PLoS ONE: Generation og Karakterisering af en Canine EGFP-HMGA2 Prostata Cancer In Vitro Model

Abstrakt

Den arkitektoniske transkriptionsfaktor HMGA2 er rigeligt udtrykt under fosterudviklingen. I flere maligne neoplasier, herunder prostatakræft, høj re-udtryk for

er HMGA2

korreleret med malignitet og dårlig prognose.

Lad-7

miRNA familien er beskrevet til at regulere

HMGA2

negativt. Den resterende del af

Lad-7

og

HMGA2

diskuteres til at spille en stor rolle i tumor ætiologi. For yderligere at analysere den rolle, HMGA2 i prostatakræft en stabil og meget reproducerbar

in vitro

modelsystem er forudsætning. Heri vi etableret en hunde CT1258-EGFP-HMGA2 prostatacancer-cellelinie stabilt overudtrykker HMGA2 forbundet med EGFP og desuden referencen cellelinien CT1258-EGFP udtrykker udelukkende EGFP at udelukke EGFP-inducerede virkninger. Begge rekombinante cellelinier blev karakteriseret ved fluorescensmikroskopi, flowcytometri og immuncytokemi. Den proliferative virkning af ektopisk overudtrykt HMGA2 blev bestemt via BrdU-assays. Sammenlignende karyotypebestemmelse af den afledte og de første CT1258 cellelinjer blev udført for at analysere kromosom konsistens. Virkningen af ​​ektopisk

HMGA2

udtryk på sin regulator

Lad-7a

blev analyseret ved kvantitativ real-time PCR. Fluorescensmikroskopi og immuncytokemi detekteret vellykket ekspression af EGFP-HMGA2 fusionsprotein udelukkende akkumulere i kernen. Genekspression analyser bekræftet

HMGA2

overekspression i CT1258-EGFP-HMGA2 i forhold til CT1258-EGFP og indfødte celler. Markant højere

Lad-7a

ekspressionsniveauerne blev fundet i CT1258-EGFP-HMGA2 og CT1258-EGFP. De BrdU analyser registreret en øget spredning af CT1258-HMGA2-EGFP celler i forhold til CT1258-EGFP og indfødte CT1258. De cytogenetiske analyser af CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 resulterede i en sammenlignelig hyperdiploid karyotype som beskrevet for indfødte CT1258 celler. For yderligere at undersøge virkningen af ​​rekombinant overudtrykte HMGA2 på CT1258 celler blev andre udvalgte mål, der er beskrevet at ligge til grund HMGA2 regulering screenet ud. Den nye fluorescerende CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinie er en stabil redskab, hvormed

in vitro

in vivo

analyser af HMGA2-medierede virkninger på celler og udviklingen og patogenesen af ​​prostatacancer.

Henvisning: Willenbrock S, Wagner S, Reimann-Berg N, Moulay M, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, et al. (2014) Generation og Karakterisering af en Canine EGFP-HMGA2 prostatakræft

In Vitro

Model. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10,1371 /journal.pone.0098788

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 7 maj 2014; Udgivet: 10 juni 2014

Copyright: © 2014 Willenbrock et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ingen tredje egne midler støttede denne undersøgelse. Undersøgelsen blev finansieret med den interne budget i Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hannover. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Hermed forfatterne bekræfter, at Jörn Bullerdiek, medforfatter inden tidligere kollaborative publikationer, er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker.

Introduktion

Ifølge de seneste globale statistikker kræft, prostatakræft er den næsthyppigste diagnosticeret kræft og sjette hyppigste dødsårsag blandt mænd i økonomisk udviklede lande [1]. Udover mand, hunden er de eneste kendte domesticerede pattedyrarter udvikler spontan prostatacancer med stor interesse [2].

I modsætning til situationen i mænd, forekomsten af ​​hunde prostata carcinomer er lav regnskab for 0,2 til 0,6% af canine neoplasier [3]. Men sygdommen er lokalt invasiv i begge arter med en sammenlignelig progression, metastatisk mønster og histopatologi [2], [4].

