PLoS ONE: Kvantificering af sjældne Cirkulerende tumorceller i ikke-småcellet lungekræft af ligand-Målrettet PCR

Abstrakt

Baggrund

Kvantificering af cirkulerende tumorceller (CTC) er værdifuldt for evaluering af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Følsomheden af ​​de nuværende metoder begrænser deres anvendelse til at opdage sjældne CTCs i tidligt stadium. Her evaluerer vi en hidtil ukendt fremgangsmåde, ligand-målrettet polymerasekædereaktion (LT-PCR), der kan detektere sjældne CTCs i NSCLC-patienter.

Metoder

CTCs blev beriget ved immunomagnetisk depletering af leukocytter og derefter mærket med et konjugat af en tumor-specifik ligand og et oligonukleotid. Efter afvaskning frie konjugater, blev de bundne konjugater strippet fra CTCs og derefter analyseret ved qPCR. For at evaluere den kliniske anvendelighed, blev blodprøver fra 72 NSCLC patienter (33 oprindeligt diagnosticeret og 39 om kemoterapi), 20 benigne patienter og 24 raske donorer.

Resultater

Forsøg med raske blod tilsat tumorceller angivet LT-PCR tillader specifik påvisning af CTC. Den kliniske undersøgelse viste, at de oprindeligt diagnosticerede patienter har et gennemsnit på 20,8 CTC-enheder med metastaserende sygdomme, 11,8 CTC enheder med lokaliserede sygdomme og 6,0 CTC enheder med godartede sygdomme. Med grænsen på 8,5 CTC-enheder, kan analysen afsløre 80% af fase I /II, 67% af fase III, og 93% af stadie IV kræft. Med de godartede patienter og raske donorer som kontrolgruppe, kan metoden opdage kræft med en følsomhed på 81,8% og en specificitet på 93,2%.

Konklusion

LT-PCR ville tillade kvantificering af CTC i NSCLC patienter på et mere følsomt niveau, hvilket giver en potentiel værktøj til stratificering maligne lungesygdomme, især ved tidligt tidspunkt

Henvisning:. Lou J, Ben S, Yang G, Liang X, Wang X, Ni S et al. (2013) Kvantificering af sjældne Cirkulerende tumorceller i ikke-småcellet lungekræft af ligand-Målrettet PCR. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10,1371 /journal.pone.0080458

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Juli 17, 2013; Accepteret: 2 oktober 2013; Udgivet: December 6, 2013 |

Copyright: © 2013 Lou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Key projekt af Shanghai Videnskab og Teknologi Kommissionen (Grand No: 10411950600). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at Dr.Guohua Yang er ansat af Genosaber Biotech. Samtidig har han mindre aktieoptioner ( 5%). I den periode, forskning, Dr. Yang giver kun teknisk support til os for at fuldføre den kliniske forskning. Denne tekniske support omfatter dataanalyse og teknisk beskrivelse af metoden i manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Cirkulerende tumorceller (CTC), kendt som “flydende biopsi”, er en let tilgængelig markør til overvågning kræft progression, respons på behandlingen og gentagelse af maligne sygdomme. Især bliver CTC endnu vigtigere, når vævsbiopsi er ikke egnet til visse patientpopulation. Klinisk betydning af CTC i NSCLC har været meget omtalt i de seneste undersøgelser. Høje antal detekteret CTC blev rapporteret at associere med dårlig prognose i metastatisk lungekræft [1] – [5]. Påvisning af visse mRNA eller multi-genet i CTC kan anvendes til prognose af resultatet af debulking kirurgi og strålebehandling i NSCLC-patienter [6] – [10]. For nylig er molekylær karakterisering af CTC i NCSLC vist sig at potentielt lede terapi [1], [11]

