PLoS ONE: tarmkræft Mimic organisatoriske struktur Normal Colon Cryptocoryner

Abstrakt

Colon krypter er stereotype strukturer med tydelig stamcelle, prolifererende og differentierende rum. Kolorektal kræft stammer fra colon krypt epitel, men derimod danne morfologisk disarrayed kirtler. I denne undersøgelse undersøgte vi i hvilket omfang kolorektal kræft phenocopy colon krypt arkitektur og dermed bevare den strukturelle organisering af den normale tarm epitel. En undergruppe af coloncancerformer viste krypt-lignende rum med høj WNT aktivitet og nuklear β-Catenin ved den forreste tumor kant, tilstødende proliferation og forøget cytokeratin 20-ekspression i de fleste differentieret tumor epiteler af tumoren center. Denne arkitektur stærkt afhængig af vækstbetingelser, og var fuldt reproducerbar i muse-xenotransplantater af dyrkede og primære kolon kræftceller. Fuld krypt-lignende organisation blev forbundet med lav tumorklassificering og var en uafhængig prognostisk markør for bedre overlevelse i en samling af 221 colorektale cancere. Vores resultater tyder på, at fuld aktivering af konserverede tarm morfogenetiske programmer i tyktarmskræft kræver

in vivo

vækstmiljøer. Endvidere blev krypt-lignende arkitektur forbundet med mindre aggressiv tumor biologi, og kan være nyttigt at forbedre de nuværende tyktarmskræft klassificering ordninger

Henvisning:. Cernat L, Blaj C, Jackstadt R, Brandl L, Engel J, Hermeking H, et al. (2014) tarmkræft Mimic organisatoriske struktur Normal Colon Cryptocoryner. PLoS ONE 9 (8): e104284. doi: 10,1371 /journal.pone.0104284

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: April 6, 2014 Accepteret: 7 jul 2014; Udgivet: 11 August, 2014

Copyright: © 2014 Cernat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Støttet af en bevilling fra Wilhelm Sander-Stiftung (til DH) og Den Europæiske Socialfond-Projekt 107 /1.5 /S /78702 (til LC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) stammer fra normal colon mucosa ved en velkarakteriseret, trinvis akkumulering af mutationer, transformere normale epitelceller i tumorceller med malign adfærd [1]. Normal colon mucosa er ganske enkelt organiseret, dybest set som et ark af epitelceller med infoldings danner stereotype krypter [2]. Hver Krypten indeholder distinkte funktionelle rum med stamceller på krypten basen, der er ansvarlige for løbende fornyelse af alderen epitelceller, en prolifererende transit forstærkende zone strækker sig til midten af ​​krypten, og mest modne epitelceller mod krypten apex [3]. Eksperimentelle data, primært stammer fra murine små tarm krypter, tyder høj kanoniske WNT signalering aktivitet i knoglemarven ved krypten basis [4], [5], mens modne celler ved de krypt apex er karakteriseret ved ekspression af differentiering markører, såsom som Cytokeratin 20 (CK20) [6].

i modsætning til normal colon mucosa, organisatoriske struktur CRC er langt mindre godt forstået. CRCs danne tumorer snarere end plader af celler, med varierende grader af morfologisk disarrayed epiteliale [7] kirtler. Men disse tumorer ikke at være fuldstændig uorganiseret. En gradient mellem mindre differentierede tumorceller ved den forreste tumor kant, og flere glandulær differentierede celler i tumoren center kan observeres i de fleste CRCs [8], [9]. Desuden tumorceller ved den forreste tumor kant typisk udtrykke stærk nuklear β-catenin indikerer høj WNT signaleringsaktivitet, og er blevet ubestridt at repræsentere en stamcelle population af operationelt definerede tyktarmskræft stamceller [10], [11]. Tværtimod blev udtryk for CK20 foreslået at mærke mere differentierede kolon kræftceller, da dens udtryk var gensidigt udelukkende med formodede tyktarmskræft stamcelle markører [11], [12]. Kollektivt antyder disse data, en vis grad af strukturel organisation inden CRC, med cancer stamceller ved den forreste tumor kant og differentiering mod tumoren center.

