PLoS ONE: Delphinidin Reducerer Cell Proliferation og inducerer apoptose af ikke-småcellet Cancer Cells ved målretning EGFR /VEGFR2 Signaling Pathways

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2 (VEGFR2) er dukket op som to effektive kliniske mål for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at delphinidin, en anthocyanidin, til stede i pigmenterede frugter og grøntsager, er en potent hæmmer af både EGFR og VEGFR2 i NSCLC-celler, der overudtrykker EGFR /VEGFR2. Ved hjælp af disse celler, vi næste bestemmes virkningerne af delphinidin på cellevækst og apoptose

in vitro

på tumorvækst og angiogenese

in vivo

. Delphinidin (5-60 uM) behandling af NSCLC celler hæmmede aktivering af PI3K og phosphorylering af AKT og MAPK’er. Derudover behandling af NSCLC celler med delphinidin resulterede i inhibering af cellevækst uden at have signifikante toksiske virkninger på normale humane bronchiale epithelceller. Specifikt behandling af NCI-H441 og SK-MES-1-celler med delphindin (5-60 uM) resulterede i (i) spaltning af PARP-protein, (ii) aktivering af caspase-3 og -9, (iii) nedregulering af anti -apoptotic proteiner (Bcl2, Bd-xL og MCL-1), (iv) opregulering af pro-apoptotiske proteiner (Bax og Bak), og (v) nedsat ekspression af PCNA og cyclin D1. Endvidere i athymiske nøgne mus subkutant implanteret humane NSCLC-celler, delphinidinproduktion behandling forårsagede en (i) signifikant inhibering af tumorvækst, (ii) reduktion i ekspressionen af ​​markører for celleproliferation (Ki67 og PCNA) og angiogenese (CD31 og VEGF) og (iii) induktion af apoptose, når man sammenligner med kontrolmus. Baseret på disse observationer, foreslår vi, at delphinidin, alene eller som en adjuvans til nuværende behandlinger, kunne anvendes til styring af NSCLC, især dem, der overudtrykker EGFR og VEGFR2

Henvisning:. Pal HC, Sharma S, Strickland LR, Agarwal J, Athar M, Elmets CA, et al. (2013) Delphinidin Reducerer Cell Proliferation og inducerer apoptose af ikke-småcellet Cancer Cells ved målretning EGFR /VEGFR2 signalveje. PLoS ONE 8 (10): e77270. doi: 10,1371 /journal.pone.0077270

Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Modtaget: August 3, 2013; Accepteret: 9. september 2013; Udgivet: 4 okt 2013

Copyright: © 2013 Pal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant AT004966 og National Cancer Institute CA13148-39 UAB Comprehensive Cancer center Junior Faculty Development Grant Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er et stort sundhedsproblem i USA tegner sig for ca. 28% af alle kræftrelaterede dødsfald. Desuden har i alt 228,190 nye kræfttilfælde og 159,480 dødsfald som følge af lungekræft blevet fremskrevet at forekomme i USA i 2013 [1]. De to store former for lungekræft er småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), som omfatter ca. 15 og 85% af alle tilfælde henholdsvis. Lungekræft har vist sig vanskeligt at kontrollere med konventionelle terapeutiske og kirurgiske metoder, der fører til dårlig prognose. Vejledende af denne dårlig prognose, den samlede 5-års overlevelse er kun 15% for NSCLC [2,3]. Det er klart, er undersøgelse af alternative behandlingsmuligheder for NSCLC berettiget og vil forhåbentlig føre til lindring af denne store byrde for dødelighed.