Den gennemsnitlige alder på diagnosetidspunktet hos hunde er ti år og dermed, overvejende påvirker ældre individer som det også rapporteret hos mænd [5] – [7]. I betragtning af den fysiologiske alder ved prostatakræft diagnose, den respektive levetid er ens mellem de to arter, der viser øget forekomst med alderen [6].

Hos mennesker prostatakræft er normalt en temmelig langsomt skrider kræft mens hunde prostata kræft vokser hurtigt, meget aggressiv og mindre differentieret præsentere en dårlig prognose [3], [8]. Kræft i hunde prostata ikke reagerer på androgen tilbagetrækning terapi ligner meste menneskelig dårligt differentieret, androgen prostatacancer [4], [9]. På grund af lighederne vedrørende præsentationen af ​​menneskelige og hunde prostatakræft, har hunden sidst været fokuseret som nyttige naturlige supplerende dyremodel for at vurdere nye prostatakræft behandlinger [10].

Tidlig påvisning af prostatakræft hos mænd er øjeblikket gøres ved anvendelse af etablerede biokemiske molekylære markører, såsom prostataspecifikt antigen (PSA) og prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) med betydelig succes.

i sammenligning med situationen hos mennesker, hos hunde prostatacancer diagnosticeres ved en meget sent sygdom etape på grund af fraværet af pålidelige prostata-specifikke biokemiske prognostiske markør værktøj og behandlingen forbliver palliativ da stadig ingen standard terapeutisk tilgang til behandling af hunde prostatakræft er tilgængelig [11], [12]. Selv om flere undersøgelser rapporterer immunoreaktivitet for human PSA i hunde ikke neoplastiske prostatavæv og prostatakræft, indtil nu PSA kunne ikke findes i plasmaet fra prostatacancer bærende hunde [9], [12] – [16].

derfor vil identifikationen af ​​pålidelige molekylære biomarkører, såsom PSA og PSMA hos mænd, der tillader en tidlig påvisning og pålidelig prognose af hunde prostatacancer være af væsentlig værdi for den fremtidige udvikling og evaluering af terapeutiske strategier samt en vurdering af behandlingsrespons [2].

i den forbindelse på højt Mobility-Group Protein A2 (HMGA2) blev for nylig fundet at tjene potentielt som prognostisk markør for hunde prostata neoplasier [17]. Heri analyse af en delmængde af forskellige hunde prostata vævsprøver viste klart, at ekspressionen af ​​

HMGA2

stiger markant i korrelation til den ondsindede klasse af vævsprøverne [17]. Endvidere

HMGA2

viste sig at tjene som en potentiel differentieringsmarkør af hunde maligne T- og B-celle-lymfom [18] og at være stærkt opreguleret i hunde oral pladecellecarcinom (upublicerede data).

Hos mennesker, en re-udtryk for

HMGA2

blev også fundet i forskellige ondartede tumorer, såsom leukæmi [19], [20], lymfom [18], brystkirtler [21], bugspytkirtel [22] , ikke-småcellet [23], oral planocellulært [24], og skjoldbruskkirtel carcinoma [25] er en indikator for dårlig prognose. I en nylig undersøgelse blev HMGA2 proteinekspression påvist at være signifikant højere i tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale væv [26]. Desuden er en

HMGA2

involvering i induktionen af ​​epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i human prostatacancer-cellelinie PC-3 blev [26].

Disse fund tyder at HMGA2 spiller en central rolle i forskellige tumor enheder, herunder prostatakræft inden begge arter kraftigt støtter

HMGA2

re-udtryk som en prognostisk tumormarkør.

generelt stærkt konserveret HMGA2 protein er rigeligt udtrykt under fosterudviklingen fungerer som en arkitektonisk transkriptionsfaktor i kernen [27], [28]. Inden for denne rolle, er HMGA2 bredt rapporteret at være involveret i en række cellulære processer, såsom genekspression, induktion af neoplastisk transformation, og fremme af metastaser [29], [30].

udtryk for

HMGA2

reguleres via mikro RNA’er (miRNA) i

lad-7

familie ved at binde til sekvenser lokaliseret i 3′-utranslaterede region (UTR) af transkriptet [31] – [35], som alle er konserveret i gnavere, hunde og kylling [36] – [38]. Binding af