For at gå videre CTC afsløring til det næste niveau, opstod der forskellige lovende teknologier til CTC berigelse:. 1) CTC var positivt, immunmagnetisk fanget af anti-EpCAM (epithelial celleadhæsionsmolekyle) antistofcoatede magnetiske perler [7], [12], 2) CTC blev beriget ved immunomagnetisk depletering af leukocytter med anti- CD45 antistofcoatede magnetiske perler [5], [13]. 3) CTC blev beriget ved størrelse-baserede filtrering udstyr [14], 4) CTC blev beriget med en chip-baseret enhed med signatur mikrostruktur [15], og 5) CTC blev beriget ved samtidig udtømning af erythrocytter og leukocytter ved hjælp densitetsgradientcentrifugering [16], [17]. Til efterfølgende, kvantitativ analyse af CTC blev den berigede fraktion ved anvendelse af de førnævnte fremgangsmåder immunofluorescently mærkes og derefter undersøgt mikroskopisk eller ved flowcytometri [12], [18] – [21]. Selvom immunofluorescens baserede metoder udviste høj specificitet, kan følsomheden ikke være tilstrækkeligt til at påvise sjældne celler ved tidlige stadium af cancer [4], [12], [22]. Revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) blev også anvendt til CTC tælling med høj følsomhed [8], [23], [24]. Imidlertid blev post-transkriptionel regulering, deregulerer genekspressionen findes i utallige cancerceller [25] – [27]. Forordningen ændrer genekspression gennem ændringer af mRNA stabilitet og /eller transkriptionel effektivitet, og gør proteinindholdet ikke korrelerer med mRNA-niveau. LT-PCR, udviklet af GenoSaber Biotech, viste lovende i påvisning CTC gennem overfladeproteiner. Her hensigt vi at evaluere evne til LT-PCR til at undersøge CTC i NSCLC patienter. Ved denne metode blev CTC mærket med et konjugat af en tumor-specifik ligand folinsyre, selektivt bundet til ikke-småcellet lungekræft celler overudtrykker folat receptor [28] – [31], og en syntetiseret oligonucleotid (figur 1) . Konjugatet tjener som en adapter-molekyle til at konvertere en CTC til detektor molekyler “oligonukleotider”, som kan forstærkes til kvantitativ analyse. Denne undersøgelse foreslås at evaluere kliniske værdi detektere folat-positiv CTC i NSCLC-patienter.

Efter negativ berigelse ved immunomagnetisk depletering af leukocytter, blev CTCs mærket med et konjugat af en tumor-specifik ligand og et oligonukleotid. De mærkede CTCs blev vasket grundigt for at fjerne frie konjugater. Så de bundne konjugater blev strippet fra CTC og analyseret af qPCR.

Materialer og metoder

Reagenserne

CytoploRare® cirkulerende lungekræft celle kit blev leveret af GenoSaber Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina). Sættet består af to komponenter: den ene er til CTC berigelse og den anden er for CTC påvisning og kvantificering. Berigelsen komponent indbefatter røde blodlegemer lyseringsbuffer, inkubationsbuffer, anti-CD45 leukocytdepletering magnetiske perler, vaskepuffer, mærkning buffer, stripning buffer og neutralisering buffer. Påvisning og bestemmelse komponent indbefatter PCR reaktion buffer, primere, deioniseret vand, positive og negative cellekontroller, PCR-kontroller og standarder. Primersekvenserne blev opført som følgende. RT-primer, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 ‘; Fremadrettet primer, 5’TATGATTATGAGGCATGA-3 ‘; Revers primer, 5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘; Taqman Probe, 5’-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 ‘.

Efter producentens brugsanvisning, CTC blev beriget ved lyse af erythrocytter og immunomagnetisk udtømning af leukocytter fra 3 prøve ml blod. Den berigede CTC blev mærket med et konjugat af en tumor-specifik ligand folinsyre og et syntetiseret oligonukleotid. Efter mærkning blev den berigede CTC vasket grundigt for at fjerne de ubundne konjugater. Så de bundne konjugater blev specifikt strippet fra CTC overflade og opsamles til kvantitativ PCR-analyse (figur 1). Før forstærkning, konjugatet først udglødet og forlænget den RT primeren. Efter at den udvidede konjugat blev amplificeret og analyseret under anvendelse af en Taqman probe baseret kvantitativ PCR-metode. I den ovennævnte fremgangsmåde, blev de cirkulerende tumorceller identificeret som folat receptor-positive celler som mærket ved folat-linked oligonukleotider.

