PLoS ONE:. Metabolic fænotyper i pancreas Cancer

Abstrakt

Introduktion

Formålet med denne undersøgelse var at profilere glukose-afhængige og glutamin- afhængig metabolisme i bugspytkirtelkræft

Metoder

Vi udførte immunhistokemisk farvning af GLUT1, Caïx, BNIP3, P62, LC3, GLUD1, og GOT1. Baseret på ekspressionen af ​​stofskifte-relaterede proteiner, blev de metaboliske fænotyper af tumorer klassificeres i to kategorier, herunder glucose- og glutamin-afhængige metabolisme. Der var Warburg type, omvendt Warburg type, blandet type, og null typen i glukose-afhængig stofskifte, og kanonisk type, ikke-kanonisk form, blandet type, null skriv glutamin-afhængige stofskifte.

Resultater

Længere samlede overlevelse var forbundet med høj ekspression af BNIP3 i tumor (p = 0,010). Kortere samlet overlevelse blev forbundet med høj ekspression af GLUT1 i tumor (P = 0,002) og GOT1 i tumor (p = 0,030). Warburg type glucose-afhængig metabolisme havde en højeste procentdel af tumorer med nerve infiltration (P = 0,0003), UICC stadium (P = 0,0004), og aktiveret autophagic status i tumor (P = 0,0167). Blandet type af glucose-afhængig metabolisme omfattede den største procentdel af tumorer med positiv marginal status (P 0,0001), lymfatisk invasion (P 0,0001), og aktiveret autophagic status i stroma (P = 0,0002). Blandet type og Warburg typen havde en signifikant sammenhæng med kortere samlet overlevelse (P = 0,018). Ikke-kanonisk type og blandet type glutamin-afhængige metabolisme omfattede den højeste procentdel af tumorer med vaskulær invasion (p = 0,0073), højeste procentdel af aktiveret autofagi i tumorer (P = 0,0034). Desuden blev disse to typer af glutamin-afhængige metabolisme signifikant associeret med kortere samlet overlevelse (P 0,001). Yderligere analyse antydede, at de fleste af tumorerne var afhængig af både glucose- og glutamin-afhængige metabolisme. Efter afvejning tumorer i forhold til antallet af stofskiftet, fandt vi, at det stigende antal stofskifte undertyper omvendt forbundet med overlevelse resultat.

Konklusion

Warburg typen, ikke-kanoniske type og blandede typer af glucose- og glutamin-afhængige metabolisme består af mere metabolisk aktive, biologisk aggressive og fattige prognostiske tumorer. Desuden er de stigende undertyper og kategorier af stofskiftet i hver tumor signifikant associeret med dårlig prognose

Henvisning:. Yu M, Zhou Q, Zhou Y, Fu Z, Tan L, Ye X, et al. (2015) Metabolisk fænotyper i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 10 (2): e0115153. doi: 10,1371 /journal.pone.0115153

Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Februar 6, 2014 Accepteret: November 18, 2014; Publiceret: 26 feb 2015

Copyright: © 2015 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China (nr. 81.000.917 og nr. 81.370.059). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Afvigende stofskifte er nu betragtes som et af kendetegnene for kræft [1]. Især tumorceller udviser høje niveauer af glycolyse selv under tilstrækkeligt udbud oxygen, en bemærkelsesværdig fænomen betegnes Warburg virkning. Det pionerarbejde Otto Warburg er blevet støttet af rapporter i forskellige tumortyper, og er nu udnyttet i klinikken til diagnostiske formål. Men denne opfattelse udfordret af nye beviser. I sin teori, Warburg formodes at cancerceller en tendens til at generere ATP gennem glycolyse stedet for oxidativ phorsphorylation efter mitokondriel dysfunktion [2]. Ikke desto mindre, montering beviser viste, at primære defekter i mitokondrie enzymer eller komplekser i oxidativ phorsphorylation ikke blev ofte observeret i kræft [3]. Det forholdsvis lave antal metaboliske hæmmere blev introduceret i kræftbehandlingen, og kun få af dem har indtastet klinisk udvikling [4], hvilket til dels afspejlede heterogenitet og kompleksitet i tumor stofskifte. Desuden undersøgelse foretaget af Zu og hans kollega viste, at mængden af ​​ATP afledt af glykolyse ikke overstiger 50-60% af den samlede ATP-produktion [5,6]. Et nyt paradigme navnet “revers Warburg-effekten”, hvor aerob glycolyse fandt sted i cancerassocierede fibroblaster, snarere end tumorceller, også opstået i brystcancer [7,8]. Nylige data viste, at bugspytkirtelkræftceller anvender glutamin på en usædvanlig måde, som er afhængig af glutaminsyre-oxaloeddikesyretransaminase snarere end glutamat dehydrogenase [9]. Disse resultater lagt stor vægt på en betydelig heterogenitet i kræft stofskiftet tyder på, at hver kræft har sine egne metaboliske funktioner, som skal tages i betragtning, inden du udforsker nye mål i kræft stofskifte.

Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag af kræft-relaterede dødsfald i USA og Europa. Det er stadig en af ​​de mest genstridige og dødelig sygdom på grund af sin sene fase, hvor diagnosen, invasiv fænotype, modstandsdygtig over for nuværende behandlinger [10,11]. Målretning af kræft stofskifte er en lovende strategi for at forbedre bugspytkirtelkræft behandling. For at bane vejen for udvikling af metabolisme terapeutiske behandlinger, der er nødvendige for at blive belyst stofskifte fænotyper i pancreascancer. Til vores bedste viden, er der ingen studier, der undersøger de metaboliske fænotyper i bugspytkirtelkræft. Derfor blev formålet med vores nuværende undersøgelse udført for at profilere glukose-afhængige og glutamin-afhængige metabolisme, mitokondrie, og autophagic status i bugspytkirtelkræft.

Materialer og metoder

Patienternes valg

prøver af 106 bugspytkirtelkræft væv blev afledt fra patienter, der gennemgår radikale operationer i en retrospektiv undersøgelse kohorte mellem Jan. 2000 og Dec. 2012 på Sun Yat-sen Memorial Hospital i Sun Yat-sen Universitet og en prospektiv kohorte fra juni 0,2012 til maj 2013 (registreringsnummer: ChiCTR-TRC-12.002.548). Denne undersøgelse overholdt Helsinki-erklæringen og blev godkendt af Institutional etiske komité af Sun Yat-sen Memorial Hospital. Alle patienter underskrevet samtykkeerklæringer angiver deres vilje til at deltage og deres forståelse af proceduren og generelle formål med undersøgelsen. Alle de inkluderede patologiske og histologiske bekræftede patienter med kræft i bugspytkirtlen mødte følgende kriterier: ingen historie ethvert andet ondartet svulst, uden neoadjuverende terapi før operationen. Ingen af ​​dem døde under perioperative periode på grund af postoperative komplikationer. Alle patienter samtykke blev opnået før indsamling af prøver, og alle procedurer undersøgelse blev godkendt af Etik Udvalg Sun Yat-sen Memorial Hospital i Sun Yat-sen University. Dataposter blev udvundet gennem journal-system som følgende: alder, køn, status af glukosemetabolismen, tumorstørrelse, tumor placering, histologisk klasse, marginal status, nerve infiltration, vaskulær invasion, UICC Stage (Tumor patologisk stadium blev klassificeret i henhold til EU for International Cancer Kontrol (UICC)), og lymfe invasion. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tidsperioden fra datoen for driften til døden eller den sidste opfølgning i maj 2013.