Lad-7

miRNA til komplementære sekvenser regulerer post-transkriptionelt udtryk for

HMGA

2 på en negativ måde [31], [35], [39], [40]. For nylig en dereguleret

Lad-7

udtryk var forbundet med lunge [41], [42], bryst [43] og prostatakræft [44].

hunde prostata adenocarcinom afledt cellelinje CT1258 [45] – [47] anvendes inden for den foreliggende undersøgelse blev også analyseret for

HMGA2

markør ekspression af os afslører en stærk overekspression (upublicerede data). Dette resultat gør det muligt at hypotese, at en overekspression af dette mål gen sandsynligvis spille en vigtig rolle i hunde prostatakræft, fremme udbredelsen af ​​tumorceller.

For at verificere denne hypotese, tilgængeligheden af ​​stabile redskaber, der giver en vurdering af den beskrevet

HMGA2

–

lad-7

akse i prostatakræft

in vitro

og

in vivo

er forudsætning. Derfor har vi etableret stabilt transfekterede cellelinier af CT1258 giver en pålidelig

in vitro

system til at analysere de centrale aspekter af vores hypotese.

Vi analyserede de proliferative virkninger af rigeligt udtrykt rekombinant

HMGA2

på CT1258 celler. Derfor blev en stabil CT1258 cellelinie, der udtrykker rekombinant EGFP-mærkede HMGA2 (CT1258-EGFP-HMGA2) dannet ved anvendelse af en ekspressionsvektor konstruktion indeholdende den kodende sekvens (CDS) af hunde

HMGA2

gen mangler 5’UTR og 3’UTR og derfor ikke ligger til grund for direkte mekanismer negative regulering af

lad-7

[31].

for at vurdere funktionaliteten af ​​den rekombinante HMGA2 ekspressionsvektoren og til at overvåge den biologiske aktivitet af det rekombinante udtrykte HMGA2, et GFP-tag blev sat til

HMGA2

CDS genererer en HMGA2-GFP-fusionsproteinet. For at udelukke, at GFP protein har en virkning på celleproliferation, en yderligere stabil CT1258 cellelinje (CT1258-EGFP), der udtrykker udelukkende GFP blev genereret.

HMGA2

Lad-7a

ekspression blev bestemt via kvantitativ real-time PCR i CT1258-EGFP-HMGA2 og CT1258-EGFP sammenlignet med indfødte CT1258 celler.

Derudover udtryk for udvalgte direkte og indirekte HMGA2-mål som

HMGA1

[48],

SNAI1

[49],

SNAI2

og

CDH1

[49] blev analyseret.

for at karakterisere spredning af de beskrevne tre cellelinjer, BrdU inkorporering udførtes. Sammenlignende karyotype analyser af nyligt genererede og de første CT1258 cellelinier blev desuden udført for at identificere cytogenetiske ændringer muligvis opstår under plasmid integration i genomet af CT1258 under etableringen af ​​de stabile rekombinante cellelinjer.

Sammenfattende nye fluorescerende hunde CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinje giver et værdifuldt redskab til yderligere undersøgelser på HMGA2-medierede proliferative effekter og HMGA2 reguleringsmekanismer belyser udviklingen og patogenesen af ​​hunde prostatakræft. Som hunden repræsenterer en unik naturlig model for menneskelig prostatakræft, vil de indsigter vedrørende inddragelse af HMGA2 i hunde prostatakræft giver fordele for både, mennesker og hunde, om udvikling af terapeutiske strategier og vurdering af behandlingen succes.

Metoder

CT1258 cellelinje

de celle dyrkningsbetingelser samt karakteristika hunde prostata carcinom cellelinje CT1258 er tidligere beskrevet af os [45], [46 ].

pEGFP-C1

HMGA2

ekspressionsplasmid

protein kodende sekvens af hunde

HMGA2

blev opformeret ved PCR ved hjælp af primerpar EcoRI_sA2_lo ( 5′-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 ‘), BamHI_sA2_Up (5′-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3’). De opnåede PCR-produkter blev separeret på en 1,5% agarosegel, udvindes med QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland), ligeret i pEGFP-C1 vektorplasmid (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) og sekventeret for verifikation. Transfektion med pEGFP-C1-

HMGA2

konstruere fører til ekspression af et rekombinant EGFP-HMGA2 fusionsprotein, der forventes at være lokaliseret i kernen.

