PLoS ONE: Multiplex PCR og Next Generation Sequencing for ikke-invasiv Påvisning af Blære Cancer

Abstrakt

Baggrund

Meget følsom og specifik urin-baserede tests til at detektere enten primær eller tilbagevendende blære kræft har vist sig undvigende til dato. Vores stadigt stigende kendskab til de genomiske afvigelser i blærekræft bør muliggøre udviklingen af ​​sådanne tests baseret på urin DNA.

Metoder

DNA blev ekstraheret fra urin cellepellets og PCR bruges til at forstærke regionerne af

TERT

promotor og kodende regioner af

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

KDM6A

RXRA

som ofte muteret i blærekræft. PCR-produkterne blev barcoded, samlet og parret udgang 2 x 250 bp sekventering udført på et Illumina MiSeq. Urinary DNA blev analyseret fra 20 ikke-kræft kontroller, 120 primær blære kræftpatienter (41 PTA, 40 pT1, 39 pT2 +) og 91 blære kræftpatienter post-TURBT (89 kræft-fri).

Resultater

på trods af de små mængder DNA ekstraheret fra nogle urin cellepellets, 96% af prøverne gav betyde læste dybder 500. Analyse kun tidligere rapporteret punktmutationer,

TERT

mutationer blev fundet i 55% af patienter med blærekræft (uafhængige af scenen),

FGFR3

mutationer i 30% af patienter med blærekræft,

PIK3CA

i 14% og

TP53

mutationer i 12% af patienter med blærekræft. Samlet set blev der påvist disse tidligere rapporterede blære kræft mutationer i 86 ud af 122 patienter blærekræft (70% følsomhed) og i kun 3 ud af 109 patienter uden påviselig blærekræft (97% specificitet).

Konklusion

Denne enkle, omkostningseffektive fremgangsmåde kunne anvendes til ikke-invasiv overvågning af patienter med ikke-muskel-invasiv blære kræft huser disse mutationer. Metoden har et lavt DNA input og kan detektere lave niveauer af mutant-DNA i et stort overskud af normalt DNA. Disse gener udgør en minimal biomarkør panel, som ekstra markører kunne tilføjes til at udvikle en meget følsom diagnostisk test for blærekræft

Henvisning:. Ward GD, Baxter L, Gordon NS, Ott S, Savage RS, Beggs AD et al. (2016) Multiplex PCR og Next Generation Sequencing til ikke-invasiv påvisning af blærekræft. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10,1371 /journal.pone.0149756

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIEN

Modtaget: September 21, 2015; Accepteret: 4 februar 2016; Publiceret: 22 feb 2016

Copyright: © 2016 Ward et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Procentdelen af mutant lyder blev anvendt som input til alle grafer, følsomheder, særtræk osv, og disse præsenteres for hvert locus i hver prøve i S2 tabel

Finansiering:. Dette projekt blev finansieret af en Wellcome Trust følger -on-fond tilskud administreres af universitetet i Birmingham. BCPP er finansieret af Cancer Research UK, University of Birmingham og Birmingham og The Black Country og West Midlands Nord og Syd Omfattende Lokal Research Networks, og sponsoreret af University of Birmingham. Den BCPP biospecimen kollektionen er støttet af midler fra Birmingham ECMC. DGW er finansieret af en filantropisk donation til universitetet i Birmingham til støtte for blærekræft forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : NGS, næste generation sekventering; UBC, urotelial blærekræft; NMIBC, non-muskel invasiv blærekræft; MIBC, muskel-invasiv blærekræft

Introduktion

Fleksibel cystoskopi, kombineret med urin cytologi, er guld standard tilgang til påvisning blæretumorer. Langsigtet overvågning for tilbagefald efter behandling er både belastende for patienterne og dyrt for leverandører af sundhedsydelser. Det har længe været håbet, at en test baseret på molekyler frigives til urin ved tumorceller kan reducere afhængigheden af ​​cystoskopi, men til dato tilstrækkeligt følsomme og specifikke test er ikke blevet udarbejdet og vedtaget af klinikere [1].