Immunhistokemi

immunhistokemisk analyse blev udført som følger: Væv prøver blev fikseret i neutral-bufferet formalin og derefter indlejret med paraffin. Endogen peroxidase blev standset med 3% hydrogenperoxid i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter vasket i PBS og inkuberet i 30 min ved 37 ° C med trypsin buffer. Efter tilstrækkelig vask i PBS, blev antigen-genvinding af 5-um tykke snit af 106 bugspytkirtelkræft væv udført i citratbuffer (pH 6,0). Når objektglassene blev nedkølet til stuetemperatur, uspecifik proteinbinding blev blokeret i 60 min ved normalt gedeserum ved stuetemperatur. Efterfølgende blev primært antistof (anført i tabel 1 i S2 fil) til immunhistokemi påført natten over ved 4 ° C. Dernæst blev Elivision Super DAB kit anvendes som Fabrik instruktioner. Det primære antistof inkubering blev udeladt som negative kontroller. Positive kontroller blev valgt som foreslået i antistof instrukser eller tidligere data [12,13]: glukose transportør 1 (GLUT1): esophageal carcinoma; kulsyreanhydrase IX (Caïx): renal carcinoma; BCL2 /adenovirus E1B 19-kDa interagerende protein 3 (BNIP3), nyre væv; Beclin-1: brystvæv; mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (MAPLC3): nervevæv i hver prøver; P62: miltvæv; glutaminsyre-oxaloeddikesyretransaminase (GOT1): nyrevæv; glutamat dehydrogenase 1 (GLUD1): hjerte væv (Figur A i S1 File). Systemet Immunreaktivitet-scorer (IRS) blev anvendt til semikvantitativ analyse. Kort fortalt blev IRS score for hver prøve opnået ved to uafhængige patologer og middelværdien af ​​de scores var det endelige resultat, vi bruges til yderligere analyse. Eventuelle uoverensstemmelser mellem patologer data blev løst ved diskussion med en tredje patolog, indtil konsistensen blev nået. Scores for ekspression af metabolisme-relateret protein blev evalueret i henhold til intensitet og proportioner. Intensiteten score blev bestemt som 0 (ingen farvning), 1 (svagere farvning end positiv kontrol), 2 (lig farvning som positiv kontrol), og 3 (stærkere farvning end positiv kontrol). Andelen score blev bestemt som 0 (negativ), 1 ( 30% af tumorcellerne) og 2 (≧ 30% af tumorcellerne). Intensiteten score og andelen score blev ganget sammen til en samlet score. Samlede score blev kategoriseret som følger: 0-1 (negativ) og 2-6 (positiv)

Klassificering af tumor metaboliske fænotyper

Vi klassificeret sagerne i fænotyper efter den immunhistokemisk farvning for. disse stofskifte-relaterede proteiner som tidligere rapport [12,13]: glycosis typer: GLUT1- og /eller Caïx-positive; nonglycolysis seværdighed: GLUT1- og Caïx-negative; dysfunktionel mitokondrie seværdighed: BNIP3-positive; funktionel mitokondrie seværdighed: BNIP3-negative; aktiverede autophagy typer: to eller flere autophagic markører fra Beclin1, LC3, P62; inaktiveret autophagy seværdighed: positive for mindre end to autophagic markører fra Beclin1, LC3, P62; kanonisk glutamin stofskifte seværdighed: GLUD1-positive og GOT1 positiv; ikke-kanonisk glutamin stofskifte seværdighed: GLUD1-negative og GOT1 positiv. Metabolisme i bugspytkirtelkræft blev opdelt i to hovedkategorier: glucose-afhængige stofskifte og glutamin-afhængige stofskifte [9,14]. Glucose-afhængig metabolisme fænotype af individuel kræft i bugspytkirtlen eksemplar er klassificeret som følger i henhold til tidligere rapporter [12,13]: Warburg seværdighed: tumor (glykolysen type), stroma (ikke-glykolysen type, oxidativ phosphorylering); reverse Warburg seværdighed: tumor (ikke-glycolyse type, oxidativ phosphorylering), stroma (glycolyse type); blandet type: tumor (glykolysen type), stroma (glykolyse); og null typen: tumor (ikke-glycolyse type, oxidativ phosphorylering), stroma (ikke-glycolyse type, oxidativ phosphorylering). Glutamin-afhængige metabolisme fænotypen af ​​individuelle pancreascancer prøve er klassificeret som følger: kanonisk type (GLUD1-positive og GOT1-negative), ikke-kanonisk type (GOT1-positive og GLUD1-negative), blandet type (GLUD1-positive og GOT1- positive), null type (GLUD1-negative og GOT1-negative) af glutamin stofskifte.

