PLoS ONE: Autophagy og Cellular Ældning medieret af Sox2 Undertryk Malignitet of Cancer Cells

Abstrakt

Autophagy er en kritisk cellulær proces kræves for at opretholde cellulær homeostase i sundhed og sygdomstilstande, men de molekylære mekanismer og virkninger af autofagi om kræft er ikke fuldt forstået. Her fandt vi, at Sox2, en central transskription faktor i reguleringen af ​​”stemness” af embryonale stamceller og induceret pluripotente stamceller, stærkt inducerede autophagic fænomener, herunder intracellulær vacuole dannelse og lysosomale aktivering i tyktarmen kræftceller. Aktiveringen sket ved Sox2-medieret

ATG10

genekspression og resulterede i inhibering af celleproliferation og forankringsuafhængig kolonivækst

ex vivo

og tumorvækst

in vivo.

Endvidere fandt vi, at Sox2-induceret-autofagi forbedret cellulær aldring ved opregulering tumorsuppressorer eller ældning faktorer, herunder p16

INK4a, p21 og phosphoryleret p53 (Ser15). Især knockdown af

ATG10

i

Sox2

udtrykkende kolon kræftceller restaurerede kræft celle egenskaber. Tilsammen vores resultater viste, at regulering af autophagy medieret af Sox2 er en mekanisme drevet roman strategi til behandling af humane coloncancerformer

Henvisning:. Cho YY, Kim DJ, Lee HS, Jeong CH, Cho EJ, Kim MO, et al. (2013) Autophagy og Cellular Ældning medieret af Sox2 Undertryk Malignitet af kræftceller. PLoS ONE 8 (2): e57172. doi: 10,1371 /journal.pone.0057172

Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget 2 oktober, 2012; Accepteret: 18 januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Cho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af The Hormel Foundation og National Institutes of Health giver CA111536, CA120388, CA077646, R37CA081064 og ES016548 og ved forskningsfonden, M-2011-B0002-00025 af det katolske universitet i Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller, men ikke normale celler, erhverve immortalisering ved at undslippe cellulær aldring [1]. Sammenlignet med normale celler, cancerceller kræver normalt mere næring til at producere proteiner og enzymer for deres hurtigere proliferation, hvilket resulterer i ernæringsmæssig afhængighed af cancerceller [2]. Overlevelse er støttet af næringsstoffer opnået gennem blodforsyningen og ved selv fordøjelse af intracellulære organeller i en proces kaldet autophagy [3].

Autophagy er et bevaret kataboliske proces i eukaryoter, der nedbryder langlivede proteiner, organeller , og bulk cytoplasma [4] gennem den lysosomale system til at opretholde homøostase under sult og normal vækstkontrol [3]. Autophagy fremmer celle overlevelse ved at rense cellerne i beskadigede organeller, toksiske metabolitter, og intracellulære patogener og ved at generere de intracellulære byggesten, der er nødvendige for at opretholde vitale funktioner i løbet af næringsstoffer begrænset forhold [5]. Dog kan autofagi også omfatte en vigtig strategi til behandling af kræft, fordi autofagi også kan fremme celledød gennem overdreven selv-fordøjelse og nedbrydning af vigtige cellulære bestanddele [5]. Autophagy er forskellig fra apoptose, en proces, der mangler autophagosomes og autolysosomes i døende celler [6]. Især blokering af autophagy ved udskære beclin inducerer tumorudvikling [7] og inducere autofagi ved behandling med naturlige forbindelser, såsom resveratrol, undertrykker cancercelleproliferation og malignitet [2]. Autophagy er efter sigende tæt forbundet med cellulær begyndende alderdom og inhibering af autofagi forsinkelser cellulær senescens i mitotiske humane diploide celler [8]. Disse observationer indikerer, at autofagi kunne foranledige senescens i cancerceller, fordi inhibering af autofagi øger tumorgene egenskaber af MCF-7-celler [9]. Imidlertid detaljerede mekanismer ikke er blevet klart belyst.