Generation of Fluorescent CT1258 cellelinier

transfektion af CT1258 celler.

300.000 native CT1258 celler blev podet i plader med 6 brønde 24 timer før transfektion og dyrket ved standardbetingelser ved anvendelse medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland) suppleret med 10% FCS (PAA Laboratories GmbH, Coelbe, Tyskland), og 2% penicillin /streptomycin (Biochrom AG, Berlin, Tyskland).

transfektionen blev udført ifølge fabrikantens instruktioner ved anvendelse 7.5 pi Mirus transit 2020 reagens (Mirusbio LLC, Madison, WI, USA) i 250 pi serum-reduceret Opti-MEM i medium (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) indeholdende 2,5 ug pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) eller rekombinant pEGFPC1-HMGA2 plasmid. Efter behandling blev cellerne inkuberet i 24 timer i dyrkningsmediet. Optagelsen og ekspressionen af ​​DNA blev verificeret ved fluorescens mikroskopi ved hjælp af en Leica DMI 6000B fluorescens mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Tyskland).

G418 selektiv antibiotikum drabskurve assay.

Før generation af fluorescerende CT1258 cellelinjer, titrering af den rette mængde af det selektive antibiotikum G418 (syn Geneticin;. Life Technologies, Darmstadt, Tyskland), der kræves for udvælgelse af CT1258 celler blev udført med en kill kurve assay. Forskellige G418 koncentrationer blev anvendt (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ug /ml) på 100.000 native CT1258 celler podet i brøndene i en 12-brønds plade. Til selektion af positive celler efter transfektion fusionen blev anvendt, hvor ingen celle overlevede de øvre betingelser efter syv dage.

Valg af positivt transficerede CT1258 celler.

Fluorescerende varianter af cellelinien CT1258 var etableret til konstitutivt at udtrykke det forstærkede grøn fluorescensprotein (EGFP) kodes af den tomme pEGFP-C1 plasmidet og en EGFP-HMGA2 fusionsproteinet ved ekspression af det rekombinante pEGFP-C1

HMGA2

plasmid. At fastlægge de stabile CT1258 cellelinier, blev de transficerede celler udvælges med antibiotikummet G418 (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland).

Oprindeligt en koncentration på 400 pg /ml G418 i mediet blev anvendt ved udvælgelse for stabile celler. En dag efter transfektion blev dyrkningsmediet 199 erstattet med medium 199 indeholdende G418. Efterfølgende selektionsmediet blev ændret hver 24 til 48 timer for de første to uger som fører til udvælgelse af celler, der er stabilt inkorporeret GFP plasmidet med den kodede antibiotikaresistensgenet neomycin til selektion i mammale celler i deres genomiske DNA. Celler, der ikke udtrykker konstruktionen vil blive dræbt af G418. Koncentrationen af ​​G418 blev sænket til 300 pg /ml efter tre måneders sammenhængende udvalg for vedligeholdelse af de genererede fluorescerende cellelinjer.

Fluorescens mikroskopi og flowcytometri (FCM)

GFP udtryk for fluorescerende cellelinjer CT1258-EGFP og CT258-EGFP-HMGA2 blev analyseret efter G418-selektion ved fluorescens mikroskopi og kvantificeret i en FACSCalibur flowcytometer (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Tyskland) med FL-1 kanal til at bestemme den procentdel af GFP-positive celler. Celler blev trypsineret i 3-5 min, resuspenderet i BD FACSFlow sheathvæske (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) indeholdende 1 uM TO-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland), og ved en samlet antal på 1 × 10

4 begivenheder blev målt for hver prøve ved flowcytometri. TO-PRO-3 er en langt-rød celle impermeabel nucleinsyrefarve målt i FL-4 kanal tillader ultrasensitiv påvisning af dobbeltstrenget DNA af døde celler. Analysen af ​​flowcytometri data blev udført ved hjælp af med Cell Quest software (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).

Immuncytokemi

Embedding af cellelinjer.