Cellelinie

Vi bruges human nasopharyngeal cancercellelinie KB, som udtrykker folat receptor 1 (FR) på celleoverfladen, at evaluere tilbagegangsforhold i spidse celleassay. KB-celler blev dyrket i folat-deficient RPMI-1640 medium (Life Technologies) med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies) ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Patienter

Seventy-to patienter med NSCLC, 20 med godartede lungesygdomme, og 24 til køns- og aldersbestemte matchede raske donorer blev indskrevet i undersøgelsen. I NSCLC patienter blev 33 patienter oprindeligt diagnosticeret, og 39 patienter var på kemoterapi. Kræftpatient karakteristika er til stede i tabel 1. Egenskaberne af patientens kohorte af godartede sygdomme er anført i tabel S1 i File S1. Tre milliliter perifert blod blev udtaget i antikoagulerende rør indeholdende EDTA fra individer deltager denne undersøgelse. Alle patient og raske frivillige indgår i denne undersøgelse underskrevet skriftligt informeret samtykke, før donere blod. Denne undersøgelse blev godkendt af Hospital Ethics Committee of Shanghai Bryst Hospital og etiske komité af Tilknyttede Hospital i Nantong University.

Prøveforberedelse

For at forberede prøverne for PCR-analyse blod, CTCs var beriget af lyse af erythrocytter og efterfølgende udtømning af leukocytter, der henviser til producentens protokol. Kort fortalt blev antikoagulerende fuldblodsprøver først lyseret ved lyse af røde blodlegemer puffer (v:v, 1:04) i 15 minutter på is. Cellerne blev derefter behandlet med 200 pi anti-CD45 coatede magnetiske perler i 30 min for at nedbryder leukocytter. Efter dette blev CTC inkuberet med puffer etikettering 10 pi (folat-bundet oligonukleotid-) i 40 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter vasket 3 gange med 1 ml vaskebuffer ved 500 g. Endelig blev cellerne behandlet med 120 pi stripping buffer til fjernelse ligand-oligonucleotid-konjugater. Supernatanten blev opsamlet ved centrifugering og neutraliseret ved 24 pi neutraliseringsbuffer for yderligere PCR-analyse.

PCR-analyse

Real time kvantitativ polymerasekædereaktion blev udført under anvendelse af CytoploRare® cirkulerende lungecancer celle kit på ABI StepOne ™ systemet (Life Technologies). To og en halv mikroliter af de forberedte prøver blev tilsat i en 25 pi PCR reaktion system efter producentens brugsanvisning. PCR-reaktionen var som følger: denaturering ved 95 ° C i 2 min, annealing ved 40 ° C i 30 s, ekstension ved 72 ° C i 30 s, derefter afkøling ved 8 ° C i 5 minutter; 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 10 s, annealing ved 35 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 10 s. En serie af standarder holdige oligonukleotider (10

-14 til 10

-9 M, svarende til 2 til 2 × 10

5 CTC enheder /3 ml blod) anvendes til CTC kvantificering. Alle patientprøver blev testet i duplikater med 6 standarder og 3 kvalitetskontrol. Per fabrikantens protokol, bør den gennemsnitlige intra-assay varians (den maksimale forskel mellem dubletter) være 0,5 tærskel cyklus for de standarder og kvalitetskontrol, og. 1 tærskel cyklus for testede prøver

Recovery, linearitet og kvantifikationsgrænse undersøgelser

for at etablere en legitim system til at vurdere nøjagtighed og linearitet af denne analyse blev blodprøver fra raske donorer samles og prøve i 3 ml prøver, der blev tilsat 5, 10, 20 , 40, og 200 dyrkede KB-celler. Den ikke-spikede, samlet blod tjente som en negativ kontrol (NC). To hundrede tusinde dyrkede KB-celler fungerede som en positiv reference (PR). De ovennævnte eksperimenter blev gentaget i 3 gange. De observerede celletal blev beregnet ved ligningen nedenfor:. Opsvinget forholdet blev bestemt ved at dividere mængden af ​​den observerede celle ved mængden af ​​spidse celler

For at bestemme linearitet af analysen, har vi analyseret observerede og spiked CTC tæller på tværs af alle datapunkter ved lineær regression. Vi fjernede confounding variable procent inddrivelse ved hjælp af observerede værdi af den oprindelige prøve divideret med fortyndingsfaktorer at bestemme de forventede værdier for fortyndingen serien for hver undersøgt prøve.