kvantitativ real-time Reverse Transcription-PCR-analyse

Vi vurderede mRNA ekspressionen af ​​målet gener med QRT -PCR. Totalt RNA blev isoleret fra væv og cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen), og koncentrationerne blev målt med et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies). Den første streng af cDNA blev syntetiseret med PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara). QRT-PCR blev anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger. QRT-PCR blev derefter udført ved 95 ° C i 10 minutter, ved 95 ° C i 15 sekunder, og ved 60 ° C i 15 sekunder, med i alt 40 cykler. Hver reaktion blev udført tredobbelt, og alle de anvendte primere var optaget i supplerende data. Primere blev designet baseret på sekvensen af ​​hvert gen under anvendelse Premier 5.0. MRNA-niveauerne blev normaliseret til beta-actin-mRNA ifølge den følgende formel: [2 – (C

T

Target – C

T

Actin)] x 100%, hvor C

T er den tærskel cyklus.

statistiske analyser

data blev analyseret ved hjælp af SPSS til Windows-version 16,0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kategoriske variabler blev sammenlignet under anvendelse af Fishers eksakte test. De median overlevelse blev vurderet af Kaplan Meier overlevelseskurver, og forskellene blev yderligere analyseret med log-rank test. Når p-værdien var mindre end 0,05, blev signifikans antaget medmindre markeret. Når P-værdi var mindre end 0,1 i univariat analyse og disse variable blev yderligere analyseret i multivariat analyse gennem Cox proportionel farer modeller.

Resultater

klinisk-patologisk karakteristika af inkluderede patienter

nuværende kohorte bestod af 106 patienter, herunder 57 mænd og 49 kvinder. Gennemsnitsalderen ved operation var 60,42 år, med en gennemsnitsalder på 61.00 år og et område fra 31 år til 77 år. På tidspunktet for sidste klinisk opfølgning (maj 2013), 29 (27,4%) af patienterne var i live. Den mediane samlede overlevelse af de 106 patienter var 21,9 måneder, med 1-, 3- og 5-års overlevelse satser på 56,8%, 13,2%, og 6,2%, henholdsvis. Størstedelen af ​​patienterne (80,2%) havde tumorer placeret i spidsen for bugspytkirtlen, og størrelser af de fleste tumorer (80.2%) var mere end 20 mm i største diameter. De fleste tumorer blev moderat differentieret (37,7%), efterfulgt af godt differentieret (35,9%), og dårligt differentierede (26,4%). Tyve-tre (21,7%) patienter fik en positiv margen. Nerve infiltration blev præsenteret i 84 patienter (79.2%), vaskulær invasion i 82 (77,4%) patienter, og lymfe invasion i 68 (64,2%) patienter. De fleste patienter (73,6%) præsenteret med Union for International Cancer Control (UICC) fase IIB sygdom, og de resterende (26,4%) patienter præsenteret med UICC stadium IA, IB og IIA sygdom. Ingen patienter præsenteret med UICC stadium III og IV sygdom.

Sammenhæng mellem ekspression af stofskifte-relaterede proteiner og klinisk-patologiske parametre

Sammenhængen mellem stofskifte-relaterede proteiner og klinisk-patologiske parametre blev opsummeret i tabel 1 tabel 4. Vi fandt, at forøget tumor ekspression af GLUT1 var forbundet med nerve infiltration (P = 0,0180), lymfatisk invasion (P 0,0001), UICC stadium (P = 0,0044), hvorimod stromal ekspression af GLUT1 var forbundet med tumor dedifferentiering ( P = 0,0155), positiv marginal status (P = 0,0063), nerve infiltration (P = 0,0005), lymfatisk invasion (P = 0,0065) og UICC etape (P = 0,0010) (tabel 1). Tumor ekspression af GLUD1 var forbundet med større tumorstørrelse (P = 0,0086). Tumor ekspression af GOT1 blev signifikant forbundet med tumor differentiering (P = 0,0238), vaskulær invasion (P = 0,0384), lymfatisk invasion (P = 0,0367). Der var en signifikant sammenhæng mellem stromale ekspression af GOT1 og nerve infiltration (P = 0,0087) (tabel 2). Tumor ekspression af BNIP3 var forbundet med tumor dedifferentiation (P = 0,0155), hvorimod stromal ekspression af BNIP3 var forbundet med positiv marginal status (P = 0,0010) (tabel 3). Cytoplasmatisk P62-ekspression i tumoren var forbundet med positiv marginal status (P = 0,0132), mens nuklear P62 ekspression i stroma var forbundet med større tumorstørrelse (P = 0,0173) (tabel 3). Tumor ekspression af LC3 var forbundet med nedsat glucosemetabolisme (P = 0,0205), større tumorstørrelse (P = 0,0453), tumor dedifferentiation (P = 0,0040), vaskulær invasion (P = 0,0044), lymfatisk invasion (P = 0,0385), mens stromal ekspression af LC3 er forbundet med tumor dedifferentiation (P 0,0001), positiv marginal status (P = 0,0010), negativ vaskulær invasion (P = 0,0015) (tabel 4). Der var en signifikant sammenhæng mellem cytoplasmisk ekspression af Beclin-1 i tumor og lymfe invasion (P = 0,0175), hvorimod nuklear Beclin-1-ekspression i stroma var forbundet med positiv marginal status (P = 0,0379) (tabel 4).