Eksisterende urin biomarkører for blærekræft som NMP22 og BTA mangler følsomhed for lav kvalitet sygdom og kan være falsk forhøjede grund af ikke-maligne tilstande og hæmaturi [1]. er blevet brugt en stor indsats på at opdage urin biomarkører for non-invasiv påvisning af blærekræft med særlig succes opnås måling tumor specifikke nukleinsyre varianter [2,3,4]. Seneste genomiske og transkriptom eksperimenter har vist, at lav kvalitet NMIBC og CIS /HG-NMIBC /MIBC har forskellige mutation og genekspressionsprofiler og at selv inden eksisterer NMIBC betydelig heterogenitet (revideret i [5]). , Synes således det sandsynligt, at et panel af biomarkører som indfanger mangfoldigheden af ​​UBC vil være forpligtet til detektere sygdom.

Urin tests baseret på DNA viser betydelig lovende for non-invasiv påvisning af UBC. I teorien hvis tumor-DNA er til stede, kan amplificeres ved PCR og cancerspecifikke ændringer detekteres. To af de hyppigst muterede gener i blærekræft med punkt-mutation hotspots er

FGFR3

[6] og

TERT

[7,8,9,10]. Begge er blevet vurderet som biomarkører til detektering blærekræft i urin DNA i separate undersøgelser [7,11,12], men de er ikke blevet kombineret i en NGS-baserede assay.

TERT

promotor er muteret i ca. 65% af blæretumorer uanset scenen og kvalitet [13] og repræsenterer det bedste enkelt biomarkør for blærekræft med en nylig rapport på 62% sensitivitet på 90% specificitet til påvisning af primær blæretumorer [7].

Vi har nu udviklet et assay, der bruger høj-thoughput dybe sekventering af regionerne i 6 UBC associerede gener, som indeholder mutation hotspots og analyseret urin DNA fra 232 patienter for at vurdere det evne til at non-invasivt detektere UBC. Teoretisk skulle dyb sekventering detektere endog meget lave niveauer af tumor-DNA i et stort overskud af ikke-tumor-DNA. Desuden er denne teknologi modnes til det punkt, hvor det bliver en rutine tilgang i kliniske genetiske prøvningslaboratorier.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle prøver blev opnået efter skriftligt informeret samtykke og godkendelse af de relevante britiske nationale forskningsetik anmeldelse boards (national Research Ethics service referencer angivet nedenfor); blev afholdt underskrevne samtykke formularer inden for de enkelte patientjournaler, med samtykke dokumenteres i de relevante undersøgelse databaser.

UBC og ikke-UBC patienter blev indsamlet som en del af blærekræft Prognose programmet BCPP (NRES Udvalg East Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), som indarbejdet fremadrettet biospecimen kollektion for biomarkør forskning

En anden urinopsamling (NRES Udvalg Nordvest-Haydock:. 15 /NW /0079) blev foretaget fra patienter, der gennemgår overvågning efter TURBT for NMIBC

patienter

Urin blev indsamlet fra tre grupper af patienter:. »ikke-UBC ‘,’ UBC” og “post-UBC«. UBC og ikke-UBC patienter blev indsamlet som en del af West Midlands ‘Blærekræft Prognose program, 2005-11 (BCPP, beskrevet i detaljer her: [14]). Kort fortalt blev midstream urin (20-50 ml) indsamlet på tidspunktet for diagnosen fra patienter med cystoskopisk fund indikerer primær blærekræft; Urinen blev centrifugeret og pellet og supernatant opbevares ved -80 ° C. Efter prøvetagning hver patient gennemgik TURBT og endelig diagnose ved histopatologisk undersøgelse af resekterede væv. Da primær blære

carcinoma in situ

(CIS) er en sjælden læsion i BCPP kohorten og andre steder [15], patienter med primære CIS blev udelukket, da vi ikke havde et tilstrækkeligt antal til at kunne drage gyldige konklusioner. Nogle patienter rekrutteret til BCPP og som gav urinprøver blev efterfølgende diagnosticeret med non-maligne urologiske tilstande, og er inkluderet i undersøgelsen som »ikke-UBC ‘patienter.