immunfarvning af beriget CTC

Tre milliliter blodprøver fra to metastatisk ikke-småcellet lungekræft patienter blev beriget ved hjælp af den førnævnte protokol. De berigede CTC prøver og dyrkede KB-celler blev fikseret med methanol i 10 minutter ved -20 ° C. Derefter blev cellerne mærket med en pan-cytokeratin monoklonalt antistof konjugeret til phycoerythrin (sc-8018PE, Santa Cruz, fortyndet ved 1:100) og et fluorescerende konjugater af folinsyre [19] (Wuxi AppTec, Kina, 10 nM) til en time. Derefter blev prøven vasket tre gange med PBS, efterfulgt af montering med 4′-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) indeholdende monterings media (Life Technologies), og efterfølgende udsat for billedanalyse under anvendelse af en konfokal mikroskopi (Leica Microsystems, Tyskland).

kliniske evalueringer

for at evaluere den kliniske anvendelighed, vi har gennemført et dobbelt-blindet, to-center studie på patienter med benigne og maligne lungesygdomme. For at vurdere forskellen mellem testgrupper, brugte vi den studerendes t-test med Welch korrektion for ulige varianser med 95% konfidensinterval. For at bestemme den tærskel, specificitet og følsomhed af fremgangsmåden blev dataene fra patienter med oprindeligt diagnosticeret NSCLC underkastet modtageren operating characteristic (ROC) analyse af Prism (GraphPad software). Kriteriet for at bestemme den optimale cutoff værdi i ROC analyse er at maksimere den samlede værdi af specificitet og sensitivitet.

Resultater

PCR kalibrering og CTC enhed

Som en ekstern kalibreringskurve blev seks standarder, der indeholder en serie af koncentrationer af de konjugerede oligonukleotider anvendes til at beregne mængden af ​​folat receptorer på CTCs (figur S1). For at ekstrapolere mængden af ​​CTC fra mængden af ​​folat receptorer, bruger vi en arbitrært defineret enhed, opkaldt CTC enhed. Som bestemt af kalibreringskurven, mængden af ​​folat receptor nummer på 1 × 10

5 KB celler er 7,5 × 10

-14 mol, som er defineret som 1 × 10

5 CTC enheder. Den detekterbare område for analysen er fra 2 til 2 × 10

5 CTC enhed. For kvalitetskontrol, intra-assay koefficient på variabilitet (CV) er fra 2,6% til 3,8%, og inter-assay CV er fra 3,3% til 5,3% (tabel S2 i File S1).

Validering af ligand-målrettet PCR-metode til CTC kvantificering

KB celle spiking undersøgelse viste, at 80% af de spidse celler kunne inddrives ved hver koncentration (5, 10, 20, 40 og 200) (figur 2A ). Den gennemsnitlige CTC tilbagegangsforhold var 81% ved 5 spiked celler i 3 ml blod, og endnu højere i prøver tilsat højere koncentration af celler. Med resultaterne fra spiking studiet, udførte vi de mindste kvadraters tilpasning til sammenligning af den observerede og spidse mængde i alle fortyndingsrække (figur 2B). Regressionsligningen var Y = 0,9455 × -0,831 med R

2 = 0,9946. Undersøgelsen viste, at over testede CTC koncentrationen den gennemsnitlige opsving, som stammer fra regressionsanalyse, er 94,6%.

A) Recovery forhold mellem spidse celle assay. B) Lineær regression kurve af spidse celleassay. C) Specificitet test af assayet. Spiked KB celler blev behandlet med (

konkurrerede

) eller uden (

kontrol

) 10 uM folinsyre før mærkning. D) Sund donorers blodprøver tilsat 20 KB celler

(20 celler)

eller uden KB tumorceller

(kontrol)

blev mærket med 10 nM folat-oligonukleotidkonjugatet

(konjugat )

eller ukonjugeret-oligonukleotid

(oligonukleotid)

efter berigelse. Data er vist med Mean ± SD fra tre uafhængige analyser.