Desuden tamoxifen, en antagonist af østrogenreceptoren i brystvæv, inducerer autophagy i humane MCF-7 brystcancerceller [10] medieret gennem sphingolipid metabolitter [11] . Især arsentrioxid, imatinib (Gleevec) og rapamycin er forbindelser kendt for at inducere autophagic celledød i mange humane cancer cellelinjer [12], [13], [14]. Vigtigere er ovarieceller, brystkræft og prostatakræft forbundet med monoallelisk tab af beclin1 hos mennesker. Desuden induktion af autophagy ved beclin overekspression undertrykker forankringsuafhængig koloni vækst i MCF-7 celler [15], og spredning af negativ hæmning af p70S6 kinase [16], [17].

Både klassisk og moderniseret cellulære omprogrammering er stressende processer, der aktiverer apoptose og cellulære degeneration, som er de to primære barrierer for udviklingen af ​​kræft og somatisk omprogrammering [18]. De mTOR-signalvejen aktier i omprogrammering af somatiske celler, cellulære aldring og autophagy dannelse [18]. For eksempel, godt karakteriseret mTOR-hæmmere og autofagi aktivatorer, herunder PP242, rapamycin og resveratrol, især forbedre hastigheden og effektiviteten af ​​iPS celle generation [19]. Sox2, en transkriptionsfaktor tilhører HMG (Gruppe High Mobility) superfamilien, spiller en rolle i bestemmelsen af ​​celle skæbne, differentiering og proliferation [20]. Det er også en vigtig regulator af embryonale stamceller (ES) celle selv-fornyelse og omprogrammering af terminalt differentierede celler til iPS celler [21]. Selvom den onkogene potentiale stamcellelinjer faktorer, såsom Sox2, er blevet antaget at være baseret på “stemness” lighed mellem stamceller og cancerceller, er ikke klart forstået Sox2 funktion i cancerceller. Endvidere har nylige undersøgelser vist, at Sox2 proteinniveauet kraftigt svarer med mindre differentierede basalcelle-lignende brystcarcinomer [22], og Sox2 protein findes hyppigt at være nedreguleret i gastriske carcinomer [23]. Disse typer af undersøgelser har forårsaget flere kontroverser om den normale funktion og onkogent potentiale stamceller faktorer. Her giver vi dokumentation for, at ekspressionen af ​​Sox2 i cancerceller inducerer autofagi af kræftceller ved opregulering

ATG10

genekspression og fremkalde cellulære degeneration, hvilket resulterer i reduceret malignitet af cancerceller og hæmning af tumorvækst

ex vivo

in vivo

.

Resultater

Ektopisk ekspression af

Sox2

inducerer autofagi

Nylige undersøgelser indikeret at ektopisk udtryk for

Sox2

af retroviral infektion i MCF-7 brystkræftceller steget både størrelsen og antallet af kolonier dannet i blød agar [24]. Men Sox2 ofte nedreguleret i gastrisk kræft og hæmmer cellevækst gennem cellecyklusstop og apoptose [23]. Derfor rolle Sox2 i kræft er kontroversiel. At undersøge den rolle, Sox2 og andre iPS faktorer i cancer, ektopisk udtrykte vi disse faktorer i HCT116 human colorectal cancerceller og fundet, at Sox2, men ikke Nanog, Lin28 eller Oct4, induceret alvorlig vacuole dannelse i cytoplasmaet, som er en vigtig markør af macroautophagy [25] (fig. 1A). Vi fandt, at over 90% af inficerede celler dannet forskelligt dimensionerede vakuoler i deres cytoplasma og Western blotting og immunocytofluorescence assay resultater viste, at alle celler udtrykte ektopisk Sox2 protein (fig. 1B). Endvidere bekræftede vi, at alvorlig vacuole dannelse faldt sammen med sure lysosomale aktivering i HCT116 colon cancerceller (fig. 1C). Vigtigere, Sox2 overekspression inducerede LC3 (også kendt som ATG8b) foci-dannelse, som er en vigtig biomarkør for autofagi (fig. 1D). Disse resultater viste, at Sox2 overekspression induceret autophagy.