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR /HER1 /ErbB1) er en type 1 transmembrane receptortyrosinkinase (RTK) af ErbB-familien. Det er sammensat af et ekstracellulært domæne og et intracellulært domæne indeholdende tyrosinkinaseaktivitet [4]. Det er velkendt, at EGFR overudtrykkes i ca. 95% af alle faste tumorer [5,6]. Endvidere er det kendt at være en kritisk onkogen driver, der opstår i over 60% af NSCLC tilfælde [7] og ca. 30% af brystcancere [8]. Desuden har den vaskulære endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGFR2) blevet rapporteret at være overudtrykt i flere tumorer, herunder lungekræft [9]. Endvidere er overekspression af både EGFR og VEGFR2 forbundet med kemoresistens og er korreleret med en dårlig prognose [10,11]. Aberrant aktivering af EGFR og VEGFR2 udløser phosphorylering af en lang række proteiner, herunder de PI3K /AKT og MAPK pathways, der er involveret i celleoverlevelse, apoptose og angiogenese [12,13]. På grund af potentiel krydstale og en veletableret rolle i tumorvækst og angiogenese, inhibering af både EGFR og VEGFR2 signalering kan forbedre det kliniske resultat af avancerede NSCLC-patienter. Der er vedtaget forskellige tilgange til samtidig blokere EGFR og VEGFR2 signalering. Kombinationer af to specifikke inhibitorer og enkelte midler, der er målrettet disse receptorer er blevet anvendt; men deres anvendelse i patienter mødt med uacceptable toksiciteter.

Der er et presserende behov for at udvikle flere målrettede terapeutiske naturlige middel som blokerer RTK aktiviteter og nedstrøms signalering af både EGFR og VEGFR2 at forbedre terapeutisk effekt og minimere toksicitet for normal værtsceller. Et sådant middel er delphinidin, en kosten anthocyanidin kendt for at være rigeligt til stede i mange pigmenterede frugter (granatæbler, bær og mørke druer) og grøntsager (auberginer, tomater, gulerødder og røde løg) [14]. Det besidder anti-oxidant [15], anti-inflammatoriske [16,17], anti-proliferative [18] og anti-cancer aktiviteter [19]. Desuden har delphinidin blevet vist at inhibere EGFR signalvejen samt invasion af brystcancerceller [20]. Men de fleste af de anti-cancer og antiangiogene aktiviteter rapporteret i litteraturen, er baseret på

in vitro

studier. Målet med denne undersøgelse var at bestemme virkningerne af delphinidin på cellevækst og apoptose

in vitro

på tumorvækst og angiogenese

in vivo

i NSCLC celler. Vores resultater viste, at delphinidin er en potent hæmmer af både EGFR og VEGFR2 i NSCLC-celler. Desuden delphindin inhiberede aktiveringen af ​​PI3K, og phosphorylering af AKT og MAPK’er. Dette resulterede i cellevækstinhibering og induktion af apoptose i NSCLC-celler. Endvidere delphindin behandling hæmmede væksten af ​​NSCLC xenografter i nøgne mus, som var forbundet med et fald i ekspressionen af ​​markører for celleproliferation og angiogenese samt en induktion af apoptose.

Materialer og Metoder

Materialer

Delphinidin ( 98% rent) blev købt fra Extrasynthase (Lyon, Frankrig). De monoklonale og polyklonale antistoffer for EGFR og phospho-EGFR, VEGFR2 og phospho-VEGFR2, ERK1 /2 (phospho-p44 /42, Thr

202 /Tyr

204), JNK1 /2 (phospo-P54 /46 , Thr

183 /Tyr

185), p38 (phospho-p38, Thr

180 /Tyr

204), PI3K, phospho AKT, Bcl2, Bd-xL, Mcl-1, Bax, Bak, cyclin D1, PARP, caspase-3 og -9 blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Polyklonale antistoffer for VEGF, PCNA og Ki67 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-muse CD31-antistof blev opnået fra BD Biosciences (San Jose CA). Anti-mus eller anti-kanin sekundært peberrodsperoxidasekonjugat blev opnået fra Millipore Corporation (Billerica, MA).