For at vurdere intra-assay varians (inden-kørsel unøjagtighed), vi analyserede en stikprøve på 100 KB celler i 3 ml blod i samme kørt tredobbelt efter ovennævnte protokol. Derefter evaluerede vi den inter-assay varians (mellem-kørsel unøjagtighed) ved at analysere en samme prøve i tre eksemplarer i 6 separate analyser på 6 forskellige dage. Den intra-assay CV er 11,2%, og inter-assay CV er 14,2% (tabel S3 i File S1).

For at bestemme specificiteten af ​​denne metode, vi udførte en konkurrence forsøg med 10 pM folinsyre som en konkurrerende ligand til folat-bundet oligonukleotid-. Eksperimentets resultater viste, at 10 pM folinsyre kan blokere konjugatet i at binde til de KB-celler (figur 2C). Blokeringen tilvejebringer bevis for specificiteten af ​​folat-bundet oligonukleotid- bundet til folat receptor på spidse KB-celler.

Det skal bemærkes, at der er “baggrund” signaler til sunde donorers blodprøver. For at undersøge oprindelsen af ​​”baggrunds” -signalet, vi mærkede sunde donorers blod prøver tilsat 20 KB-celler eller uden KB tumorceller anvendelse af 10 nM folat-oligonukleotid-konjugat eller ukonjugeret -oligonucleotide (figur 2D). Blodprøverne tilsat ingen tumorceller binde til folat-bundet oligonukleotid eller ukonjugerede oligonukleotider indiscriminatively, som bestemt ved qPCR. I modsætning hertil prøver tilsat tumorceller kan naturligvis mærkes ved folat-konjugeret oligonukleotid snarere end det ukonjugerede oligonukleotid. Resultatet foreslået, at “baggrund” signaler var forårsaget af binding af oligonukleotiderne til de resterende blodlegemer i de berigede prøver. Vigtigere er det, “baggrund” signal forårsaget af “oligo-bindende” ikke ville kompromittere specifik påvisning af sjældne CTC som vist nedenfor.

For yderligere at evaluere specificiteten af ​​FR udtryk på CTC i NSCLC, tre milliliter blodprøver fra to metastatiske patienter bærer FR positiv CTC blev beriget ved hjælp af den førnævnte protokol. Så de berigede CTC prøver og dyrkede KB celler blev fikseret med methanol, og mærket af fluorescerende konjugater af folinsyre, monoklonalt antistof til cytokeratiner og nuklear farvning reagens, DAPI. Som vist i figur 3, blev KB-celler og de cirkulerende tumorceller specifikt mærket ved fluorescerende folat-konjugater (grøn) og cytokeratiner antistof (rød). I modsætning hertil kan de små leukocytter ikke mærkes af de fluorescerende folat konjugater og cytokeratin-antistof (figur 3H og 3L). Endvidere under mikroskop observation CTCs og dyrkede KB-celler viste en lignende ekspressionsniveau af folat receptor (figur 3).

KB-celler (A-D) og berigede CTCs fra to metastatiske NSCLC-patienter (CTC sample1 : E-H; CTC prøve 2: i-L) blev fikseret med methanol og farvet for cytokeratin (A, E og i) og folat receptor (FR) (B, F og J). Cellekernen blev mærket ved DAPI (C, G og K). De fusionerede billeder viste cytokeratin og folat receptor kun udtrykkes i CTCs (H og L) og KB-celler (D), ikke i hæmatologiske celler.

CTC forekomsten i kliniske prøver

som vist i tabel 1, blev i alt 72 patienter med NSCLC indrulleret i undersøgelsen. Som kontrolgrupper, opnåede vi perifert blod fra 20 patienter med benigne lungesygdomme og 24 raske donorer.