Separat, en anden potentiel urinopsamling blev foretaget i West Midlands i løbet af 2012 fra en uafhængig gruppe af 91 patienter, der gennemgår overvågning efter TURBT for NMIBC, og udnytte den samme urinopsamling protokol. Med undtagelse af 2 patienter, alle patienter var sygdomsfri på datoen for urinopsamling ( “post-UBC ‘gruppe). De 2 patienter med tilbagevendende sygdom blev tilsat til UBC gruppe. Efterfølgende cystoskopi data var tilgængelige for 38 af de 89 “post-UBC ‘patienter, og viste ikke yderligere gentagelser på et gennemsnit af 8 måneder. DNA blev ekstraheret fra urin pellets under anvendelse urin DNA-isolering kits til eksfolierede celler og bakterier (NorgenBiotek.com) og elueret i 100 pi deioniseret vand.

PCR og stregkodesystem

En enkelt multiplex-PCR-amplifikation blev brugt til at forstærke 16 amplikoner i

TERT

promotor og kodende regioner af

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

RXRA

og

KDM6A

(primersekvenser i S1 tabel). PCR-metoden blev tilpasset fra Allory

et al

[7] som

TERT

promotor-regionen er svært at forstærke og indledende forsøg ved hjælp af flere andre polymeraser mislykkedes. PCR-amplifikationer bestod af 9 pi DNA, 10 pi KAPA2G Robust DNA Polymerase (KapaBiosystems) og 1 pi af primere (0,2 uM endelig for hver primer). PCR-programmet var: 95 ° C i 3 minutter, 35 x 95 ° C for 15s, 60 ° C for 15s, 72 ° C i 15s efterfulgt af 3 min ved 72 ° C (primersekvenser findes i Støtte Information, S1 Table ). PCR-produkterne blev fortyndet 1/100 med deioniseret vand og 10 bp stregkoder tilføjet af en anden 15 cyklus PCR under anvendelse KAPA2G Robust DNA Polymerase og enkelt retning adgang array-stregkoder til Illumina sequencers (Fluidigm).

sekventering og dataanalyse

De stregkodede PCR-produkter blev blandet og rengøres med AMPure perler. De samlede ampliconer blev derefter blandet 7: 3 med PhiX (Illumina), denatureret og grupperet på 6:00 på en Miseq 500 cyklus flow-celle og sekventeret (250 cyklusser fremad, 10 cykler stregkode, 250 cykler tilbage). Rå sporingsfiler blev behandlet med cutadapt (version 1.8.1, Python 2.6.6) i parret ende tilstand for at fjerne adapter sekvenser, og at bortfiltrere par med en sekvens 100 nt at udelukke korte læste artefakter. Lokale tilpasninger af læser til hg19 genomet blev udført ved hjælp bowtie2 (version 2.2.4) i parret ende mode. SAM alignment filer blev konverteret til BAM-filer, sorteres og indekseret ved hjælp samtools (version 0.1.19). BAM filer blev behandlet med bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), minimum basis tærskel kvalitet sat til 0 | 30 , at generere position-specifikke nukleotid målinger inden for de koordinater det amplificerede loci. Bam-readcount udgange blev behandlet med en brugerdefineret skrevet Perl script. Mutationer blev kaldt hvis et ikke-referencebasis var til stede i 3 læser og ved en frekvens på mellem 2,5 til 97,5% i begge retninger. Vi begrænset vores analyse til enkelte base-udskiftninger tidligere er rapporteret i UBC i COSMIC.