Vejviser

Sammenhæng mellem tumor metaboliske fænotyper og klinisk-patologiske parametre, mitokondriefunktionen og autophagic status

Klassifikation af tumor metaboliske fænotyper blev opsummeret i henhold til tidligere rapporter (tabel 2 i S2 File) og repræsentative immunohistokemiske profiler mærkning blev vist i fig. 1 [13,14]. Warburg typen refererer til en fænotype, hvor kun tumorceller udviser øget glykolyse og glycolyse foregår i stroma ikke tumor i omvendt Warburg type. Både tumorceller og stromale celler er glykolytisk i blandet type og nonglycolytic i null type. Korrelationerne mellem de metaboliske fænotyper af bugspytkirtelkræft og klinisk-patologiske parametre blev opsummeret i tabel 5. De samlede 106 tumorprøver blev inddelt i følgende fire typer efter deres glycolyse-relaterede proteiner udtryk: Warburg type (n = 46, 43,4%), revers Warburg type (n = 15, 14,2%), blandet type (n = 16, 15,1%), null type (n = 29, 27,3%). Warburg type glucose-afhængig metabolisme havde en højeste procentdel af tumorer med nerve infiltration (P = 0,0003), UICC stadium (P = 0,0004). Blandet type af glucose-afhængig metabolisme omfattede den største procentdel af tumorer placeret i kroppen /hale (P = 0,0041), med positiv marginal status (P 0,0001), og med lymfatisk invasion (P 0,0001). Reverse Warburg typen havde en højeste procentdel af tumorer placeret i hovedet (P = 0,0041), med fravær af nerve infiltration (P = 0,0003). Null type glukose-afhængig metabolisme består højeste procentdel af tumorer med negativ marginal status (P 0,0001) og fravær af lymfatisk invasion (P 0,0001). |

De samlede 106 tumor prøver var ligeledes opdelt i fire undertyper af glutamin-afhængige metabolisme, herunder kanonisk type (n = 18, 17,0%), ikke-kanonisk type (n = 74, 69,8%), blandet type (n = 5, 4,7%) og nul type ( n = 9, 8,5%) (tabel 5). Den kanoniske form refererer til en fænotype, hvor tumorer er afhængige af glutamat dehydrogenase (GLUD1) for glutamin udnyttelse; mens ikke-kanonisk form refererer til en fænotype, hvor tumoren er afhængige af aspartattransaminase (GOT1) for glutamin udnyttelse [9,15]. Den blandede type glutamin-afhængige stofskifte refererer til en fænotype, hvor tumorer metabolisere glutamin gennem GLUD1 og GOT1, og null typen refererer til en fænotype, hvor tumorer metabolisere glutamin ved hverken GLUD1 eller GOT1. Canonical typen havde en højeste procentdel af tumorer med negativ marginal status (P 0,0001), mens blandet type glutamin-afhængige metabolisme omfattede den højeste procentdel af tumorer med positiv marginal status (P 0,0001), vaskulær invasion (p = 0,0073). En signifikant sammenhæng blev fundet mellem nul type glutamin-afhængige metabolisme og tumorer med større størrelse ( 2.0cm) (p = 0,0163). Desuden tumorer i ikke-kanonisk type og blandet type havde en signifikant aktiveret autophagic status i tumor (P = 0,0034), og ikke-kanonisk form omfattede den højeste procentdel af stroma med funktionelle mitokondrie status (P = 0,0046) (tabel 6).