Cellesuspensioner af dyrkede cellelinier blev fikseret i 4% formalin. Cell pellets opnået ved centrifugering blev indlejret i paraffin og skåret i 3-4 um skiver til immuncytokemisk farvning.

immuncytokemisk farvning.

For antigen hentning, mikrobølgeovn opvarmning af paraffinsnit i 0,01 M citronsyre buffer (pH 6,0 i 20 min) (Quartett, Berlin, Tyskland) blev udført. Hæmning af endogen peroxidaseaktivitet blev opnået ved nedsænkning i 0,5% H

2O

2 (v /v) i methanol (20 min). Efter dræning blokering serum blev snittene inkuberet med et polyklonalt gede-anti-humant HMGA2 antistof (R 0,001

Kromosom Forberedelse

For kromosom forberedelse af CT1258-EGFP og CT1258- EGFP-HMGA2 celler colcemid (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) blev tilsat ved en slutkoncentration på 0,1 ug /ml for 90 min før høst. Efterfølgende blev cellerne inkuberet i 20 min i hypotonisk medium (1: 6; medium 199: H

2O; (medium 199: Life Technologies GmbH, Darmstadt, Tyskland)) og endelig fikseret med methanol /iseddike (3 :1) følgende rutinemæssige metoder [51]. Suspensionen blev dryppet på iskold objektglas og tørret i 5 dage ved 37 ° C efterfulgt af GTG-banding, der blev udført som tidligere beskrevet af [52]. Resultaterne blev behandlet og indspillet med BandView, 6,0, flere arter, Applied Spectral Imaging, Israel. Karyotype beskrivelse fulgte den nomenklatur foreslået af Reimann et al. [53].

Resultater

Fluorescens mikroskopi og FCM

Fluorescens mikroskopi.

CT258 celler transficeret med den ikke-rekombinante pEGFP-C1 ekspressionsvektoren viste grøn fluorescens hele cytoplasmaet grund EGFP udtryk (. figur 1B), mens ikke-modificerede native CT1258 celler viste ingen EGFP fluorescens (figur 1A).

A:. Transmitteret lys billede af den karakteristiske vækstmønster af indfødte CT1258 celler . B: Flettet billede af EGFP udtrykker CT1258-EGFP celler; EGFP er lokaliseret i cytoplasmaet. C: sammenflettede billede af CT1258-EGFP-HMGA2 celler, der udtrykker det nukleare lokaliserede EGFP-HMGA2 fusionsprotein. D-F: Flowcytometrisk analyser af EGFP udtryk i tre CT1258 cellelinjer afbildet i dot-plots viser side scatter (SSC) vs. EGFP fluorescens. Nr GFP-fluorescens er påviselig i native CT1258 celler (D), 84,1% af EGFP-positive celler er til stede i CT1258-EGFP cellelinje og (F) 97.0% EGFP-positive celler i CT1258-EGFP-HMGA2. Per prøve 1 × 10

4 hændelser blev analyseret.

Transfektion af CT1258 med pEGFPC1-HMGA2 resulterede i ekspressionen af ​​et rekombinant hunde EGFP-HMGA2 fusionsprotein, som udelukkende kunne påvises i kernen af de transfekterede celler (fig. 1C).

FCM.

til bestemmelse af EGFP positive celler ved FCM blev begge fluorescerende cellelinjer sammenlignet med indfødte ikke-transficerede CT1258 celler (fig. 1D ). Døde, TO-PRO-3-positive celler blev elimineret ved gating forud for EGFP positivitet analyse. Cellerne blev målt for CT1258 i 319:e passage, for CT1258-EGFP i 27th passage, og for CT1258-EGFP-HMGA2 i 113. passage.

vitalitet af cellelinjer varierede fra 85% til 93 % (data ikke vist). En gennemsnitlig procentdel af 84,1% EGFP positive celler fra den totale cellepopulation af G418 valgte CT1258-EGFP-cellelinie (fig. 1E) og 97,0% EGFP positive celler for CT1258-EGFP-HMGA2 cellelinie (fig. 1F) blev bestemt .