I betragtning af disse resultater og kendte rum inden intestinale krypter, vi heri undersøgt, til hvilket omfang CRC’er phenocopy normale colon krypter. Vi kategoriserer graden af ​​krypt-lignende arkitektur i en kolorektal cancer tilfælde kollektion med langsigtede opfølgende data og vise, at

in vitro

in vivo

vækstbetingelser stor indflydelse på denne strukturelle organisation .

Materialer og metoder

Histologi og Immunhistokemi

Formalin fast, paraffin indlejret normal menneskelig colon mucosa, primære CRC væv, xenotransplantattumorer og Matrigel indlejret tumor celle sfæroider blev skåret i 5 um snit, deparaffineret, og antigener blev hentet i TRS6 (Dako Cytomation) i 20 min i en mikrobølgeovn. Vedhængende kulturer af Caco2 og SW1222 celler blev dyrket på dækglas, fikseret i formalin og permeabiliseret i 2% Triton X-100. Slides eller dækning glider derefter inkuberet sekventielt med muse-anti-β-Catenin (BD Transduction Laboratories, 1:200), kanin anti-Ki67 (Cell Signaling, 1:200) og gede anti-CK20 (Santa Cruz Biotechnology; 01:50 ) i 1 time hver ved stuetemperatur, vasket med PBS, og derefter med FITC-konjugeret æsel-anti-ged (Jackson ImmunoResearch, 1:200), AlexaFluor 555 konjugeret ged anti-mus, og AlexaFluor 405 konjugeret gede-anti-kanin (Invitrogen; 1:500). Til visualisering af nuklear β-Catenin i normale colon-krypter blev kerner modfarvet med DAPI (Vector Laboratories). Konfokal fluorescens billeder blev taget på en LSM 700 laser scanning mikroskop ved hjælp af ZEN software (Carl Zeiss). Til konventionel og dobbelt immunfarvning, forud fortyndet muse-anti-β-Catenin (Ventana Medical Systems) og /eller muse-anti-CK20 (Progen; 1:200) blev anvendt, og farvning blev udført på en Ventana Benchmark XT automatiske farvningsanordning med Ultraview Universal DAB og alkaliske fosfatase afsløring kits (Ventana Medical Systems). Isotype-kontroller blev inkluderet for alle antigener.

Cell kultur og mus implanteret

Caco2 celler blev købt fra American Type Culture Collection og SW1222 celler blev opnået fra Ludwig Institute for Cancer Research (New York, USA). Adhærente cellekulturer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Biochrom), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 1 x penicillin-streptomycin. Sfæroide blev dyrket i StemPro embryonale SFM medium i nærvær af 20 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF (Life Technologies) i ultralave vedhæftede kolber (Corning). Vital væv af en sporadisk primær colonadenocarcinom blev erhvervet gennem Stiftung menneskelige Tissue Cell Research (HTCR, München, Tyskland), opdelt i enkelte cellesuspensioner hjælp collagenase IV (Worthington Biomedical) og DNase I (Sigma-Aldrich), som tidligere beskrevet [10], og udvidet i kugleformede kulturer. For yderligere analyser blev sfæroider af cellelinjer og primære tumorceller høstet ved centrifugering ved 200 g, resuspenderet i Matrigel, fikseret i paraformaldehyd, og derefter indlagt mellem HistoGel lag (ThermoScientific) for paraffinindlejring. For xenograft vækst, 10

6 celler fra adhærente cellekulturer eller 10

5 sfæroide-afledte primære tyktarmskræft celler blev suspenderet i 100 pi af en 1:01 blanding af PBS og vækstfaktor-depleteret Matrigel (BD Bioscience) før subkutan injektion i 6-8 uger gamle NOD /SCID (NOD.CB17-Prkdc

SCID, The Jackson Laboratory) mus. Dyr blev huset i patogenfrie micro-isolator bure og aflivet, når xenotransplantater nåede en diameter på 1 cm. Xenotransplantattumorer derefter blev fjernet, fikseret i formalin, og paraffin indlejret. Tre uafhængige xenotransplantater blev underkastet yderligere undersøgelser for hver cellelinje eller primær tumor. Eksperimentelle procedurer ved hjælp af dyr blev revideret og godkendt af Regierung von Oberbayern.