Først vi sammenlignet CTC niveauer i kræftpatienter ved første diagnose, godartede patienter sygdom, og raske forsøgspersoner. Som vist i figur 4A, CTC i blod fra patienter med lokaliseret (trin I, II og III betyder 11.9 CTC enhed intervallet 3,8-25,7 CTC enhed;

s

= 0,0011) eller metastatisk (stadium IV ; betyder 20,9 CTC enhed rækkevidde 6,8-75,0 CTC enhed

s

= 0,0055) sygdomme er betydeligt højere end raske frivillige (gennemsnit 6,7; interval 3,0-11,4 CTC enhed) og godartede lungesygdom patienter (betyde 6.0; spænder fra 1,6 til 8,7 CTC enhed). De metastatiske patienter har mere CTC end lokaliserede patienter (

s

= 0,045). De ovennævnte resultater viste, at de lokaliserede og metastatiske patienter har forskellige niveauer af CTC. I en mere avanceret analyse, ønsker vi at undersøge følsomheden af ​​metoden i retning af forskellige histologiske undertyper af NSCLC. For de 16-adenocarcinom patienter, CTC niveauer (middel 18,1, interval 3,8-75,0) ikke viser signifikant forskel fra de 11 pladecellecarcinom (SCC) patienter (gennemsnit 12,4, område 4,3-20,8) og andre histologiske undertyper (gennemsnit 15,1, interval 10,1-25,7) (figur 4B). Dette resultat foreslog udtryk for folat receptor kan være ens på tværs af alle histologiske undertyper i NSCLC patienter.

A) CTC niveauer i lokaliseret og metastatisk malign lungesygdom, godartet lungesygdom og raske donorer. B) Fordeling af CTC-niveauer i forskellige histologiske undertyper. ADC, adenocarcinom; SCC, pladecellecarcinom. C) Modtager opererer karakteristik (ROC) analyse mellem ondartet lungesygdom gruppe og godartet sygdom og sund gruppe.

For yderligere at analysere følsomheden og specificiteten af ​​analysen for forskellige patologiske stadier og histologiske undertyper i NSCLC, vi først nødt til at etablere cut-off grænse ved ROC-analyse. Figur 4C viser, at den afskårne tærsklen mellem kontrolgruppen (benigne patienter og raske forsøgspersoner) og oprindeligt diagnosticeret cancer gruppe var 8,5 CTC enhed, er følsomheden 81,8%, og specificiteten er 93,2%. Naturligvis blev CTCs påvist i blodprøver fra 82% (27 af 32) oprindeligt diagnosticeret NSCLC-patienter, hvorimod falske positiver i 20 sygdomspatienter benigne (5%, 1 af 20) og 24 normale frivillige var ubetydelig (8%, 2 af 24 ). Som vist i tabel 2, 80% (8 af 10) af trin I-II, 67% (6 ud af 9) i fase III, og 93% (13 af 14) af trin IV patienter blev fundet at have mere end 8,5 CTC enhed. I histologiske undertyper, 69% (11 af 16) af adenocarcinom patienter CTC positive, og 91% (10 af 11) af SCC patienter var CTC positive.

Offentliggjorte undersøgelser indikerede kemoterapi kan kompromittere tilstedeværelse af CTC i omløb [1], [4], [5]. Vi udførte en forundersøgelse for at sammenligne CTC nummer i NSCLC patienter ved første diagnosticering og kemoterapi. Som vist i figur 5, 16 lokaliserede patienter på kemoterapi (gennemsnit 5,8, interval 0,7-11,5) har væsentligt lavere CTC niveauer end de oprindeligt diagnosticerede patienter (

s

= 0,0006); mens forskellen i CTC niveauer i metastatiske patienter med eller uden behandling var ikke så stor som de lokaliserede patienter. Selv om den gennemsnitlige CTC niveau i metastatiske patienter ved første diagnosticering var 20,9 CTC enhed i forhold til 13,5 CTC enhed i patienter på kemoterapi, har t-test ikke bekræfte, at forskellen var signifikant på en

s

på 0,05 . Den statistiske analyse foreslog, at de lokaliserede NSCLC patienter kan have bedre prognose sammenlignet med de metastatiske patienter, når de sættes på kemoterapi

w /o kemo

, oprindeligt diagnosticeret NSCLC patienter.;

med kemo

, NSCLC patienter på kemoterapi.

Diskussion

Vi har vurderet LT-PCR-teknik til kvantificering CTC i perifere blodprøver fra NSCLC patienter. Teknologien er baseret på negativ udtømning af leukocytter efterfulgt af mærkning af CTC med folat-koblet oligonukleotid og efterfølgende kvantificering med qPCR. Undersøgelser med raske blodprøver spiket med tumorceller viser, at assayet er specifik, kvantitativ og lineær fra en række 5-200 celler pr 3 ml blod analyseres. Evaluering af patientblodprøver demonstrerer, at fremgangsmåden er følsom nok til at stratificere patienter med forskellig status (godartet, lokal og metastatisk).