Immuncytokemi

Ca. 50% af CT1258-EGFP cellelinje havde nukleare mærkning af HMGA2 (fig. 2B). I cirka 70-80% af CT1258-EGFP-HMGA2 celler blev fundet stærkt mærkning af HMGA2, som var udelukkende til stede i kernen (Fig 2C.)

A:. Native CT1258 celler, B: CT1258-EGFP celler, C: CT1258-EGFP-HMGA2 celler. Ca. 50% af den native CT1258 cellelinien og CT1258-EGFP-celler viste en HMGA2-positive nuklear mærkning. I cirka 70-80% af CT1258-EGFP-HMGA2 celler, en stærk og udelukkende nukleare mærkning af HMGA2 var påviselig.

Relativ

HMGA2

Real-time PCR Expression Analysis

Alle real-time PCR resultater blev analyseret på grundlag af ΔΔCT metode. Udtrykket Forholdet mellem

HMGA2

mRNA i CT1258-EGFP celler viste sig at være 0,88 /0,92 i forhold til

HPRT1 /GUSB

udtryk i forhold til det niveau, set i native CT1258 celler (Fig. 3 ). I modsætning

HMGA2

ekspression i CT1258-EGFP-HMGA2 celler var, 7,0 /8,0 gange forøget (i forhold til

HPRT1 /GUSB

) sammenlignet med den respektive ekspression i native CT1258 celler (Fig . 3).

Relativ

HMGA2 /HPRT1

og

HMGA2 /GUSB

udtryk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Fejl barer er standardafvigelser. * P ≤ 0,05 indikerer en statistisk signifikant udtryk deregulering af

HMGA2

i CT1258-HMGA2-EGFP celler sammenlignet med indfødte CT1258.

Relativ

Lad-7a

real-time PCR Expression Analysis

lad-7a

ekspressionsniveauet i CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 celler var 2,0 og 3,1 gange højere (i forhold til

RNU6B

) sammenlignet med den registrerede udtryk i native CT1258 celler (fig. 4).

Relativ

lad-7a-service /RNU6B udtryk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Fejl barer er standardafvigelser. Ingen statistisk signifikant udtryk deregulering af

lad-7a

i CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP blev fundet i forhold til native CT1258 celler. Statistisk signifikant p-værdi blev defineret som ≤0.05.

Relativ

HMGA1

Real-time PCR Expression Analysis

HMGA1

niveau var 1,5 og 1,7 gange forøget (i forhold til

HPRT1

GUSB

) i CT1258-EGFP-HMGA2. I CT1258-EGFP cellerne ikke kunne påvises en tilsvarende forøget ekspression (1,0 /1,0 i forhold til

HPRT1

GUSB

) sammenlignet med de indfødte celler (Fig. 5).

Relativ

HMGA1 /HPRT1

og

HMGA1 /GUSB

udtryk i native CT1258, CT1258-EGFP og CT1258-HMGA2-EGFP celler. Fejl barer er standardafvigelser. * P ≤ 0,05 indikerer en statistisk signifikant øget udtryk for

HMGA1

i CT1258-HMGA2-EGFP celler sammenlignet med indfødte CT1258 og CT1258-EGFP.

Relativ

SNAI1, SNAI2

CDH1

Real-time PCR Expression Analysis

Relativ

SNAI1

udtryk til husholdning gener

HPRT1 /GUSB

fandtes at være 0,8 /0,8 henholdsvis CT1258-EGFP og 1 /1.2 i CT1258-EGFP-HMGA2 sammenlignet med native celler CT1258 (figur S1).

relativ

SNAI2

udtryk (i forhold til

HPRT1 /GUSB

) blev fundet 1,5 /1,6 i CT1258-EGFP celler og 1,4 /1,6 i CT1258-EGFP-HMGA2 celler i forhold til CT1258 (figur S2).

CDH1

var knap udtryk i alle cellelinjer med Ct-værdier højere end 36, og dermed en analyse fra ΔΔCT metoden ikke var muligt.

Real-time PCR Statistisk analyse

hypotesetest af den relative real-time PCR resultater blev udført under anvendelse REST softwareværktøj 2009 udgave 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Tyskland) [50]. De statistiske analyser blev udført separat for CT1258-EGFP og CT1258-EGFP-HMGA2 celler i forhold til indfødte CT1258.