Virkningen af ​​klinisk-patologiske parametre og stofskifte-relaterede proteiner på patientens prognose

univariat analyse blev udført for at undersøge forholdet mellem de klinisk-patologiske parametre /stofskifte-relaterede proteiner og overordnede overlevelse (tabel 7 og figur B i S1 File). Højere histologisk bedømmelse (P = 0,041) var signifikant associeret med kortere samlet overlevelse. Længere samlet overlevelse blev forbundet med høj ekspression af BNIP3 i tumor (p = 0,010). Kortere samlet overlevelse blev forbundet med høj ekspression af GLUT1 i tumor (P = 0,002), GOT1 i tumor (p = 0,030), og LC3 i tumor (p = 0,009). Der var borderline signifikante forskelle i nerve infiltration med hensyn til generel overlevelse (P = 0,075).

Virkningen af ​​stofskiftet fænotyper på patientens prognose

Resultatet af univariat analyse ved hjælp af log-rank tests af metabolisme fænotyper i forhold til den samlede overlevelse er vist i tabel 8. Glucose-afhængig stofskifte status var signifikant associeret med samlede overlevelse (P = 0,018) (fig. 2A). Derefter udførte vi parvise sammenligning blandt glucose-afhængige stofskifte undertyper, og fandt, at Warburg type og blandet type glukose-afhængig metabolisme signifikant var forbundet med kortere samlet overlevelse (Warburg typen vs. omvendt Warburg type, P = 0,0340; Warburg typen vs. null type, P = 0,0480; Blandet form vs. omvendt Warburg type, P = 0,0060; Blandet form vs. null type, P = 0,0350). Der var ingen forskel mellem andre par (Warburg typen vs. Blandet type, P = 0,4880; Reverse Warburg typen vs. null type, P = 0,648) (tabel 3 i S2 File). Vi fandt også, at glutamin-afhængig stofskifte status var signifikant associeret med samlede overlevelse (P 0,001) (figur 2B og tabel 8.). Efter parvis test blev udført, fandt vi, at kanoniske form var signifikant associeret med længere samlet overlevelse (Canonical form vs. ikke-kanonisk type, p = 0,009; Canonical form vs. Blandet type, P 0,001). Ikke-kanonisk form var signifikant associeret med længere samlet overlevelse end blandet type (P 0,001), men kortere end nul type (P = 0,028), og den kanoniske type (P = 0,0009). Den blandede type glutamin-afhængige stofskifte var signifikant associeret med kortere samlet overlevelse end nul type (P 0,001). Der var ingen forskel mellem kanonisk type og null type (P = 0,453) (tabel 4 i S2 File) (fig. 3).

Vi antog, at blandede typer består af to hovedtyper inden glucose- og glutamin- afhængig metabolisme (dvs. Warburg effekt og Reverse Warburg effekten, canonical type og ikke-kanonisk type), og null typer blev ikke består af nogen af ​​de to hovedtyper i glucose- og glutamin-afhængige metabolisme (dvs. hverken Warburg effekt eller Reverse Warburg effekt, hverken canonical typen eller ikke-kanonisk type.

En solid linje med pil betyder metaboliske kategorier eller undertyper har den højeste procentdel af de specifikke tilknyttede parametre.