(

A

) Sammenligning af morfologiske forandringer som følge af ektopisk udtryk for iPS faktorer.

(øvre paneler)

HCT116 celler blev individuelt transduceret med IPS faktorer, herunder Sox2, Nanog, Lin28 og Oct4. Cellerne blev dyrket i 5 dage og blev observeret ændringer under et lysmikroskop (X200).

(Lavere paneler)

HCT116 celler blev høstet ved 5 dage efter transduktion med IPS faktorer og proteiner udvundet. Protein- niveauer i Sox2, Nanog, Lin28 og Oct4 blev analyseret ved Western blotting med specifikke antistoffer som angivet. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige protein belastning. (

B

) HCT116 celler danner vakuoler på 5 dage efter transduktion blev observeret under lysmikroskopi, talt og sammenlignet. Sox2 overekspression blev analyseret ved Western blotting og immunocytofluorescence assay (X200) under anvendelse af specifikke antistoffer som angivet. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige protein belastning. Cellerne blev visualiseret ved lysmikroskopi (L.M .; X200). (

C

) Lysosomal aktivering analyse. HCT116-celler inficeret med

mock

eller

Sox2

blev farvet ved tilsætning lysoTracker (50 nM) i dyrkningsmediet i 5 minutter i en 37

oC, 5% CO

2 inkubator. Cellerne blev fikseret med 4% formalin, vasket med PBS og lysosomal aktivering blev observeret under et fluorescensmikroskop (X200). (

D

) Immunofluorescens assay af LC3b (dvs. ATG8b). HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev udsat for en fluorescens assay til at påvise LC3b. Cellerne blev observeret under et fluorescensmikroskop (X200). Kernerne blev farvet med DAPI; LM indikerer lysmikroskopi (X200).

Sox2 inducerer Autophagy i kræftceller, men ikke i normale celler

For at undersøge om Sox2 overekspression kan fremkalde vacuole dannelse i forskellige tyktarmskræft cellelinjer vi transducerede Lenti-Sox2 viruspartikler i CCD-18Co normale kolon celler og HCT116, HT29 og WiDr menneskelige kolon kræftceller. Vi fandt, at alle tyktarmskræft cellelinjer dannet vakuoler i deres cytoplasma (Fig. 2A, pile). Selv om CCD8-18Co normale colonceller udviste god ekspression af Sox2 efter transduktion med Lenti-Sox2, cellerne ikke danner vakuoler eller vise morfologiske ændringer (Fig. 2A, B). Endvidere yderligere resultater bekræftede, at vacuole dannelse og sure lysosomal aktivering blev observeret i HCT116 colon cancerceller, men ikke i CCD-18Co normale colon celler (Fig. 2C). Desuden har ektopisk ekspression af Sox2 i normal muse embryonale fibroblaster (MEF’er) eller humane primære fibroblaster (NFDH og BJ) ikke forårsage vacuole formation (data ikke vist), hvilket viser, at vacuole induceret af Sox2 overekspression i HCT116-celler er faktisk cancercelle -specifikke autophagy.

(

A

) CCD-18Co (CRL-1459) normale kolon celler og HCT116, HT29 og WiDr kolon kræftceller blev dyrket i det passende medium og transduceret med

Sox2

viruspartikler. Cellerne blev dyrket med komplet vækstmedium i 5 dage efter transduktion. Cellerne blev observeret under et lysmikroskop. Cellular vakuoler er markeret med en pilespids i

Sox2

udtrykkende kolon kræftceller. (

B

) CCD-18Co normale kolon celler blev dyrket, transduceret med

mock

eller

Sox2

viruspartikler og dyrket med komplet vækstmedium i 5 dage. Cellerne blev derefter fikseret, permeabiliseret og hybridiseret med en Sox2 specifikt antistof og derefter med en Alexa 568-konjugeret sekundært antistof og visualiseret med et fluorescensmikroskop (X200). Kerner blev farvet med DAPI. De områder af lysmikroskopi er de områder matches med Sox2 og DAPI fluorescens. Det indrammede område under lav effekt forstørres at sammenligne morfologi mellem HCT116-

mock

og –

Sox2

udtrykkende celler. (

C

) Lysosomal aktivering, en autophagy markør, blev sammenlignet ved at tilføje lysoTracker-Rød (50 nM) på 5 dage efter transduktion til CCD-18Co normale kolon celler og HCT116 kolorektal cancer celler inficeret med

mock

eller

Sox2

. Cellerne blev observeret under et fluorescensmikroskop. LM angiver det samme område af lysmikroskopi svarende til fluorescens mikroskopi (X200).