CRC prøvetagning og statistik

CRC prøver fra patienter, der undergik vilje helbredende kirurgisk resektion mellem 1994 og 2006 på LMU blev trukket fra arkiverne i patologisk institut. Opfølgende data blev registreret af München Cancerregisteret. Prøver og data blev anonymiseret, og behovet for samtykke er fastsat af institutionelle etiske komité af det medicinske fakultet i LMU. Inklusionskriterier blev lokaliseret kolorektale adenokarcinomer med fravær af nodal (n0) eller fjernmetastaser (M0) på tidspunktet for diagnosen (UICC fase I og II). Tumorvæv blev samlet ind i væv microarrays (TMAS) med 6 repræsentant 1 mm kerner, inklusive tumor kanter og tumor centre i hvert enkelt tilfælde. Den endelige samling bestod af 221 CRC tilfælde heraf i 41 tilfælde (19%) patienter var døde af deres tumor inden for follow-up perioden. Overlevelsesdata blev censureret, når sagen opfølgning blev afbrudt eller patienter var døde af andre end CRC grunde. Case egenskaber er opsummeret i tabel 1. TMA slides derefter blev underkastet enkelte og dobbelte farvninger for β-Catenin og CK20, som beskrevet ovenfor. Hele vævssnit enkelte tilfælde med heterogen β-Catenin og CK20 fordeling blev anvendt til tredobbelt immune fluorescens analyser. Cancer specifik overlevelse blev analyseret af Kaplan-Meier-metoden og grupper blev sammenlignet med log-rank test. Statistik blev beregnet ved hjælp af SPSS (IBM).

Resultater

Crypt-lignende funktionelle rum og akse dannelse i colorectal cancer

For at visualisere forskellige funktionelle rum inden for normal colon krypter og CRC’er, vi etableret tredobbelt immun fluorescens farvninger for β-catenin spredningsfølsomme relaterede Ki-67 antigen (Ki67) og Cytokeratin 20 (CK20). Som forventet, konfokal billeddannelse af normale colon krypter angivet WNT aktive rum med nukleare udtryk for β-Catenin på krypten base, en Ki67 udtrykker transit forstærkende zone af prolifererende epitel stamceller og mest differentierede epitelceller udtrykker CK20 mod krypter ‘spidserne (figur 1A). Især visualisering af svage, men distinkt nukleare β-Catenin ved krypt basen krævede store forstørrelser og let nuklear kontrastfarvning (figur 1A, figur S1). Vi derefter underkastet primære CRCs til samme triple farvning protokol. Svarende til tidligere resultater [8], [9], stærk nuklear ekspression af β-Catenin var begrænset til tumorceller ved den forreste tumor kant og omfattede morfologisk udifferentierede colon cancerceller infiltrerer omgivende stromale væv (figur 1B). Interessant og tværtimod nuklear β-catenin CK20-farvning var mest intens i mere central og glandulær differentieret tumor epiteler, tilstødende tumor nekrose (figur 1B). Ki67 fandtes mellem disse zoner og blev reduceret i tumorceller med stærke CK20 ekspression (figur 1B). Disse resultater viste, at på trods disarrayed kirtel dannelse, tyktarmskræft bevare en vis grad af strukturel organisation og dannelse akse findes i normale colon krypter.

Triple immun farvning for β-Catenin (βCat), Ki67 og CK20. (A) Colon krypter viser nukleare β-Catenin udtryk på deres base, Ki67 udvidelse til midten krypten, og CK20 i spidsen. Visualisering af nuklear β-Catenin kræves modfarvning med DAPI og høj forstørrelse (

venstre panel indsat

). Rød og blå bjælker afgrænse krypt dele med og uden nukleare β-Catenin hhv. (B) tarmkræft vise en lignende organisation med nukleare β-Catenin på tumoren kant (

pilespidser

), CK20 udtryk i tumoren centrum (

pile

), og Ki67 i mellem.