Sanger sekventering

Efter PCR udnytte de samme primere og samme BCPP urinprøver som for NGS, Sanger sekventering på et ABI 3730 sequencer blev udført for at give ortogonale bekræftelse af tilstedeværelse og fravær af

TERT

FGFR3

mutationer i 12 og 8 prøver, henholdsvis.

data tilgængelighed

Alle de nødvendige for replikering af data er inden manuskriptet. PCR primer sekvenser er vist i S1 tabel, og vi har brugt procentdel af mutant lyder som input for alle grafer, følsomheder, særpræg, etc, og disse præsenteres for hvert locus i hver prøve i S2 tabel.

Resultater

Optimering af NGS-amplicon sekventering på urin DNA

Når testet individuelt, alle 16 primerpar genereret den korrekte størrelse produkter. Primerne blev derefter kombineret og multiplex-PCR testet over en række template-koncentrationer (designet til at efterligne den variable mængde DNA opnået fra urin pellets): PCR arbejdede med den laveste DNA testet indgang (0,5 ng) og mængden af ​​produkt dannet var uafhængig af mængden af ​​DNA template mellem 2 og 50 ng (50 ng værende den højeste testede input). I dette eksperiment næste generation sekventering af multiplex-PCR-produkter gav et gennemsnit på 6000 læser pr amplikon; selv for prøver, hvor mindre end 1 ng DNA blev anvendt, læse dybder gennemsnit 4000 (S1 Fig). Titrering af DNA ekstraheret fra blæren cancercellelinier MGH-U3 (

FGFR3

mutant) og SW-780 (

TERT

promotor mutant) i wtDNA viste, at procentdelen af ​​mutant læser pålideligt afspejlede procentdel af mutant DNA til at ligge under tærsklen på 2,5% bruges her (S2 fig). Endvidere analysen af ​​kimcellelinje DNA fra 6 BCPP patienter uden UBC demonstreret, en gennemsnitlig “falske positive” læs frekvens på 0,20% ± 0,28 ved mutation loci beskrevet nedenfor.

Vand blanks (n = 37) blev kørt i randomiseret brønde sammen urinen DNA-prøver for at teste for forurening, som kunne generere falske resultater, især for urinprøver med lave DNA-koncentrationer. Den gennemsnitlige læse dybde i vandet blanks var 160 (mindre end 3% af den gennemsnitlige læser dybden i prøverne). Prøver med lave DNA-koncentrationer og giver en gennemsnitlig læse dybde 500 blev ekskluderet fra undersøgelsen. Dette førte til udelukkelse af 10 prøver ud af 242, dvs. analysen fungeret tilfredsstillende i 96% af prøverne. Patientinformation for de resterende 232 patienter er vist i tabel 1.

NA: ikke anvendelig, NK:. Ikke kendt

Påvisning af mutationer i urin DNA

Vi har registreret 34 tidligere rapporterede (COSMIC) mutationer i vores patient kohorte. Nærmere oplysninger om disse mutationer og læse dybder på disse loci er vist i S3 tabel.

TERT

promotor- mutationer blev påvist i urinen fra 67 ud af 122 UBC patienter (55%). Procenterne i fase PTA, PT1 og pT2 + UBC var 56, 63 og 44%, henholdsvis (figur 1).

TERT

mutationer blev også påvist en ud af 20 ikke-UBC patienter og hos 1 ud af 89 post-UBC patienter.

