af de abnormiteter i tumoren mikrovaskulaturen ligesom vaskulær diameter og snoning [17]. Under hensyntagen til, at en strategi for en heldig behandling med antiangiogene midler er at reducere snoning af de unormale fartøjer [18], er det nødvendigt med en kvantitativ vurdering. Generelt blev vaskulær snoning evalueret fra 2D-billeder [19]. Tidligere forskning defineret forskellige skibstyper snoning afhængigt fartøjets længde og viste, at skibet snoning og længde er variabel i tumorer [20]. I vores konfokale optiske sektioner, de maligne blodkar forekom mere dilateret og mere indviklede forhold til de normale prøver. Interessant nok til trods for den visuelle undersøgelse, opnåede vi ingen statistisk signifikans, når vi beregnet deres indeks af snoning. Dette kunne afspejle, at den snoede udseende kan gives af den mekaniske deformation som hele tumorvæv vokser temmelig enkelte fartøj fragmenter være snørklet. Et nyligt tredimensional kvantificering undersøgelse viste ingen forskelle med hensyn snoning og fartøjets længde mellem kapillærer hos raske og ondartede væv [21], mens kvantitative undersøgelser i tre-dimensionelle tumorer på senere stadier af vækst viste et fald i fartøjets længde [20], [ ,,,0],22], [23].

Der var ikke en signifikant forskel i datteren /mor forholdet mellem normal og tumor forgrening netværk og værdierne er tæt på 1 (1,15 ± 0,09 vs. 1,21 ± 0,08). Denne parameter er afledt af Murray lov til tilslutning store skibe til små fartøjer anvendes i kolorektal cancer angiogenese. Murrays lov, til rådighed for asymmetrisk samt symmetriske forgrening systemer, hedder det, at terningen af ​​radius af en forælder fartøj er lig med summen af ​​de terninger af radier af døtre og henviser til optimering af diameter blodkar og blodvolumen i henhold til de metaboliske krav [24]. En begrænsning ved vores studie er, at retningen af ​​blodstrømmen ikke er kendt, kan derfor ikke specificeres nøjagtig betegnelse af moderskibet. Denne mangel kunne løses med

in vivo

observation af blodgennemstrømningen i tumorer, ved hjælp af klinisk godkendte kontrastmidler.

Nytten af ​​at bruge morfometriske parametre som biomarkører kunne afhænge af den fase af tumor udvikling . Vi beregnede de morfometriske parametre, som måler forskellige aspekter af colorectal tumor mikrovaskulaturen der alene tages hensyn T3 iscenesat, godt til moderat differentieret karcinom (G1-G2 kvalitet), uden metastaser. I 1997 Robert D. Cardiff et al. beregnet indekset for snoning i en undersøgelse baseret på en musebrysttumorvirus modelsystem under anvendelse histologi kombineret med computer-assisteret intravital mikroskopi og mus injiceret med FITC [25]. Han betragtede dette parameter en prognostisk faktor og viste, at det var statistisk signifikant, når korreleret med en højere metastatisk sats. Ligeledes yderligere langfristede undersøgelser af større grupper af patienter er nødvendige for at se, om alle morfometriske parametre viser stærk sammenhæng med kolorektal adenocarcinom sortering og hvis de kunne korrelere med udfaldet og prognose behandling.

Andre metodologi vil kunne anvendes til undersøgelser, der overvåger effekten af ​​anti-angiogenese terapi (f.eks bevacizumab) på vaskulær forgrening, snoning og beholdervolumen i tumorer [8], [26].

Da effekten af ​​kemoterapi afhænger af tilstedeværelsen af ​​en passende tumor blodforsyning at sikre drug delivery, “normalisering” af tumor vaskulære netværk er ønskelig. Således vurdere forskellene mellem fartøjets længde, snoning og forgrenende mønstre med CLE billedbehandling og frisk biopsi farvning kunne være nyttige til identifikation af cathegory af patienter, der med fordel kan neoadjuverende angiogene terapi. . [27]

I øjeblikket er tre-dimensionelle konfokal laser endomicroscopy rekonstruktion er en udfordring [28] – [30]. Brug CD 31 antistoffer fluorescensmærkede med en fluorokrom (Alexa Fluor 488) og CLE til identifikation af fartøjer fra friske biopsiprøver, kunne vi vurderer deres form, forgrening funktioner og tæthed. To store fordele ved denne metode er den kortere behandlingstid (en time vs. flere timer til dage), og ingen artefakter fra væv fiksering og behandling for IHC. Fremtidige lignende undersøgelser kunne omfatte mere specifikke markører for tumor neoangiogenese i forhold til den panendothelial markør anvendes i den nuværende undersøgelse.

En direkte sammenligning af de morfometriske parametre mellem CLE og IHC er vanskelig og begrænset relevans. Man skal sammenligne resultaterne fra en paraffinindstøbt vævssnit anvendes i konventionel IHC for klinisk diagnose, med oplysninger fra 3D-stak fremstillet i et enkelt CLE scanning, der blev analyseret i nærværende undersøgelse. En 2D-skive ikke tillader en nøjagtig måling af fartøjets længde, snoning eller mor /datter-forhold. En anden vanskelighed er, at CD31-antistof og vævet forarbejdningstrin (friske versus faste og paraffinindlejret) er forskellige mellem de to farvningsteknikker, og vil sandsynligvis generere forskellige værdier for den samme parameter skyldes forskelle forarbejdningsteknikker.

sammenfattende i den aktuelle manuskript vi vist, at konfokale laser endomicroscopy er muligt for at måle flere vaskulære parametre fra friske tumor biopsier end konventionel immunhistokemi alene. Desuden har vi præsenteret en ramme, der fanger nogle af de væsentlige træk ved kolorektal cancer microvascularization, ved hjælp af en reproducerbar non-invasiv teknik og målrettet panendothelial markører på friske biopsier. Verifikation bør ske i fremtidige eksperimenter ved hjælp konfokal laser endomicroscopy

in vivo

ved at manipulere tumor morfologi gennem variationer i tumorvaskularisering. Forudsat nye kontrastmidler vil være klinisk tilgængelig, fremtid

in vivo

brug af CLE kan føre til identifikation af nye biomarkører baseret på morfometriske karakteristika tumorvaskulaturen.

Resultatet er nyttig til yderligere forståelse af kolorektal kræft udvikling og kriterier patient udvælgelseskriterier. Som defineret af Ehling J et al (2013), ikke-invasiv karakterisering af tumor fartøjer fører til en bedre forståelse af terapi effekter, hjælper med at optimere og tilpasse terapeutiske indgreb [8]. Resultaterne udvide vores tidligere feasibility resultater til vurdering af nye vaskulære parametre, som er vigtige i forvaltningen af ​​kræft, men som er vanskelige at måle fra immunhistokemiske sektioner (den kar /mm

3, skibet længde, indekset for snoning og moderen /datter-forhold). Vi har vist metodens reproducerbarhed ved at sammenligne de to fælles anvendte parametre (fartøj diameter, kardensitet) til den traditionelle immunhistokemi. Brug CLE imaging teknik til at analysere 3D mikrovaskulære arkitektur af tumorer er velegnet til både kvantitative og kvalitative angiogenese målinger in vivo og kombineret med målrettede antistoffer.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Patient karakteristika og immunhistokemi resultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091084.s001

(DOC)