Scale barer

, 100 um.

xenograftmodeller af tyktarmskræft gengiver det fulde spektrum af krypt-lignende organisation

Dernæst analyserede vi en primær tyktarmskræft og tyktarmskræft cellelinjer under forskellige vækstbetingelser

in vitro

in vivo

. Tilhænger

in vitro

cellekulturer af SW1222 og Caco2 tyktarmskræft cellelinjer afslørede en vis grad af tumorceller heterogenitet for nuklear β-catenin Ki67 og CK20, der var mere fremtrædende i lav densitet end i sammenflydende kulturer (figur 2a- D). Low Density SW1222 kulturer udviste også nogle rudimentære centripetal aksedannelse med lidt forøget CK20 ekspression og reduceret Ki67-proliferation inden koloni centre, og stærkere nuklear β-Catenin farvning på kolonien kant (figur 2A). I Caco2-celler, differentiel ekspression af CK20 og nuklear β-Catenin optrådte mere tilfældigt fordelt (figur 2C). For at vurdere, om tredimensionelle vækst ville give højere grader af strukturelle organisering og tumorceller heterogenitet

in vitro

, vi dyrket både cellelinjer og primære kolon kræftceller som ikke-klæbende sphæroider. Svarende til vores resultater i vedhængende kulturer, observerede vi nogle tumorceller heterogenitet for alle tre markører (figur 2E-G). Men selv om den primære tyktarmskræft kugler viste svag centripetal akse formation med forøget central CK20 farvning (figur 2G), ingen fuld strukturel organisation, som vi havde fundet i den primære tyktarmskræft væv, blev observeret. Vi derefter injiceres både cellelinjer og primære kolon kræftceller i immun kompromitterede mus til subkutan tumordannelse

in vivo

. Tværtimod til vores

in vitro

resultater, disse tumorer dannet glandulær strukturer med fuld grader af tumor celle heterogenitet og distinkte nukleare β-catenin, Ki67 og CK20 positive rum (figur 2H-J), efterligner dem, der findes i primære CRCs, og minder om normal colon krypt arkitektur. Kollektivt, disse resultater viste, at tredimensionel vækst og omgivende stromavæv skal eksponere fuld tumorcelle heterogenitet og dannelse akse i CRCs.

Triple immunfarvning afslører mangel på fuld strukturel organisation i adhærente vævskulturer af (A) lav densitet og (B) konfluent SW1222, og (C) med lav densitet og (D) sammenflydende Caco2 colon cancerceller, såvel som i kugleformede kulturer af (E) SW1222, (F) Caco2, og (G) primære coloncancerceller . Tværtimod subkutane xenotransplantater af (H) SW1222, (I) Caco2, og (J) primær tyktarmskræft celler danner kirtler med organiseret udtryk for nuklear β-Catenin på tumoren kant (

pilespidser

) og CK20 udtryk i tumoren centrum (

pile

).

Scale barer

, 100 um.

Klassificering og kliniske relevans af krypt-lignende organisation i tarmkræft

For at bestemme hyppigheden af ​​krypt-lignende organisation i CRCs vi brugte et tilfælde samling af 221 primære tumorer og anvendt dobbelt immun farvning for β-Catenin og CK20, markerer begge yderpunkter af normale colon crypt rum. Analyser af disse tilfælde har vist 5 forskellige typer tyktarmskræft: Den største gruppe (type A) viste organiseret ekspression af nuklear β-Catenin ved den forreste tumor kant og forbedrede CK20 i tumoren centrum (figur 3). Af note dog ved undersøgelsen af ​​sager af denne type på serielle snit, observerede vi yderligere forbedret CK20 udtryk i de fleste infiltrative tumorceller i førende tumor kant, overlappende med nukleare β-Catenin i de fleste af disse tilfælde (Figur S2). De øvrige tumorer manglede denne organisation i nogen grad (figur 3), enten ved fravær af nuklear β-Catenin (type B), fravær af et forstærket CK20 i tumoren centrum (type C), fravær af nedsat nukleare β-Catenin i tumoren center (type D), eller fravær af både nukleare β-Catenin og CK20 udtryk (type E). Vi derefter undersøgt disse typer for foreninger med tumor specifik overlevelse. Interessant, Kaplan-Meier plot afsløret bedste resultat for CRC’er med fuld krypt-lignende strukturel organisation, baseret på nuklear β-Catenin og CK20 udtryk (type A), der var betydeligt bedre, når statistisk testet mod alle andre typer tilsammen (figur 4). Vi derefter undersøgt type A-tumorer for foreninger med andre kliniske variable og fandt en signifikant sammenhæng med lav tumor kvalitet, mens der ikke var nogen signifikant sammenhæng med andre variabler som alder, køn og T kategori (tabel 1). Endelig ved test type A-tumorer mod andre for overlevelse forudsigelse i multivariate analyser, fuld strukturel organisation viste sig at være en uafhængig prognostisk markør for bedre kræft specifik overlevelse (Tabel 2). Disse resultater viser, at CRCs efterligne krypt-lignende rum og dannelse akse i varierende grad og implicerer, at høj strukturel lighed med normale colon krypter kan være forbundet med mindre aggressiv tumor adfærd.