TERT

mutationer blev også fundet i 2 patienter ud af 2 med tilbagevendende UBC. Procentdelen af ​​læser støtter tilstedeværelsen af ​​mutationen varierede fra 5% til 50%, hvilket viser, at forholdet mellem tumor og normalt DNA i urinen er ganske variabel. Den korrekte påvisning af

TERT

mutationer blev bekræftet af Sanger sekventering i flere patienter med 40% mutant læser (figur 2)

Grafen viser procentdelen af ​​mutant læser i hver patient. prøve overvejer punktmutationer ved stillinger CHR5: 1.295.228, CHR5: 1295242/1295243 og chr:. 1.295.250

Panel a er et screenshot fra IGV viser andelen af ​​mutant (grøn) og vægt (brun) bund kræver tre urin DNA (omkringliggende vægt sekvens i gråt). Sanger sekventering af de samme tre urin DNA’er er vist i panelerne B: prøve 661 (CHR5: 1.295.250 G A), C: prøve 857 (5: 1.295.228 G A), og D: prøve 576 (CHR5: 1.242 243 G . A)

Mutationer i

FGFR3

blev påvist i 36 urin DNA fra patienter med UBC (30%) og med den højeste frekvens i NMIBC (procenter i fase pTA, Pt1 og pT2 + UBC var 41, 30 og 15%, henholdsvis (figur 3)).

FGFR3

mutationer blev også fundet i en post-UBC patient, og i en af ​​de 2 patienter med tilbagevendende UBC. Som med

TERT

, mutationer blev bekræftet ved Sanger-sekventering i adskillige prøver med en høj procentdel af mutant læser (data ikke vist).

Individuelle patienter er listet langs x-aksen som angivet og hyppigheden af ​​mutant læser på komisk loci er vist for den enkelte.

Mutationer i

PIK3CA

blev fundet i urinen af ​​17 patienter med UBC (14%) på tværs af alle faser af sygdom (procenter i fase pTA, PT1 og pT2 + UBC var 12, 18 og 10). En

PIK3CA

mutation blev fundet i urinen af ​​en post-UBC patient. Mutationer i

TP53

blev fundet i urinen af ​​15 patienter med UBC (12%) med den højeste frekvens i MIBC (procenter i fase PTA, PT1 og pT2 + UBC were5, 13 og 21%. Mutationer i

RXRA

,

HRAS

KDM6A

blev påvist i urinen af ​​7, 1 og 0 patienter med UBC henholdsvis. Alle udskiftninger var ikke-synonym med undtagelse af 1 i

FGFR3

og dem i

TERT

promotor. den komplette liste af mutationer fundet i undersøgelsen er vist i S2 tabel. i alt 145 mutationer blev påvist i 122 UBC patienter og 4 i 110 patienter uden for tiden påviselig UBC.

Udnyttelse mutationer i urin DNA til påvisning UBC

fordelingen af ​​mutationer i UBC patienter i denne undersøgelse er vist i fig 4. Hvis vi bruger tilstedeværelsen af ​​en eller flere mutationer til påvisning UBC, så

TERT

er de mest informative (67 kræftformer opdages), med

FGFR3

afsløre yderligere 12 sager,

RXRA

yderligere 3 tilfælde, og

TP53

PIK3CA

hver afsløre yderligere 2 sager. Denne tilgang registrerer 86 kræfttilfælde ud af 122, med mutationer detekteret i 3 ud af 109 patienter uden UBC (70% sensitivitet og 97% specificitet). Dette ‘test’ er scenen agnostiker med følsomhed på 70, 70 og 69% for fase PTA, PT1 og pT2 + UBC hhv. detekteres mutationer i et tilsvarende antal grad 1 og 2 tumorer (72%) ved sammenligning med grad 3 tumorer (68%), og der er ingen tilsyneladende sammenhæng mellem tumorstørrelse eller tumor nummer og test nøjagtighed (S3 Fig og S4 tabel, henholdsvis). Hvis testen tærskel øges til kræve mutationer i 2 gener for at indikere tilstedeværelsen af ​​UBC, følsomhed falder markant til 34%, men specificiteten forøges til 100%.