Behandling af celler Salg

Humant NSCLC celler NCI-H441, SK-MES-1 og A549 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). NCI-H441-celler blev dyrket i RPMI1640-medium (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), SK-MES-1-celler blev dyrket i EMEM medium (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), og A549-celler blev dyrket i Hams F -12K medium (Mediatech Inc., Manassas, VA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100 mg /ml penicillin-streptomycin. Normale humane bronkiale epitel (NHBE) -celler blev opnået fra Clonetics Airways epitelcelle Systems (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD) og dyrket i bronchieepithelceller Growth Media suppleret med vækstfaktorer (Cambrex Bio Science, Walkersville Inc., MD). Cellerne blev holdt under standard cellekultur betingelser ved 37 ° C og 5% CO

2 i et fugtigt miljø. Delphinidin (opløst i DMSO) blev anvendt til behandling af celler. Slutkoncentrationen af ​​DMSO anvendt var 0,1% (v /v) for hver behandling. For dosisafhængige studier NCI-H441 og SK-MES-1-celler blev behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 og 48 timer i komplet cellemedium. Kontrolceller blev behandlet med vehiklet alene. I yderligere eksperimenter, serum sultet NCI-H441 og SK-MES-1-celler blev behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 timer og derefter inkuberet uden eller med EGF (50 ng /ml; 15 min) eller uden og med VEGF (20 ng /ml; 30 min).

Fremstilling af cellelysater

Efter celle behandling med delphinidin, blev mediet aspireret, og cellerne blev vasket med PBS (10 mmol /l, pH 7,45). Cellerne blev derefter inkuberet i en iskold lyseringspuffer (10 mM HEPES (pH 7,9), 100 mM KCI, 10 mM EDTA, 20 mM EGTA, 100 mM DTT, 20 mM PMSF, 0,5% NP-40 med frisk tilsat proteaseinhibitorer leupeptin, aprotinin og benzamidin) i 20 min. Cellerne blev høstet, og lysatet blev opsamlet i et mikrocentrifugeglas og ledes gennem en 21,5-G nål til at bryde op celleaggregater. Lysatet blev klaret ved centrifugering ved 14.000 i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten (total cellelysat) opsamlet, opdelt i prøver og derefter anvendt på dagen for fremstillingen eller umiddelbart opbevaret ved -80 ° C til brug på et senere tidspunkt .

Western blot-analyse

for western blotting, blev 30-50 ug protein løst i løbet af 8-12% Tris-glycin geler og overført til en nitrocellulose membran. Kort fortalt blev membranen blokeret og probet med passende primære og sekundære antistof HRP-konjugat efterfulgt af kemiluminescens og autoradiografi som tidligere beskrevet [20].

Cellelevedygtighed assay

Virkningen af ​​delphinidin på cellelevedygtigheden blev bestemt ved 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler (NHBE, NCI-H441, A549, og SK-MES-1) blev udpladet i en 96-brønds mikrotiterplade og behandlet med 5-100 pM koncentrationer af delphinidin i 48 timer. 1/10 volumen 10xMTT opløsning (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til hver brønd og inkuberes i 2 timer og absorbansen blev registreret på en mikropladelæser ved 540 nm efter solubilisering reduceret MTT med DMSO. Effekten af ​​delphinidin på væksthæmning blev vurderet som levedygtighed procent celle, hvor DMSO-behandlede celler blev taget som 100% levedygtige.

Behandling af athymiske nøgne mus

Fire fem uger gammel kvindelig athymiske ( nu /nu) nøgne mus blev købt fra NCI-Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research og opstaldet under patogenfrie betingelser med en 12 timers lys /12 timer mørke tidsplan i Animal Resource Facility ved University of Alabama i Birmingham i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Dyret, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Alabama i Birmingham, og dyret protokol nummer er 120609365. Dyrene blev fodret med phytochemical fri kost AIN-76 SEMI PD (Test Kost, Richmond, IN)

ad libitum

. Musene blev injiceret subkutant med et fast antal NCI-H441-celler (4×10

6 i 50 pi RPMI + 50 pi matrigel) i hver flanke at initiere tumorvækst. Dyrene blev derefter tilfældigt opdelt i tre grupper med 6 dyr i hver gruppe. Den første gruppe af dyr modtog en i.p. injektion af DMSO (100 pi) og tjente som kontrol. Dyrene i gruppe 2 og 3 modtog en i.p. injektion af delphinidin (1 mg /dyr og 2 mg /dyr) hos 100 pi DMSO tre gange /uge. Tumor størrelser blev målt to gange om ugen, og tumor volumen blev beregnet ved formlen ½ (