Dobbelt immunfarvning for β-Catenin (

brun

) og CK20 (

rød

). (Type A) Fuld strukturel organisation med nukleare β-Catenin på tumoren kant (

pilespids

) og CK20 inden tumoren center (

pil

). (Type B) Manglende nukleare β-Catenin. (Type C) Fravær af centrale CK20. (Type D) Fravær af nedsat nukleare β-Catenin i tumoren centrum. (Type E) Manglende både nukleare β-Catenin og CK20. Hyppigheden af ​​disse typer er angivet i tabellen.

(A) Kaplan-Meier plot for de forskellige typer af tarmkræft, som angivet med bogstaver på kurver. (B) Klasse A kolorektal cancer patienter (

øvre kurve

) viser signifikant (log-rank test) bedre overlevelse i forhold til andre typer (

nederste kurve

). Nøgletal om kurver angiver antallet af begivenheder i antallet af patienter i hver gruppe.

Diskussion

Her viser vi, at CRC’er phenocopy normal colon krypt arkitektur. I modsætning til normale krypter, disse tumorer vokser invasivt og danne morfologisk disarrayed kirtler [7]. Imidlertid kan adskilte rum med høj WNT aktivitet ved den forreste tumor kant, tilstødende proliferation og forøget CK20 ekspression mod tumoren center kan identificeres. Da normale colon krypter har en kendt WNT drevet stamceller ved på deres base, modning i epitelceller med stærke CK20 udtryk i spidsen [4] – [6], vores resultater støtter idéen om tyktarmskræft efterligner disse funktionelle rum, med kolon cancer stamceller ved førende tumor kant, og centripetale tumorcelledifferentiering, som tidligere blev hypotese [13]. Men vores data viser også væsentlige uoverensstemmelser til normal colon krypt arkitektur, da ikke alle CRC’er viste hele spektret af krypt-lignende opdeling. Desuden CRC’er med mærkbare rum ofte viste forbedret CK20 ikke kun i centrale tumor områder, men derudover på førende tumor kant, hvilket faldt sammen med stærke kernekraft β-Catenin og høj WNT aktivitet. Mens disse resultater implicerer, at morfogenetiske programmer intestinale epitelceller er stadig aktive i tarmkræft til en vis grad, markører for terminal differentiering i den normale tarm ikke nødvendigvis være begrænset til fuldt differentierede tumorceller af tarm neoplasmer.

Sammenligning forskellige kultur og vækstbetingelser kolon kræftceller, observerede vi fuldt udviklede og opdelte kirtelstrukturer i

in vivo

xenotransplantattumorer kun. Sammenfatning af strukturer, efterligner normal colon krypt arkitektur og gradient dannelse fuld af mindste og mest differentierede kolon kræftceller, kan derfor kræve signalering fra en tumor mikromiljø [8], [14], mangler i standard dyrkningssystemer. Disse resultater har stor betydning for undersøgelser, der fokuserer på specifikke tumor celle subpopulationer, da tumor celle sammensætning i regelmæssige eller sfæroide kulturer kan ikke i tilstrækkelig grad afspejler situationen i primære tumorer. Interessant men når dyrkes som xenotransplantattumorer, selv etablerede coloncancer cellelinier dannet fuldt udviklede krypt-lignende strukturer og opdeling, svarende til primære coloncancerformer. Dette antyder, at på trods af nogle forventede genetiske ændringer i passerede cellelinjer [15], under anvendelse coloncancercellelinie xenotransplantater kan ikke ligge under anvendelsen af ​​primære coloncancerformer til undersøgelser af tumor celle subpopulationer, såsom tyktarmskræft stamceller [12] , [16]. I denne sammenhæng vækstbetingelser