Sox2 Mål ATG10 at fremkalde Autophagy

At udforske mekanismen (r) Sox2-induceret autofagi, vi først brugte en microarray analyse af i alt 30,968 gener fra cDNA isoleret fra celler inficeret med

mock

eller

Sox2

at identificere genet (r) mål for Sox2 at fremkalde autofagi. Resultaterne viste 11.245 gener, der blev analyseret under anvendelse af Signifikant Analyse af Microarray (SAM) program (https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). Vi fandt, at 2.153 Sox2-inducerede gener kunne klassificeres som op-regulerede og 1575 gener blev nedreguleret i HCT116 celler (Fig. 3A og Tabel S1). Vi brugte Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID v6.7; http: //niaid.abcc.ncifcrf.gove) for yderligere at klassificere de gener, i henhold til deres biologiske eller molekylære funktioner og fandt, at genekspression der er forbundet med autofagi , spredning og cellecyklus regulering blev væsentligt ændret ved ektopisk udtryk for

Sox2.

ændret genekspression inkluderet ændringer i 33 DNA reparation gener, 25 DNA replikation gener, 20 cellevækst-relaterede gener, 26 cellestørrelse-relaterede gener, 191 transskription-relaterede gener og 17 insulin-signalvejen gener (fig. 3A og tabel S1, S2 og S3). Vigtigere er det,

Sox2

udtryk induceret forøget ekspression af

ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D

ATG8b

gener med omkring 2-4 gange (fig. 3A). I modsætning hertil

Sox2

udtryk blev forbundet med nedsat udtryk for

ATG12, ATG16L2

ATG9B

gener (fig. 3A). Ved at søge en database, der indeholder Sox2 konsensus-bindende motiv i promotor-regionen i genomet [26], fandt vi, at

ATG10

ATG12

initiativtagere indeholder en formodet Sox2 bindende konsensus nukleotid motiv huser 63% identitet (tabel S4). Sammenligning vores microarray og database søgeresultater det, konkluderede vi, at ATG10 kunne være et mål for Sox2 i induktion af autofagi. Vores cyklus-afhængige RT-PCR-resultater viste, at

ATG10

mRNA niveau fra

Sox2-

transfekterede celler blev øget med omkring 2,5 gange sammenlignet med

mock

(fig. 3B ). Især Western blotting resultater (fig. 3C) og immunocytofluorescence mod ATG10 (fig. 3D) indikerede, at ATG10 og LC3 proteinniveauer blev forhøjet med overekspression af Sox2. For at afgøre, om

ATG10

promotor aktiveres af Sox2, konstrueret vi to

luciferase

reporter plasmider, der indeholder -1522 til -1 (

pGL3-ATG10-1522

) og – 711 til -1 (

pGL3-ATG10-711

) (fig 3E.) ved at søge og analysere

ATG10

promotorområder, som indeholder formodede Sox og SRY bindende motiver på -1327 og – 1473 fra transkriptionsinitieringsstedet (fig. 3E). Vi fandt, at denne deletion af formodede Sox2 bindende region undertrykte signifikant luciferaseaktivitet (Fig. 3F). Især

ATG10

promotor-aktivitet blev forøget med overekspression af Sox2 (fig. 3G), hvilket indikerer, at Sox2 inducerer

AT10

genekspression og forårsager autofagi.

(

A

) Microarray.

Top panel

, HCT116 kolorektal kræftceller stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev udsat for microarray analyse som beskrevet i “Materialer og metoder”. Den gule farve angiver antallet af gener, som ikke viste en signifikant forskel mellem

mock

Sox2

udtryk. De røde og grønne farver angiver antallet af gener, op- eller ned-regulerede, henholdsvis HCT116 celler stabilt udtrykker

Sox2

sammenlignet med celler, der udtrykker

mock

kontrol.