Hver kolonne repræsenterer en individuel patient. Oncoprint repræsentation genereret på https://www.cbioportal.org/.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi vist, at mutationer i flere gener kan let påvises i urinen DNA ved hjælp af en PCR og NGS tilgang. Selvom tidligere undersøgelser har brugt NGS at analysere

FGFR3

mutationer i urin DNA [16] og til at analysere

TERT

promoter mutationer i urin DNA [17], har vi nu udviklet en metode muliggør en enkelt analyse til at måle både urin biomarkører og andre. Det er muligt at multiplex hundredvis af prøver til en enkelt sekventering køre, hvilket gør analysen omkostningseffektiv når prøver analyseres i partier: 5 USD /euro sekventering pris pr test (på tidspunktet for skrivning). Således, for at opnå lav-omkostninger og korte ekspeditionstider, ville prøverne skulle sendes til et centralt laboratorium; sådan infrastruktur findes allerede i England og andre steder. NGS muliggør påvisning af et lille antal tumor DNA-molekyler fortyndet i et overskud af ikke-tumor-DNA, som ikke let opnås med analog sekventeringsmetoder eller målrettede tiltag såsom Snapshot og Massarray. Det er stadig uvist, om at være i stand til at identificere meget lave niveauer af tumor-DNA er en fordel i indstillingen overvågningen, da det er sandsynligt, at tumorer, der er for små til at opdage eller behandle frigive nok mutant DNA til at returnere et positivt resultat ( “foregribende diagnose ‘ [7]). I vores undersøgelse af primære tumorer, procentdelen af ​​

TERT

FGFR3

læser indeholder mutationer varierede kontinuerligt fra målbart til 50% af det samlede læser. Selvom meget variable mellem enkeltpersoner, i gennemsnit i UBC patienter hvor der blev fundet en mutation, 20% af den læser blev den mutante allel tyder på, at ca. 40% af urin cellepellet DNA stammer fra tumoren, selv i PTA UBC.

Selvom

TERT

FGFR3

er bemærkelsesværdigt gode biomarkører for UBC grundet høj forekomst og fokusering af punktmutationer ved hotspots, mutationerne i andre gener almindeligvis muteret i blærekræft er ikke grupperet på en sådan måde [18], og er derfor mere udfordrende at detektere-meget mere DNA skal sekventeret således, at PCR og sekventering fejl og ikke-blærekræft specifikke ændringer, kan give falske positive resultater. Selv vil blive krævet en multimarkør panel til høj følsomhed afsløring sygdom (en mere omfattende panel, end vi oprindeligt har vurderet her), bør panelet ikke være større end højst nødvendigt, bør anvende metoder med meget lave fejlprocenter, og kan kræve parallel sekventering af germlinie DNA.

TERT

promotor er meget GC rig og vist sig vanskeligt at forstærke med flere forskellige polymeraser indtil vi brugte KAPA2G (for både mål forstærkning og stregkode inkorporering).

En af de mest markante resultater rapporteret her er, at assayet arbejdede for 96% af urinprøver, og selv på prøver, hvor mængden af ​​DNA ekstraheret fra urin pellets er for lav til at kvantificere med traditionelle midler ( 1 ng). De 10 prøver, som ikke giver tilstrækkelig læse dybde alle havde meget lave koncentrationer og var fra patienter uden påviselig UBC eller PTA sygdom. For at lette, når man analyserer så mange prøver vi brugte kun 9 ul af 100 ul af DNA ekstraheret 30-50 ml urin stedet for at koncentrere de mere fortyndede prøver, og det bør derfor være muligt at forbedre succesraten i fremtiden ved at indsamle mere urin og eluering af DNA’et i et mindre volumen. Mange assays, såsom dem, der kræver bisulfit konvertering, ville mislykkes på mange flere af prøverne med lavt DNA-indhold. Et andet vigtigt resultat er den meget høje specificitet af vores panel af mutationer, som kan gøre dette specifikke “prøve” nyttig i nogle scenarier trods af den beskedne følsomhed; dog mere sandsynligt vores tilgang vil blive tilpasset for at forbedre følsomheden. Den tredje vigtige resultat er påvisningen af ​​70% af PTA tumorer (med høj specificitet mod kontrol virkelige verden), som synes bedre end de fleste biomarkører rapporteret til dato.