in vivo

kan være mere relevant end kilden til coloncancercelle, enten afledt fra etablerede kulturer eller primære tumorer.

Når man ser på foreninger med kliniske parametre, vi knyttet krypt-lignende strukturel organisering af CRC’er til forbedret overlevelse og lav tumor lønklasse. Mens prognosen for disse tumorer bedst kan estimeres ved mellemstation, der beskriver omfanget af sygdommen [17] har histopatologiske tumor sortering uafhængigt været forbundet med udfaldet sygdom og afspejler den samlede grad af tumorcelledifferentiering [18]. Adskillige klassificering systemer baseret på forskellige aspekter af tumor morfologi er blevet foreslået, men på grund af dårlig reproducerbarhed, en forenklet todelt system kun overvejer kirtel dannelse, er i øjeblikket begunstiget, og klassificerer disse tumorer i lave og høje kvalitet neoplasmer [19] . Selv om dette grading system er almindeligt accepteret og betragtes som en konsekvent prognostisk faktor ved College of American Pathologists, betyder det ikke at integrere forekomsten og fordelingen af ​​distinkte tumor celle subpopulationer, der kan indvirke på prognose. På den anden side, den seneste udvikling tilgange til vurdering CRC prognose, såsom stamcellemarkør ekspression [20], [21] eller microRNA profilering [22], hidtil enten mangler generelle accept eller har det forbehold at være bekosteligt og teknisk krævende. Da der i vores undersøgelse, krypt-lignende organisation fungerede godt til at forudsige resultatet sygdom, foreslår vi, at denne fremgangsmåde kan integrere morfologiske aspekter af kirtel formation med markører angiver funktionelle tumor rum. P-catenin og CK20 udtryk kan håndfast vurderes i tyktarmskræft prøver og integration af disse parametre i rutinediagnostik kan derfor forbedre histopatologisk tyktarmskræft grading. Ud over disse overvejelser, kan vores resultater også forklare tidligere inkonsistente data om kliniske korrelater til nuklear β-Catenin [23], [24], tumorcelleproliferation [25], [26], og CK20 ekspression i tyktarmskræft [27] , [28]. Hvis disse markører indikerer funktionelle og strukturelle rum inden for disse tumorer, er det muligt, at rummet organisation er mere relevant for tumor biologi og afspejles i klinisk resultat end simpel rum størrelse.

Støtte Information

Figur S1.

Øget WNT-aktivitet ved basis af normale colon krypter. Mens β-Catenin etiketter epitel cellemembraner som en del af adherensovergange, store forstørrelser indikerer yderligere nukleare β-Catenin udtryk ved krypten base (

sorte pilespidser

). Mangel på nukleare udtryk med dominans af blå kontrastfarvning ses i epitelceller over krypten base (

blå pilespidser

). .

Venstre panel

viser større forstørrelse af areal boxed i

højre panel

doi: 10,1371 /journal.pone.0104284.s001

(TIF)

Figur S2.

CK20 ekspression er ikke begrænset til tumoren centrum af type A kolorektale cancere. Serielle snit demonstrere, udover øget CK20 farvning i tumoren centrum (

pile

), forbedret farvning for CK20 mod tumoren kant, overlappende med nuklear β-Catenin (

pilespidser

). Dette mønster blev fundet i 61% af type A tarmkræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104284.s002

(TIF)

Tak

Vi er taknemmelige for A. Sendelhofert, A. Schäfer og M. Melz til eksperimentel bistand, og takke Stiftung humane væv og celler Research (HTCR) for at give tyktarmskræft væv.