PLoS ONE: Kræft Cell Expression af autotaxin Controls knoglemetastaser Formation i mus gennem lysophosphatidsyre-afhængig aktivering af osteoklaster

Abstrakt

Baggrund

knoglemetastaser er meget hyppige komplikationer af brystkræft. Aktuelle knoglemetastaser behandlinger med stærke anti-resorbtive midler er kun palliative indikerer, at faktorer uafhængige af knogleresorption kontrol knoglemetastaser progression. Autotaxin (ATX /NPP2) er et udskilt protein med både onkogene og pro-metastatiske egenskaber. Gennem sin lysosphospholipase D (lysoPLD) aktivitet, ATX styrer niveauet af lysophosphatidsyre (LPA) i blodet. Blodpladeafledt LPA fremmer progression af osteolytiske knoglemetastaser af brystcancerceller. Vi spurgte, om ATX var involveret i knoglemetastaser processen. Vi karakteriseret rolle ATX i osteolytiske knoglemetastaser dannelse ved hjælp af genetisk modificerede brystkræftceller udnyttes på forskellige osteolytisk knoglemetastaser musemodeller.

Metodologi /vigtigste resultater

Intravenøs injektion af humant brystcancer MDA -B02 celler med tvungen udtryk for ATX (MDA-B02 /ATX) til inmmunodeficiency BALB /C

nøgne

mus forbedret osteolytisk knoglemetastaser dannelse, som bedømt af øget knogletab, tumor byrde, og et større antal aktive osteoklaster på metastatiske stedet. Muse brystcancer 4T1-celler induceret dannelse af osteolytiske knoglemetastaser efter intrakardial injektion i immunkompetente BALB /C-mus. Disse celler udtrykte aktiv ATX og silencing ATX ekspression inhiberes omfanget af osteolytiske knoglelæsioner og faldt antallet af aktive osteoklaster på knoglen metastatisk site.

In vitro

blev osteoklastdifferentiering forbedret i tilstedeværelse af MDA-B02 /ATX celle konditioneret medie eller rekombinant autotaxin, der blev blokeret af den autotaxin inhibitor vpc8a202.

In vitro

, tilsætning af LPA til aktivt kul-behandlede serum genoprettede kapacitet serum til at understøtte RANK-L /MCSF-induceret osteoklastogenese.

Konklusion /Signifikans

ekspression af autotaxin af cancerceller styrer osteolytiske knoglemetastaser formation. Dette arbejde viser en ny rolle for LPA som en faktor, der stimulerer direkte kræft vækst og metastase, og osteoklastdifferentiering. Derfor målrette autotaxin /LPA sporet fremstår som en potentiel ny terapeutisk tilgang til at forbedre resultatet af patienter med knoglemetastaser

Henvisning:. David M, Wannecq E, Descotes F, Jansen S, Deux B, Ribeiro J et al. (2010) Cancer Cell Angivelse af autotaxin Controls knoglemetastaser Formation i mus gennem lysophosphatidsyre-afhængig aktivering af osteoklaster. PLoS ONE 5 (3): e9741. doi: 10,1371 /journal.pone.0009741

Redaktør: Erik Danen, Leiden /Amsterdam Center for Drug Research, Leiden Universitet, Holland

Modtaget: 14 januar 2010; Accepteret: 26 februar 2010; Udgivet: 17 Mar 2010

Copyright: © 2010 David et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra INSERM (OP og PC), Comité départemental de la Loire de la Ligue nationale contre le Cancer (OP), den franske nationale institut for Cancer, INCA (OP, kontrakt 0610-3D1616-102 /PL 2006 ) og den franske Association pour la Recherche sur le Cancer, ARC (OP). M.D. var modtager af fællesskab fra Ligue Nationale contre le Cancer. J.S. har en postdoc stipendium af Research Foundation – Flandern (FWO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bone er en fælles metastatisk site for mange kræftformer [1]. Knoglemetastaser er forbundet med hypocalcæmi grund knogledestruktion, intraktabel knoglesmerter og patologiske frakturer. Tumorceller stede på knoglen metastatisk websted stimulere osteoklast-medieret knogleresorption, og knogle-afledt vækstfaktorer frigivet fra resorberet knogle fremmer tumorvækst, hvilket fører til udviklingen af ​​en ond cirkel. [2]. Desværre, nuværende behandlinger med stærke antiresorptive midler (bisfosfonater) undlader at give livsforlængende gavn for patienter med knoglemetastaser hæve behovet for et bedre kendskab til de molekylære mekanismer, der er involveret i denne patologi [3]. Vi har for nylig fundet, at lysophosphatidsyre (LPA) afledt af blodplader virker lokalt på tumorceller at fremme udviklingen af ​​knoglemetastaser [4]. Blandt celleoverflade specifikke receptorer for LPA (LPA