Bund bord

, sammendrag af autophagy gener opnået fra microarray analyse. Up- og nedregulering betegnes i log2 værdier. (

B

) Angivelse af

ATG10

induceret af Sox2. Totalt RNA (1 ug) fra HCT116 celler inficeret med

mock

eller

Sox2

blev revers transkriberet og

ATG10

blev forstærket af cyklus-afhængige PCR og

ATG10

ekspressionsniveauet blev visualiseret ved agarosegelelektroforese ved 21

st cyklus. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige udnyttelse af cDNA til PCR. (

C

) opregulering af ATG10 og LC3b protein niveauer induceret af

Sox2

udtryk. Proteiner blev udvundet fra HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

ATG10 og LC3b proteiner blev visualiseret ved Western blotting hjælp af specifikke antistoffer. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige protein belastning. (

D

) Bekræftelse af Sox2-induceret ATG10 protein niveau. HCT116 kolorektal cancer celler blev inficeret med

mock

eller

Sox2

og dyrket 5 dage. Cellerne blev fikseret, hybridiseret med et ATG10 specifikt primært antistof og Alexa 488-konjugeret sekundært antistof. De ATG10 protein niveauer blev observeret ved fluorescens mikroskopi. L. M. angiver det samme område af lysmikroskopi svarende til fluorescensmikroskopi (X200). (

E

) Opførelse af

ATG10

promotor

luciferase

reporter plasmid. Nukleotidsekvenserne af det humane

ATG10

promotorregion blev hentet fra Ensemble (https://uswest.ensemble.org). Den formodede promotor analyse blev udført ved hjælp TFSEARCH (v1.3) (https://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch). De formodede SRY og Sox bindende konsensussekvenser er betegnet med rødt og polymerasen III bindingssted er indrammet. (

F

) BAC klon (RP11-111B20) blev købt fra Empire Genomics (Buffalo, NY) og 1528 og 711 bp af

ATG10

promoter region blev opformeret ved PCR. PCR fragmentet blev rekombineret med

pGL3

grundlæggende vektor til at konstruere pGL3-AT10-1582 og pGL3-ATG10-711

luciferase

reporter plasmider.

pGL3-ATG10-Luc

reporter plasmider blev bekræftet ved DNA-sekventering.

ATG10

promotor

luciferase

reporter plasmider,

pGL3-AT10-1582

pGL3-ATG10-71-

luc, blev forbigående transficeret ind HCT116 celler og ildflue luciferaseaktivitet blev analyseret efter 24 timer.

phRL-SV40 renilla

luciferasereporterplasmid var cotransficeret som en intern kontrol for at verificere lige transfektion og normalisering af ildflueluciferaseaktivitet, (* p 0,001). (

G

)

pGL3-ATG10-1528

luciferasereporterplasmid blev forbigående cotransficeret med en

mock

eller

Sox2

viral ekspressionsvektor ind HCT116-celler og ildflue luciferaseaktivitet blev analyseret efter 24 timer.

phRL-SV40 renilla

luciferasereporterplasmid var cotransficeret som en intern kontrol for at verificere lige transfektion og normalisering af ildflueluciferaseaktivitet, (* p 0,001).

Sox2- induceret autophagy medieres gennem nedreguleringen af ​​Akt-signalvejen, men ikke gennem klasse III PI3-K Signaling

Fasting eller udtømning af vækstfaktorer, såsom insulin inducerer autofagi [27]. Vores microarray resultater viste, at genekspression forbundet med insulin-signalvejen blev undertrykt (tabel S3). Derfor undersøgte vi ændringer i proteinniveauer forbundet med autofagi og insulin signalering ved Western blotting. Vi fandt, at klasse III PI3-K (Vps34p) og beclin blev ikke ændret, hvilket indikerer, at klasse III PI3-K /beclin signalvejen ikke er involveret i Sox2-induceret autophagy (fig. 4A). Ved at undersøge PI3-K-Akt signalvejen, fandt vi, at Akt fosforylering (Ser308) var væsentligt hæmmet og de totale protein niveauer af Akt, mTOR og p70S6K blev nedsat i