Potentielle fordele ved LT-PCR til onkologer kan indbefatte 1) ikke-invasiv vurdering af tumorbelastning i perifert blod, 2) ultrafølsom analyse, muliggør avanceret lagdeling af lungesygdomme, 3) så lav som 3 ml prøvevolumen, der ikke ville forværre patientens anæmi forårsaget af cytotoksiske bivirkninger, 4) realtid langsgående overvågning af sygdomsstatus og respons på behandlingen, og 5) standardiseret platform, der eliminerer kunstig analyse bias.

De fleste

in vitro

blodprøver diagnostiske for NSCLC kræft lider potentielle falsk negative og /eller positive resultater. Brugen af ​​anti-EpCAM coatede magnetiske kugler blev forsøgt for berigelse af CTC i NSCLC blodprøver. Men viste kliniske undersøgelser, lav følsomhed af EpCAM baseret berigelse i CTC detektion for NSCLC patienter [12], [22]. Offentliggjorte undersøgelser viste også, at ikke-EpCAM udtrykker celle kan omfatte hovedparten af ​​CTC i NSCLC perifert blod, og dermed EpCAM baseret berigelse kan ikke opdager sjældne CTC [22]. Vi opdaget folat receptor udtryk i EpCAM positive og negative CTCs i NSCLC patienter. Anti-EpCAM-overtrukne magnetiske perler blev anvendt til at separere EpCAM-positive og EpCAM-negative del af CTCs. Vi fandt FR positivt CTC nummer var meget højere i EpCAM-negative fraktion end i EpCAM-positive fraktion i alle tre NSCLC patienter (Figur S2). Resultaterne indikerede, at EpCAM baseret fanger kan gå glip stor fraktion af CTCs i lungekræft. Carcinoembryonalt antigen (CEA), et glycoprotein er involveret i udviklingen af ​​lungekræft, er også fundet på normale eller godartede syge celler frigivet i omløb [32]. Anvendeligheden af ​​CYFRA21-1, hvilket er en cytokeratin 19 fragmenter frigivet i blodet, er blevet undersøgt i studier i diagnosen af ​​NSCLC [33] – [35]. Selv CYFRA21-1 kan være den mest følsomme tumor markør i avanceret NSCLC, følsomheden af ​​CYFRA21-1 er stadig lav for tidligt stadium sygdom [33], [35].

Offentliggjorte data fra væv biopsi har vist 72% -83% lungekræft over-udtrykke FR på celleoverfladen [28] – [31]. Nylige rapporter viste FR positive CTC blev fundet i ovariecancer [19]. Indtil videre er der ikke rapporteret om undersøgelser for forekomsten af ​​FR positiv CTC i NSCLC. I denne undersøgelse har vi undersøgt den kliniske værdi af folat-positiv CTC i NSCLC. Resultaterne indikerede FR er en potentiel overflade markør identificere CTC af NSCLC patienter, selv i tidligt stadium. Nylige undersøgelser viste, at der i primær tumor masse, FR udtryk er meget lavere i SCC end i adenocarcinom i metastatisk kræft [29]. Vi fandt imidlertid FR udtryk i CTCs er ens på tværs af alle histologiske undertyper. Denne modstridende fund kan forklares ved anden fordeling af patologiske stadier for individuelle histologiske undertyper. Iwakiri

et al.

Rapporterede, at den lavere ekspression af folat receptor blev fundet i fremskredent stadium i forhold til tidlig fase i NSCLC [36]. I de patienter, der deltog i vores undersøgelse, 48% har adenocarcinomer (fase IV, 44%), 33% har planocellulært karcinom (stadie IV, 27%), og 18% har uspecificeret lungekræft. Den lavere FR positivitet i adenokarcinomer i vores undersøgelse kunne forklares ved den høje procentdel af patienterne sene stadie indskrevet i forhold til SCC gruppe. Samt, findes der en anden mulighed for, at CTC kan udtrykke FR forskellig fra primære tumor masserne. Tidligere litteratur angivne differentiel genekspression mellem primær tumor og CTC prøven [37]. En storstilet ville veldesignede kliniske undersøgelse være nødvendig for at løse ovenstående problem.