Vi accepterer en række begrænsninger til denne undersøgelse. For det første den samlede følsomhed c.70% er betydeligt under c.90% følsomhed fleksibel cystoskopi [19]; Derfor ville denne ikke-invasiv test skulle justeres, (sandsynligvis ved tilsætning af flere mutationer og deres amplikoner), før den kan betragtes som et supplement eller erstatning for enten diagnostisk eller overvågning cystoskopi. For det andet givet prævalensen (versus incidens) af NMIBC, anvendelsen af ​​en sådan test er mere klinisk relevant til detektering tilbagefald i indstillingen overvågningen; dog skal det bemærkes, at sagerne i vores undersøgelse er overvejende hændelse UBCs og at tilbagevendende tumorer kan være mere udfordrende at opdage [20]. Endelig blev de fleste af de 110 “kontrol” prøver anvendes til at vurdere specificitet opnået fra en separat gruppe af patienter, der gennemgår NMIBC overvågning ( “post-UBC ‘, n = 89), selv om 20’ ikke-UBC prøver fra BCPP undersøgelse repræsenterer patienter, som havde symptomer på UBC (overvejende hæmaturi), men der var kræft-fri på yderligere urologisk vurdering. Fremtidige valideringsundersøgelser vil bestræbe sig på at opnå langsgående urinprøver fra en enkelt kohorte af patienter, fra første diagnose gennem overvågning, og til at sammenligne eller evaluere kombination af NGS mutation analyse med urin cytologi.

Konklusioner

Vi har med succes analyseret flere UBC-associerede mutationer i urinen cellepelleten DNA ved NGS. Metoden fungerer godt på næsten alle urinprøver, også dem, hvorfra det er kun muligt at udvinde et par nanogram DNA. Følsomheden af ​​vores valgte mutation panel til påvisning af UBC var ca. 70% på tværs af alle faser af UBC og de udvalgte gener bør indgå i en sådan DNA-baseret biomarkør panel til påvisning blærekræft, men yderligere genetiske eller epigenetiske markører [7,11, 12,21,22] kan være behov for en generel anvendelse test.

Støtte Information

S1 fig. Afhængigheden af ​​PCR-NGS resultater på mængden af ​​input DNA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s001

(PPTX)

S2 Fig. Påvisning af varierende niveauer af mutation

FGFR3

TERT

DNA i et overskud af wtDNA.

Hver graf viser resultaterne af PCR-NGS analyser af en serie af 2-folds fortyndinger af mutant DNA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s002

(PPTX)

S3 fig. Oncoprint repræsentation af de fundne i urin DNA i patienter med grad 1 grad 2 UBC og grad 3 UBC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s003

(PPTX)

S1 Table. Primer sekvenser for PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s004

(XLSX)

S2 Table. . Forekomst af mutationer i urin DNA

Data er præsenteret som en procentdel af mutant læser ved hvert locus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s005

(XLSX)

S3 Table. Resumé af mutation koordinater, konsekvenser og læse dybder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s006

(XLSX)

S4 Table. Oversigt over tumor størrelse og mangfoldighed og test nøjagtighed

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149756.s007

(XLSX)

Tak

Vi takker alle West Midlands Konsulent urologer og deres enheder, der er involveret med BCPP, samt BCPP forskning sygeplejersker og Margaret Grant, Deborah Bird, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman og Eline van Roekel. BCPP er finansieret af Cancer Research UK, University of Birmingham og Birmingham og The Black Country og West Midlands Nord og Syd Omfattende Lokal Research Networks, og sponsoreret af University of Birmingham. Den BCPP biospecimen kollektionen er støttet af midler fra Birmingham ECMC. Dette projekt blev finansieret af en Wellcome Trust follow-on-fond tilskud administreres af universitetet i Birmingham. DGW er finansieret af en filantropisk donation til universitetet i Birmingham til støtte for blærekræft forskning.