L

1 ×

L

2 ×

H

) , hvor

L

1 er den lange diameter,

L

2 er den korte diameter, og H er højden af ​​tumoren. Alle dyr blev aflivet ved CO

2 inhalation og død blev bekræftet ved cervikal dislokation, når tumorerne nåede et volumen på ca. 1200 mm

3 i kontrolgruppen. Lignende eksperimenter blev derefter udført med SK-MES-1-celler. Alle procedurer udført var i overensstemmelse med retningslinjerne for anvendelse og pleje af forsøgsdyr og godkendt af IACUC.

Immunhistokemi og immunfluorescensfarvning

Fem mikrometer snit blev skåret, deparaffineret i xylener, rehydreret i ethanol, og vasket i phosphatbufret saltvand. For antigen hentning blev snit opvarmet til 95 ° C i 30 minutter i citratpuffer (pH 6,0). Kort beskrevet blev snit derefter inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubation med et specifikt peberrod peroxidase-mærket sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Derefter blev sektionerne inkuberet med diaminobenziden peroxidasesubstrat opløsning i 2 minutter og modfarvet med Mayers hematoxylin-opløsning. For immunfluorescensfarvning efter antigen-genvinding blev snit inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med AlexaFluor-488 mærket sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Objektglas blev monteret med Vectashield monteringsmedie indeholdende DAPI og analyseret under fluorescensmikroskop.

Statistisk analyse

Resultaterne udtrykkes som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse af alle data blev udført ved t-test.

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

delphinidin behandling hæmmer konstitutive og EGF-induceret fosforylering af EGFR i NCI-H441 celler

.

Aberrant aktivering og overekspression af EGFR fører til dysregulering af signalveje afgørende for celleproliferation, overlevelse, cancer progression, angiogenese og metastatis [21]. EGFR overekspression NCI-H441 celler blev behandlet med delphinidin (5-60 uM, 3 timer) for at bestemme dets effekt på EGFR. Som vist i figur 1A, delphinidinproduktion behandlingen reducerede ekspression og phosphorylering af EGFR i NCI-H441 celler. Desuden overekspression af dens ligand EGF, som aktiverer EGFR, spiller en vigtig rolle i tumorigenese af NSCLC [22]. Vi har derfor bestemmes virkningen af ​​delphinidin på EGF-induceret phosphorylering af EGFR og fandt dens behandling signifikant inhiberede aktivering EGF-induceret og phosphorylering af EGFR (figur 1A). En tilsvarende virkning af delphinidin på phosphorylering af EGFR blev også observeret i SK-MES-1-celler (data ikke vist). Dette viser, at delphinidinproduktion behandling reducerer både konstitutiv og EGF-induceret phosphorylering af EGFR.

[A] NCI-H441-celler blev behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 timer i komplet cellemedium (venstre panel) . I det højre panel, blev serum sultet NCI-H441-celler behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 timer og derefter inkuberet uden eller med EGF (50 ng /ml) i 15 min. Efter behandling blev cellerne høstet, og cellelysater blev fremstillet og ekspressionen EGFR og phosphoryleret-EGFR blev bestemt. [B] NCI-H441-celler blev behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 timer i komplet cellemedium (venstre panel). I det højre panel, blev serum sultet NCI-H441-celler behandlet med delphinidin (5-60 pM) i 3 timer og derefter inkuberet uden eller med VEGF (20 ng /ml) i 30 min. Efter behandling celler blev høstet og cellelysater blev fremstillet, og udtrykket VEGFR2 og phosphoryleret VEGFR2 blev bestemt. Lige belastning af protein blev bekræftet ved stripning immunoblot og Fornyet probing det for β-actin. De viste her immunblots er fra et repræsentativt forsøg gentaget tre gange med lignende resultater.