Selvom folat receptor er blevet identificeret i normale væv, herunder nyre, milt og lunger osv [28]. Der er imidlertid ingen celler, der udtrykker folatreceptorer i kredsløbssystemet undtagen CTCs eller aktiverede monocytter [19], [38]. Foreløbige undersøgelser fundet, at denne underpopulation af aktiverede monocytter er knap påviselig i blodprøver fra raske donorer eller benigne patienter [19], [39]. I 9% af tilfældene, hvor der kan påvises “CTC” raske prøver, kan der eksistere mulighed for illegitim udtryk for monocytter. Men hypotesen skal verificeres i en yderligere undersøgelse. Folat receptorekspression findes også i tumor aktiverede makrofager [40]. For at undersøge den makrofager virkning i denne Detektionssystem NSCLC patienter blev anti-CD14 coatede magnetiske perler anvendes til at depletere de aktiverede makrofager i blodprøve af NSCLC-patienter [41], efter udtømning af CD45-positive leukocytter. Vi fandt CTC tællinger blev ikke ændret under den “ekstra-CD14” behandling i NSCLC patienter (Figur S3). Dette resultat foreslog udtømningen mekanisme ved hjælp af anti-CD45 magnetiske perler er tilstrækkelig til at fjerne virkningerne af tumor-associerede makrofager på CTC tæller.

I denne undersøgelse fandt vi en lav baggrund “CTC” niveau i raske forsøgspersoner og godartet sygdom patienter. Som demonstreret fra specificiteten undersøgelsen, kan baggrundssignalet skyldes bindingen af ​​oligonukleotidet til de resterende blodceller. Selvom tidligere litteratur beskrevet flere mekanismer for binding af oligonukleotidet til pattedyrceller [42], er der ikke enighed om denne biologiske proces. disse undersøgelser alle demonstrerede dog, at den bindende mængde oligonukleotid er betydeligt lavere sammenlignet med vores konjugater. Vi er overbeviste om, at den “baggrund CTC” ikke vil forstyrre detektion af den virkelige “CTC” i patienter med lungecancer.

Endelig fordi højere CTC tæller blev rapporteret at associere med dårlig prognose i metastatisk kræft [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR ville potentielt identificere den undergruppe af patienter med dårlig prognose i den tidlige fase af sygdommen, og dermed støtte onkologer til at ordinere mere effektive behandlingsformer. I en mere avanceret analyse, ville fænotype af CTC direkte bevis for onkologer at bestemme den optimale behandlingsregime. Med passende affinitet ligand (f.eks antistof, peptid, små kemiske molekyler, etc.), LT-PCR kan nærmere for fænotypning sjældne CTC i en multiplex, high-throughput fashion.

Støtte oplysninger

Figur S1.

Kalibreringskurve af qPCR og lineality parametre

doi:. 10,1371 /journal.pone.0080458.s001

(TIF)

Figur S2.

Folat receptor udtryk i EpCAM positive og negative CTCs i NSCLC patienter. CTC prøver blev beriget fra 3 ml blod fra tre FR-positive NSCLC-patienter ved lyse af erythrocytter og immunomagnetisk depletering af leukocytter. Så de berigede CTC prøverne blev inkuberet med anti-EpCAM magnetiske perler (Life Technologies, katalog nr 16203) i 30 min. Efter immunmagnetisk isolation i 10 minutter blev EpCAM-positive celler fanget af de magnetiske perler. EpCAM negative celler blev opsamlet fra supernatanten ved centrifugering ved 600 g i 15 min. Derefter blev de to fraktioner af CTC prøve mærket og detekteret som den førnævnte protokol. Data er vist med Mean ± SD fra tre uafhængige qPCR assays

doi:. 10,1371 /journal.pone.0080458.s002

(TIF)

Figur S3.

virkningen af ​​tumor-associerede makrofager i FR positive NSCLC patienter. CTC prøver blev beriget fra 3 ml blod fra tre FR-positive NSCLC-patienter ved lyse af erythrocytter og immunomagnetisk depletering af CD45-positive leukocytter. Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3.