Sox2

-inficerede celler sammenlignet med

mock

inficerede celler (fig. 4B). For at bekræfte signalering relateret til hæmning af PI3-K-Akt signalvej, analyserede vi GSK3α /ß og PTEN. Resultaterne viste, at phosphorylering af GSK3α /ß på Ser9 /Ser21 blev undertrykt og totale GSK3α /ß protein niveauer blev let øget i

Sox2

-inficerede celler sammenlignet med

mock

inficerede celler (Fig . 4C). Især fandt vi, at PTEN phosphorylering blev også forøget (fig. 4C), hvilket resulterer i suppression af PI3-K signalering ved de-phosphorylering [28]. Disse resultater indikerede, at Sox2 ændrer PI3-K-Akt signalvejen gennem GSK3α /ß og PTEN signalering, selvom den opstrøms specifikke kinase ansvarlig for phosphorylering af PTEN ikke er kendt i dette tilfælde. Vi behandlede HCT116 celler, der udtrykker

Sox2

eller

mock

med insulin eller LY294002, en PI3-K-inhibitor. Resultaterne viste, at

Sox2

induceret vacuole dannelse blev markant hæmmet af insulinbehandling (fig. 4D

venstre panel

s,

E). Men de

mock

inficerede celler ikke vise vacuole dannelse eller ej behandlet med insulin i normal cellekultur tilstand (10% FBS) eller undertrykt vakuole dannelse i sult tilstand (0% FBS) (fig. 4D

venstre og midterste paneler,

E, F). Vi fandt også, at

mock

inficerede celler udviste øget vacuole dannelse efter behandling med LY294002, mens

Sox2

overekspression forårsagede mere vacuole dannelse induceret af LY294002 behandling sammenlignet med

mock

( fig. 4D

højre panel

s,

E, F). Lignende fænomener blev observeret under sult betingelser (fig. 4E, F). Tilsammen disse resultater viste, at nedregulering af PI3-K-Akt pathway af PTEN kunne samarbejde om at fremkalde autofagi forbundet med Sox2 udtryk.

(

A-C

) Protein niveauer af klasse i signalmolekyler, herunder Akt, mTOR og p70S6K og klasse III PI3-K signalmolekyler, herunder Vps34p og beclin blev analyseret i HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

. De individuelle proteiner blev visualiseret ved Western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer. p-actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere samme protein loading. (

D

) Inddragelse af klasse I PI3-K-signalering i Sox2-induceret autofagi. (

D, venstre paneler

) HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev behandlet med insulin eller LY294002 under 10% FBS-indeholder betingelser på 2 dage efter infektion. Vacuole-dannelse blev observeret ved lysmikroskopi (X200). De indrammede områder er individuelt forstørret 2 gange mere (

lavere paneler til mock og Sox2

) til bedre at visualisere vakuoler.

(D, højre paneler)

Cellerne blev transduceret med

Sox2

virale partikler og kulturperler 2 dage. Celledyrkningsmediet blev erstattet med McCoys 5a uden FBS tilskud men inklusive 5 ug /ml insulin eller 5 ug LY294002 og derefter celler blev dyrket i 5 dage. Cellerne blev observeret under lysmikroskopi (X200). (

E

) Kvantitativ sammenligning af autophagy dannelse induceret af klasse I PI3-K-signalering. Vakuolen dannende celler fra D og F blev talt og sammenlignet i en numerate grafik (* p 0,001).