delphinidin behandling hæmmer konstitutive og VEGF-induceret fosforylering af VEGFR2 i NCI-H441 celler

Svarende til EGFR, overekspression og afvigende aktivering af VEGFR2 er også blevet rapporteret i flere cancerceller, herunder NSCLC [23]. Ligesom EGFR, VEGFR2 undergår dimerisation og VEGFR ligand-afhængig phosphorylering og aktivering resulterer i dysregulering af nedstrøms signalering. Dette udløser derefter mitogene, kemotaktiske og pro-overlevelsessignaler, sammen med stimulering af dannelse tumor fartøj [24]. Derfor vurderede vi også virkningen af ​​delphinidin (5-60 pM; 3 timer) på ekspression af VEGFR2 i NCH-H441-celler og fundet, at behandlingen reducerede signifikant ekspressionen af ​​VEGFR2 i NCI-H441 celler (Figur 1B). Desuden delphinidinproduktion behandling inhiberede VEGF-induceret aktivering og phosphorylering af VEGFR2 (figur 1B). En tilsvarende virkning af delphinidin på phosphoryleringen af ​​VEGFR2 blev også observeret i SK-MES-1-celler (data ikke vist). Disse resultater viser klart, at delphinidinproduktion behandling inhiberer konstitutiv og VEGF-induceret phosphorylering af VEGFR2.

delphinidin behandling inhiberer protein ekspression af PI3K og phosphorylering af AKT og MAPK’er i NCI-H441 og SK-MES-1 celler

Modstand mod EGFR inhibitorer er associeret med aktivering af PI3K /AKT og MAPK’er signalveje [25]. EGFR /PI3K /AKT /MAPK’er signalering spiller en central rolle i tumorigenese, forøget celleproliferation, angiogenese og inhibering af apoptose i forskellige humane maligniteter, herunder NSCLC [21,26]. Når PI3K /AKT signalering aktiveres af EGFR, det phosphorylerer flere nedstrøms, der er involverede i vigtige cellulære processer, herunder celledeling og apoptose. Behandling af delphinidin (5-60 uM; 48 timer) resulterede i nedsat ekspression af p85 (en regulatorisk underenhed) og p110α (en katalytisk underenhed) af PI3K i NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 2A). PI3K regulerer phosphorylering og aktivering af AKT, som fremmer celleoverlevelse ved at blokere funktionerne af pro-apoptotiske proteiner og fremme induktionen af ​​celleoverlevelsessignaler proteiner [27]. Som en konsekvens af PI3K inhibering med delphinidin, blev AKT phosphorylering signifikant reduceret i begge NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 2A).

[A] NCI-H441 og SK-MES-1-celler blev behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for at bestemme dets effekt på protein ekspression af PI3K, phosphorylering af AKT og MAPK’er. Efter behandling blev cellerne høstet, blev cellelysater fremstillet og protein blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotanalyse og kemiluminescensdetektion. Lige belastning af protein blev bekræftet ved stripning immunoblot og Fornyet probing det for β-actin. De her viste immunoblots er fra et repræsentativt forsøg gentaget tre gange med lignende resultater. [B] cellelevedygtighed A549, NCI-H441, SK-MES-1 og NHBE-celler behandlet med 5-100 uM delphinidin i 48 timer, blev bestemt ved MTT-assay som beskrevet i “Materialer og metoder”. De viste data er gennemsnit ± SEM af tre separate forsøg, hvor hver behandling blev gentaget i 10 brønde. [C] NCI-H441 og SK-MES-1-celler blev behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for at bestemme dets effekt på proteinekspression af PCNA og cyclinD1. Efter behandling blev cellerne høstet, blev cellelysater fremstillet og protein blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotanalyse og kemiluminescensdetektion. Lige belastning af protein blev bekræftet ved stripning immunoblot og Fornyet probing det for β-actin. De her viste immunoblots er fra et repræsentativt forsøg gentaget tre gange med lignende resultater.