for at kunne sammenligne de to kategorier af stofskiftet i parallel, vi klassificeret tumorer i følgende grupper i henhold til de to kategorier af stofskiftet: glucose-afhængige type (tumorer kun stole på glucose-afhængige metabolisme og har ingen tegn på glutamin-afhængige stofskifte), glutamin-afhængige typen (tumorer kun stole på glutamin-afhængige metabolisme og viser ingen tegn på glukose-afhængig metabolisme), blandet type (tumorer stole på både glucose- og glutamin-afhængige metabolisme), og null type (tumorer viser ingen tegn på glucose- eller glutamin-afhængige metabolisme) (tabel 8). De fleste (n = 71, 67,0%) af de inkluderede tumorer i nærværende studie var blandet type, efterfulgt af glutamin-afhængige metabolisme (n = 26, 24,5%), glucose-afhængig metabolisme (n = 6, 5,7%), og null skrive (n = 3, 2,8%). Det foreslået, at de fleste tumorer udnyttes både glucose- og glutamin-afhængige metabolisme at overleve under mangel på næringsstoffer og ilt. Så vi gennemførte Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og fandt, at kategorier af stofskiftet markant var forbundet med samlet overlevelse af patienter (P = 0,021) (fig. 2C). Men efter parvise test blev udført, kun null typen signifikant forbundet med længere samlet overlevelse end glutamin- og glukose-afhængig stofskifte. Især var der ingen signifikant forskel i overlevelse mellem glucose-afhængig metabolisme og glutamin-afhængige metabolisme (P = 0,279). Bør dog overvejes nøje til disse resultater på grund af manglende data i null type og glukose-afhængig type (tabel 5 i S2 File). Vi antager, at tumoren med blandet type eller Warburg type glukose-afhængig stofskifte er meget glykolytisk, og tumorer med ikke-kanonisk type og blandet type glutamin-afhængige stofskifte er meget glutaminolytic. Vi fandt, at stærkt glycolytiske tumorer var også mere afhængige af glutamin-afhængige metabolisme og omvendt (P 0,0001).

Dernæst fremsatte vi den hypotese, at blandede typer blev sammensat af to undertyper i glucose- og glutamin-afhængige metabolisme (dvs. Warburg type og Reverse Warburg type, canonical type og ikke-kanonisk type), og null typer blev ikke består af nogen af ​​de to hovedtyper i glucose- og glutamin-afhængige metabolisme (dvs. hverken Warburg typen eller Reverse Warburg typen hverken canonical typen eller ikke-kanonisk type). Derfor baseret på de typer af glucose-afhængige og glutamin-afhængige metabolisme, vi klassificeret patienterne i 4 grupper: nul type (n = 3, 2,8%), en type (n = 31, 29,2%), to typer (n = 53, 50,0%), tre typer (n = 18, 17,0%), fire typer (n = 1, 0,9%) (tabel 8). Som angivet i Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, den samlede overlevelse af en-typen var væsentligt længere end to-typen (P = 0,039) og tre-typen (P = 0,005) (fig. 2D). Desuden to-typen gruppe udviser en forholdsvis længere samlet overlevelse end tre-typen (P = 0,024). Statistisk analyse sammenligner nul type eller fire type og andre typer blev også udført, men resultaterne skulle tages omhyggeligt hensyn grund af lille antal patienter. For at opsummere, det stigende antal af stofskiftet typer robust afspejlede store forskelle i overlevelse udfald (tabel 8 og tabel 6 i S2-fil).

Multivariate analyser af forholdet mellem prognostiske faktorer og patientens overlevelse

Endelig blev multivariat analyse også udføres, når P-værdi i univariat analyse var mindre end 0,1. Prognostiske faktorer, herunder tumor differentiering, nerve infiltration, udtryk for GLUT1 i tumor, GOT1 i tumor, udtryk for LC3 i tumor, ekspressionen af ​​BNIP3 i tumor, glucose-afhængige metabolisme, glutamin-afhængige metabolisme, kategorier af stofskiftet og antal metabolisme typer i tumor blev analyseret i Multivariate modeller ved hjælp Cox proportionel risiko analyse. Resultaterne viste, at uafhængige faktorer for samlet overlevelse var højere histologisk bedømmelse (hazard ration 1,734, P = 0,015), GLUT1 i tumor (hazard ration 1,781, P = 0,003), GOT1 i tumor (hazard ration 1,982, P = 0,001), LC3 i tumor (hazard ration 3,321, P = 0,001), glutamin-afhængig metabolisme (hazard ration 1,471, P = 0,041), glucose-afhængig metabolisme (hazard ration 1,689, P = 0,022), antal stofskifte type (hazard ratio 1,806, P – = 0,031). Men udtryk for BNIP3 i tumor var signifikant associeret med bedre prognose (hazard ration 0,049, P = 0,008) (tabel 9).