Sox2-induceret Autophagy hæmmer proliferationen og Anchorage-uafhængig koloni Vækst ved at inducere Cellular Ældning i HCT116 celler

Suppression af PI3-K-aktivitet ved PTEN har en vigtig rolle i celleproliferation og cancer udvikling i tyktarmen [29], [30], [31]. PI3-K hæmning af PTEN eller wortmannin har en omvendt effekt sammenlignet med tumornekrosefaktor α på balancen mellem P50 og p65 subunits af nuklear faktor

k

B [31]. GM3, et gangliosid, behandling dramatisk øger cyclin-afhængig kinase (CDK) inhibitor (CKI) p21

WAF1 ekspression gennem akkumulering af p53-proteinet ved PTEN-medieret inhibering af PI3-K-Akt-MDM2 overlevelse signalering i HCT116 coloncancerceller [29]. I human kolorektal cancer, har en negativ sammenhæng mellem PTEN protein niveauer og Akt phosphorylering blevet observeret [30]. Vores resultater indikerede, at nedregulering af PI3-K-Akt signalering via PTEN kan være involveret i Sox2-induceret autophagy (fig. 4). Vores celledeling og cellecyklus analyser viste, at

Sox2

infektion i HCT116 celler undertrykte proliferation ved at inducere akkumulering af celler i G0 /G1 og sub-G1 og reduktion af S-cellecyklus faser i forhold til

mock

-inficerede celler (fig. 5A). Dæmpningen af ​​celleproliferation var associeret med ca. 90% inhibering af forankringsuafhængig vækst af kræft i blød agar, et kendetegn for cancercellelinjer egenskaber [32] (fig. 5B). At udforske signalering ansvarlig for at inducere tabet af kræft celleegenskaber såsom suppression af proliferation og blød agar vækst undersøgte vi forskellige tumorsuppressorer med en kendt rolle i reguleringen af ​​cellecyklus. Vi observerede en stigning i p53 phosphorylering (Ser15) og stigninger i det samlede protein niveauer af p16

INK4a og p21 (fig. 5C), som er kendt for at være stærkt involveret i cellulær aldring [33]. Vi derefter undersøgt ældning ved hjælp af en SA-ß-galactosidase assay og fundet, at ektopisk udtryk for

Sox2

forbedret ß-galactosidase aktivitet og protein niveau (fig. 5D,

venstre og midterste paneler

) og undertrykte Ki-67-protein-niveau, en celleproliferation markør (fig. 5D,

højre panel

). Især over 90% af celler, der indeholder vakuoler farvet ß-gal positive (fig. 5D,

graf

), Tilsammen disse resultater viste, at Sox2-induceret autofagi forårsager et tab af tumor egenskaber i HCT116 kolorektal kræftceller .

(

A

)

Venstre panel

, effekt af

Sox2

udtryk på celleproliferation. HCT116-celler (2 x 10

3) stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev podet i plader med 96 brønde og proliferation blev analyseret ved MTS-assay med 24 timers interval op til 96 timer (*, p 0,001).

Mellemøsten og højre paneler

, effekt af

Sox2

udtryk på cellecyklus distribution. HCT116 celler (4 × 10

5) stabilt udtrykke

mock

eller

Sox2

var seedet, dyrket og derefter cellecyklus distribution (

midterste panel

) og sub- G1 akkumulation (

højre panel

) blev analyseret ved FACS (*, p 0,001). (

B

) Effekt af

Sox2

udtryk på forankringsuafhængig koloni vækst. HCT116-celler (8 x 10

3) stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev udsat for en blød agar kolonivækst assay for 5-7 dage. Cellen kolonier blev scoret med et mikroskop og Image-Pro PLUS (v.6) computersoftware programmet (* p 0,001). (

C

) Protein profilering relateret til cellecyklus regulering. Proteiner blev udvundet fra HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

og udsat for Western blotting at påvise niveauet af forskellige proteiner er kendt for at være involveret i cellecyklus regulering. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige protein belastning. (

D

) Cellular ældning assay.

Venstre panel

, HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

blev analyseret for ældning ved hjælp af en ældning ß-galactosidase farvning kit. Cellerne blev observeret under et lysmikroskop (X200).

Mellemøsten

højre paneler

, protein niveau af ß-galactosidase eller Ki-67 blev påvist i HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

hjælp specifikke primære antistoffer som angivet, og en HRP-konjugeret sekundært antistof. Immuncytokemisk detektering blev udført ved anvendelse af Sigma FASTTM 3,3′-diaminobenzidin Terahyfrochloride med Metal Enhancer Tablet sæt (DAB peroxidasesubstrat). De proteinniveauer blev visualiseret under anvendelse af et lysmikroskop (X200).