MAPK’er pathway er en anden signaleringskaskade, der aktiveres af EGFR og spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​mange cellulære responser, herunder celleproliferation og apoptose [28]. Den MAPK’er familie består af tre store undergrupper: ERK (ekstracellulær signal-reguleret protein kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase) og p38 MAPK [29]. ERK’er er hovedsageligt involveret i regulering af mitogenaktiverede proliferation /differentieringsfaktorer, mens JNK og p38 MAPK’er udfører funktioner i forbindelse med apoptotisk celledød [30]. Derfor vurderede vi også effekten af ​​delphinidin på MAPK’er signalering i NSCLC celler. Vi fandt, at delphinidinproduktion behandlingen reducerede phosphorylering af ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 i både NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 2A).

delphinidin behandling inhiberer væksten af ​​NSCLC-celler

Da overekspression og afvigende aktivering af EGFR og dens downstream signalveje inhiberes af delphinidin, vi næste undersøgt dens virkning på cellulær proliferation af NSCLC-celler ved anvendelse af en MTT-analyse. NSCLC A549, NCI-H441 og SK-MES-1 celler overeksprimerer EGFR og VEGFR2 blev behandlet med delphinidin (5-100 uM, 48 timer). Resultater af MTT-analysen viste, at delphinidin var effektivt til væsentligt at hæmme cellevækst af A549 (4-70%; p 0,05-0,01), NCI-H441 (6-59%; p 0,05-0,01) og SK-med- 1-celler (9-73%; p 0,05-0,01) (figur 2B). IC

50 værdier af delphinidin blev anslået til at være 55, 58 og 44 uM for A549, NCI-H441 og SK-MES-1 celler hhv. Vi undersøgte også virkningerne af delphinidin på væksten af ​​normale menneskelige bronchial epitel (NHBE) celler under lignende forhold, og fandt, at disse doser har kun marginal effekt på væksten af ​​disse celler (figur 2B).

delphinidin behandling hæmmer proteinet ekspression af cyclin D1 og PCNA i NCI-H441 og SK-MES-1-celler Salg

signalveje, der er involveret i aktivering af MAPK’er aktiveres også flere kerneproteiner, som spiller en afgørende rolle i cellecyklusprogression fra G1 til S-fase. Konkret har cyklin D1 blevet identificeret som en central nedstrøms effektor af EGFR-signalering i resistente NSCLC celler. Desuden EGFR mutant NSCLC celler har højere ekspression af cyclin D1 [31]. Behandling af NCI-H441 og SK-MES-1 NSCLC celler med delphinidin (5-60 uM, 48 timer) resulterede i en signifikant reduktion af cyclin D1 proteinekspression i en dosisafhængig måde (figur 2C). PCNA er en kendt markør for cellulær proliferation aktive under S- og G2 faserne af cellecyklussen og spiller en vigtig rolle i initieringen af ​​celleproliferation [32]. Den forøgede ekspression af PCNA hos cancerpatienter er blevet associeret med en dårlig overlevelsesrate. Derudover EGFR fungerer også som en transkriptionsfaktor og forbedrer celleproliferation ved at aktivere og stabilisere PCNA [33]. Vi undersøgte derfor effekten af ​​delphindin på PCNA udtryk og fandt, at det væsentligt reduceret PCNA protein udtryk i både NCI-H441 og SK-MES-1-celler (Figur 2C).

delphinidin behandling modulerer den Bcl2 familien proteinekspression og inducerer kløvning af caspaser og PARP i NCI-H441 og SK-MES-1 celler