Transcript niveau af stofskifte-relaterede gener i tumor efter tumor fænotype

for yderligere at bekræfte resultaterne fra IHC ovenfor, QRT-PCR blev udført for at undersøge ekspression af stofskifte-relaterede gener (tabel 7 i S2 File) i tumor ifølge tumoren fænotype. Udtrykket for SLC2A1 (gen af ​​GLUT1), BNIP3, BECN1 (gen af ​​Beclin1) og MAP1LC3A (gen af ​​LC3) var højere i Warburg typer, mens ekspressionen af ​​GLUT1, Caïx, BNIP3, BECN1, MAP1LC3A og SQSTM1 (gen af ​​P62 ) var højere i blandet form for glukose-afhængig metabolisme end i kontrollerne. Udtrykket af GLUD1 var højere i kanonisk type end kontrol, og udtryk for GOT1 var højere i ikke-kanonisk type og blandet type (figur C i S1 File).

Diskussion

Prognosen for pancreas kræftpatienter er stadig dystre, og sygdommen er naturligvis resistent over for nuværende terapi [16]. Der er derfor et voksende behov for nye strategier for at øge antitumorvirkningen af ​​gemcitabin i bugspytkirtelkræft, som er standard kemoterapeutisk middel i bugspytkirtelkræft. For nylig har der været en stigende interesse i at forstå kræft ændret metabolisme og målrette kræft stofskifte har en lovende strategi for kræftbehandling [4,9,17-19]. Før sådanne effektive metaboliske stoffer kommer i brug, stofskifte fænotyper i enkelte patient med kræft i bugspytkirtlen skal klart identificeres på grund af indlysende heterogenitet i bugspytkirtelkræft [20,21]. Men lidt om metaboliske funktioner i bugspytkirtelkræft.

Derfor blev nærværende undersøgelse udført for at profilere glukose-afhængige og glutamin-afhængige metabolisme hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Til vores bedste viden, vores undersøgelse var den første undersøgelse, der fokuserede på profilering stofskifte fænotyper i kræft i bugspytkirtlen. For at identificere metabolismen fænotypen af ​​individuelle tumorprøver, vi først undersøgt den differentielle ekspression af stofskifte-relaterede proteinmarkører ikke kun i tumorceller, men også i stromale celler. Desuden har vi også undersøge den autophagic status gennem P62, LC3, Beclin1 udtryk og mitokondrielle funktion ved BNIP3 udtryk. Det blev rapporteret, at P62 er sendt mellem kernen og cytosolen kontinuerligt. P62 er forpligtet til at rekruttere den store phosphoinositid protein Alfy (autofagi-linked FYVE protein, også kendt som WDFY3), som er overvejende placeret på nukleare, til cytoplasmatiske P62 organer. Alfy samt P62, er nødvendig for dannelse og autophagic nedbrydning af cytoplasmatiske ubiquitin-positive inklusioner [22,23]. BNIP3 er en pro-apoptotisk medlem af Bcl-2-familien induceret under hypoxi og blev anvendt til at vurdere det mitokondrielle funktion. Det blev for nylig vist, at BNIP3 medierer mitokondriel dysfunktion gennem aktivering af Bax eller Bak, og inducerede mitokondriel permeabilitetsovergang via sin carboxyterminale hale. Derfor overekspression af BNIP3 angiver de dysfunktionelle mitokondrier [24,25]. Af note, stromale celler metabolisere gennem glycolysen grund dysfunktionelle mitokondrier og øget autofagi, mens tumorceller metabolisere gennem oxidativ phosphorylering ifølge teorien for omvendt Warburg virkning [7,26,27]. Da der ikke er nogen data rapporterer den omvendte Warburg effekten i bugspytkirtelkræft, blev denne undersøgelse gennemføres for at kontrollere eksistensen af ​​omvendt Warburg effekt i bugspytkirtelkræft i mellemtiden. Vi fandt, at øget tumor udtryk for GLUT1 var forbundet med nerve infiltration, lymfe invasion, UICC stadium, mens stomi udtryk for GLUT1 var forbundet med tumor dedifferentiation, positiv marginal status, nerve infiltration, lymfe invasion og UICC stadium.