Graph

, indikerer en sammenligning af ß-galactosidase positive cellepopulation i HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

eller

Sox2

(* p 0,001).

Knockdown af

ATG10

Gendanner

Sox2

induceret Autophagy, Cellular Ældning og Cell Proliferation

Vores tidligere resultater viste, at

Sox2

medieret autophagy medieres gennem

ATG10

udtryk (fig. 3). For at undersøge, om knockdown af

ATG10

kan undertrykke autofagi fremkaldt af Sox2 overekspression, valgte vi en

PSH-ATG10-1755

knockdown vektor (fig. 6A).

sh-ATG10

viruspartikler blev smittet i

Sox2

-preinfected celler og ekspressionen af ​​Sox2 (fig. 6B,

øvre

paneler) og knockdown af

ATG10 Hotel (fig. 6B,

bundpaneler

) blev bekræftet ved en immunofluorescens assay. Meget vigtigere er, de cellulære morfologier af autophagy induceret af Sox2, herunder celle udfladning, nuklear størrelse og vakuole dannelse, var fuldstændig omdannet til dem observeret i

mock

inficerede HCT116 celler (Fig. 6B, L. M.). Desuden har vi bekræftet, at den morfologiske opsving svarede med restaurering af Ki-67, ß-galactosidase, p16

INK4a og p21 protein niveauer i

mock

inficerede HCT116 celler (Fig. 6C). Især bekræftede vi, at knockdown af

ATG10

i HCT116 stabilt udtrykker Sox2 genvundet celleproliferation, der blev inhiberet af Sox2 overekspression, og væksten var endnu hurtigere end for HCT116 celler stabilt udtrykker

mock

kontrol (fig. 6D). Disse resultater viste, at ATG10 spiller en vigtig rolle i autophagy dannelse induceret af Sox2 udtryk i HCT116 kolorektale cancerceller.

(

A

) Bekræftelse af knockdown effektivitet ATG10. Knockdown af ATG10 med

pLKO-shATG10

.

pLKO-shATG10

Knockdown Lenti-viruspartikler blev smittet i HCT116 celler stabilt udtrykker

Sox2

og celler dyrket i 36 timer. Proteinerne blev ekstraheret og knockdown effektivitet blev bestemt ved Western blot under anvendelse af en specifik ATG10 antistof. ß-Actin blev anvendt som en intern kontrol for at verificere lige protein belastning. (

B

) Morfologiske forandringer som følge af

ATG10

knockdown i HCT116 celler stabilt udtrykker

Sox2

. HCT116-mock, blev -Sox2 og -Sox2 /sh-ATG10 celler analyseret for morfologiske ændringer og proteinniveauer af Sox2 (rød) og ATG10 (grøn) blev bestemt med en immunfluorescens-assay under anvendelse af specifikke antistoffer. Cellerne blev observeret under et fluorescens eller lysmikroskop (X200). L. M. indikerer lysmikroskopi. (

C

) Genoprettelse af cellecyklus, celledeling og senescens markører ved at banke ned

ATG10

i HCT116 celler stabilt udtrykker

Sox2

. HCT116-mock blev -Sox2 og -Sox2 /sh-ATG10 celler podet i en 4-kammer dias, faste og permeabiliseres. Markører for celleproliferation, cellulær aldring og cellecyklus regulering inkluderet Ki-67, ß-galactosidase, p16

INK4a og p21. Disse markører blev analyseret ved immunocytokemi med specifikke antistoffer som indikeret ved hjælp af Sigma FASTTM 3,3′-diaminobenzidin Terahyfrochloride med Metal Enhancer Tablet sæt (DAB peroxidasesubstrat). Cellerne blev observeret under et fluorescens eller lysmikroskop (X200). (

D

) Restaurering af spredning ved at slå ned

ATG10

i HCT116 celler stabilt udtrykker

Sox2

.