Aktivering af PI3K /AKT og MAPK’er signalering ved EGFR resulterer i forøget celleproliferation og angiogenese, samt inhibering af apoptose. Behandling af EGFR overudtrykker NSCLC-celler med delphinidin resulterede i en signifikant inhibering af PI3K /AKT og MAPK’er signalveje. Vi næste undersøgt virkningerne af delphinidin på Bcl2 familie proteiner nedstrøms for PI3K /AKT. Behandling af NCI-H441 og SK-MES-1-celler med delphinidin stærkt reduceret ekspression af anti-apoptotiske proteiner, såsom Bcl2, Bd-XL og Mcl-1 (figur 3A). Desuden fandt vi, at ekspressionen af ​​pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax blev signifikant forøget i delphinidin behandlet NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 3A). Apoptose er en stærkt reguleret proces, der involverer en kaskade af begivenheder, herunder proteolytisk aktivering af caspaser. Inden for den apoptotiske proces caspaser kan fungere enten som initiativtagerne eller bødler. Bøddel caspaser aktiveres fra deres pro-enzymatisk form ved indvirkning af andre caspaser i en kaskade-reaktion. Når den er aktiveret, caspaser spalte en række intracellulære proteiner, såsom PARP og forskellige proteinkinaser [34]. Derfor vi næste undersøgt, om delphinidin behandling (5-60 uM; 48 timer) forårsagede aktivering af caspaser eller spaltning af PARP, som begge er kendetegnende for apoptose. Vi fandt, at delphinidinproduktion behandling resulterede i aktivering af caspase-9, caspase-3 og den deraf følgende spaltning af PARP i både NCI-H441 og SK-MES-1cells (figur 3B)

[A B] NCI-H441 og SK-MES-1-celler blev behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for at bestemme dets virkning på ekspression af Bcl2 familie proteiner og spaltning af caspaser og PARP. Efter behandling blev cellerne høstet, blev cellelysater fremstillet og protein blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotanalyse og kemiluminescensdetektion. Lige belastning af protein blev bekræftet ved stripning immunoblot og Fornyet probing det for β-actin. De viste her immunblots er fra et repræsentativt forsøg gentaget tre gange med lignende resultater.

delphinidin behandling hæmmer tumorgenicitet af humane NSCLC celler implanteret i athymiske nøgne mus

Siden effektivt delphinidin reduceret cellevækst og induceret apoptose af NSCLC celler

in vitro

, vi næste bestemmes virkningerne af delphinidin på en

in vivo

xenograft musemodel implanteret med NCI-H441 eller SK-MES-1cells. I athymiske nøgne mus implanteret med EGFR og VEGFR2 overudtrykkende NSCLC-celler, delphinidinproduktion behandling resulterede i signifikant inhibering af tumorvækst. Delphinidin behandlede mus implanteret med NCI-H441-celler viste signifikant tumorvækst inhibering (p 0,05-0,001) ved 27,92 og 45.37% ved en dosis på 1 og 2 mg /dyr sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe (figur 4A). Den gennemsnitlige tumor volumen af ​​kontrolgruppen var 1268.62 mm

3, mens de gennemsnitlige tumorvolumener i delphindin behandlede grupper var 914.38 mm

3 og 693.01 mm

3 i mus, som fik en og 2 mg /dyr delphinidinproduktion (figur 4A). Desuden delphinidinproduktion behandling resulterede også i signifikant tumorvækstinhibering i athymiske nøgne mus implanteret med SK-MES-1-celler. Behandling af delphinidin (1 og 2 mg /dyr) resulterede i 26,34 og 46.01% tumorvækstinhibering i forhold til kontrolmus. Disse resultater var statistisk signifikante (p 0,05-0,001). Gennemsnitlige tumorvolumen i delphinidin behandlede grupper var signifikant reduceret (913,42 mm

3 og 671.18 mm

3) i sammenligning med den ubehandlede kontrolgruppe (1241.18 mm

3) (figur 4B).

[A] Atten atymiske (

nu /nu

) kvindelige nøgne mus blev subkutant injiceret med 4×10

6 NCI-H441-celler (i 50 pi RPMI + 50 pi Matrigel) i hver flanke af musen til at indlede tumorvækst og derefter tilfældigt opdelt i tre grupper (seks mus i hver). Fireogtyve timer efter celleimplantation, mus af den første gruppe modtog i.p. injektion af DMSO (100 pi) og tjente som kontrol. Musene af gruppe 2 og 3 fik i.p. injektion af delphinidin 1 mg /dyr og 2 mg /dyr henholdsvis 100 pi DMSO tre gange /uge. [B] Lignende eksperimenter blev udført med SK-MES-1-celler. Når tumorer begyndte at vokse, blev deres størrelser måles og tumorvolumen blev beregnet ved formlen ½ (

L

1 ×

L

2 ×

H

), hvor

L

1 er den lange diameter,

L

2 er den korte diameter, og

H

er højden af ​​tumoren . Alle dyr blev aflivet, når tumorerne nåede et volumen på 1200 mm

3 i kontrolgruppen. Gennemsnitlige tumorvolumener af kontrollen og delphindin behandlede grupper blev afbildet over dage efter inokulation af tumorceller. Værdier repræsenterer middel ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,001 versus kontrolgruppen

delphinidin behandling hæmmer markører for spredning og inducerer apoptose i tumorer i athymiske nøgne mus implanteret med NSCLC celler

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​molekyler, der er forbundet med celleproliferation og apoptose i tumorxenoplantater ved at ansætte immunhistokemi. Som vist i figur 5, resultater histokemisk analyse af tumorsektioner viste, at der var et signifikant fald i antallet og intensiteten af ​​celleproliferationsmarkører såsom Ki67 og PCNA i delphinidin behandlede tumorer i forhold til deres respektive ubehandlede kontrolgrupper. Desuden når disse tumorer blev bedømt for farvning af aktiv caspase-3, et kendetegn for apoptose, fandt vi, at der var en signifikant stigning i antallet og intensiteten af ​​aktiv caspase-3-farvning i tumorer i delphinidin behandlede mus (figur 5A og 5B).

athymiske nøgne mus blev implanteret med [A] NCI-H441, og [B] SK-MES-1-celler. Mus blev behandlet med delphinidin, blev tumorvæv opsamlet i 10% formalin og blokke blev fremstillet i paraffin og immunfarvning af Ki67, PCNA og spaltes caspase-3 blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder”. Mikrofotografier viser repræsentative billeder fra tre uafhængige tumorprøver. Bar = 20 um.

delphinidin behandling hæmmer markører for angiogenese i tumorer i athymiske nøgne mus implanteret med NSCLC celler

Solide tumorer rekruttere nye blodkar for vækst, vedligeholdelse, og metastase. Derfor er anvendelse af midler, der undertrykker tumor-induceret udvikling af nye blodkar betragtes som en vigtig strategi til kræftbehandling. Derfor mange nuværende kliniske behandlinger målrette vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og CD31. Tumor snit farvet med anti-VEGF og anti-CD31-antistoffer viste nedsat intensitet af farvning i de delphinidin behandlede grupper. Denne undersøgelse viste tydeligt, at delphinidinproduktion behandlingen reducerede ekspression af VEGF og CD31 sammenlignet med tumor sektioner af kontrolmus (figur 6A og 6B).

athymiske nøgne mus blev implanteret med [A] NCI-H441, og [ ,,,0],B] SK-MES-1-celler. Mus blev behandlet med delphinidin, blev tumorvæv opsamlet i 10% formalin og blokke blev fremstillet i paraffin og immunfluorescens af CD31 og immunohistokemi af VEGF blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder”. Mikrofotografier viser repræsentative billeder fra tre uafhængige tumorprøver. Bar = 20 pm

Diskussion

Der har været store fremskridt i at udrede mysterier kræft genetik og biologi.; Men den vigtigste opgave er at omsætte disse opdagelser til nye lægemidler, der vil forbedre patienternes resultater. Målrettede behandlinger er fremtiden for cancerbehandling og udvikling af nye terapeutiske inhibitorer af signaltransduktionsmolekyler, især RTK, er fokus for omfattende forskning. Overekspression og afvigende aktivering af RTK såsom EGFR og VEGFR2 er forbundet med højere opformeringsrater, reduceret apoptose, forøget angiogenese og metastase [35]. De præsenterer således et attraktivt mål for lægemiddeludvikling mod NSCLC [36,37].