1-6) udtrykt af tumorceller, viste vi, at LPA

1 aktivitet herskede under knogle metastaser progression og at målrette denne receptor var en ny terapeutisk strategi mod knoglemetastaser [ ,,,0],5]. Men hvordan LPA genereres på tumorstedet og hvordan LPA produceret af tumorceller selv kan bidrage til udviklingen af ​​knoglemetastaser er stadig ukendt.

autotaxin (ATX, NPP2) tilhører nukleotid pyrophosphat phosphodiesterase (NPP ) familie [6]. Ud over det konserverede phosphodiesterase (PDE) aktivitet blandt alle atomkraftværker, autotaxin har en unik lysophospholipase D (lysoPLD) aktivitet, hvilket tillader dannelsen af ​​LPA fra lysophosphatidylcholin (LPC) [7]. Den biologiske betydning af PDE og lysoPLD aktiviteter i autotaxin funktioner er endnu ikke fastslået. Imidlertid blev den funktionelle relevans af den katalytiske aktivitet af autotaxin

in vivo

nylig vist fra knockout-mus undersøgelser viser, at autotaxin er ansvarlig for niveauerne af LPA i blodcirkulationen [8], [9]. Et link mellem øget lysoPLD aktivitet og dannelsen af ​​LPA blev fundet i forskellige patologier, såsom rheumatoid arthritis [10], neuropatisk smerte [11], kronisk hepatitis C [12] og adipocyt insulinresistens i fedme [13]. Autotaxin er et glycoprotein oprindeligt identificeret som en autokrin motilitet faktor secerneres af humane melanomceller [14], [15]. Forøget ekspression af autotaxin blev vist at korrelere med øget invasivitet af brystcancerceller [16] og viste sig at forbedre den metastatiske potentiale ras-transformerede 3T3 fibroblaster [17]. Angivelse af autotaxin mRNA blev påvist på et basalt niveau i næsten alle humane væv [18]. Interessant nok blev opregulering af autotaxin genet rapporteret i mange forskellige cancere, såsom glioblastom [19], aggressiv neuroblastom [20], ikke-småcellet lungecancer [21], uveal melanom associeret med dårlig prognose [22], thyroid carcinoma [23 ], hepatocellulært carcinom med metastaser [24], og brystkræft [16]. MMTV-

ATX

transgene mus med specifikt forøget ekspression af autotaxin i mælkekirtlen viste en øget forekomst af spontane brysttumorer over en toårig periode, der illustrerer den pro-onkogene funktion af autotaxin [25].

Her giver vi eksperimentelle beviser, at brystcancerceller udtrykker autotaxin har en selektiv fordel til at inducere dannelse af osteolytiske knoglemetastaser som følge af et hidtil ukendt pro-osteoklastisk funktion af autotaxin produktet afledt LPA. Disse resultater illustrerer betydningen af ​​autotaxin i avanceret brystkræft og foreslå, at målrette autotaxin /LPA sporet kan give yderligere fordele for patienter, der lider knoglemetastaser.

Resultater

De novo

autotaxin udtryk øger proliferation og invasion af humane MDA-B02 brystkræftceller

in vitro

Vi har tidligere vist, at MDA-B02 celler ikke udtrykker autotaxin ved steady state [4]. For at vurdere, hvorvidt autotaxin spiller en rolle i metastaser formidling af brystkræft tumorceller, vi introducerede cDNA af rotte autotaxin i MDA-B02 celler. Vi anvendte tet-Off-reguleret ekspression, i hvilket autotaxin ekspression sammen med luciferase nås netop i fravær af repressoren, doxycyclin [4]. Som en unik medlem af NPP familien, autotaxin udstillinger både lysoPLD og phosphodiesterase aktiviteter [26], [27]. Derfor, som en kontrol cellelinie transficerede vi MDA-B02-celler med en ekspressionsvektor der koder for muse NPP1, der virker som et nukleotid-phosphodiesterase men som mangler for lysoPLD aktivitet.

I hver konstruktion, valgte vi to stabile kloner: MDA-B02-ATX klon nr. 30 og nr. 38, og MDA-B02-NPP1 kloner no. 10.5 og nej. 42. Ekspressionen af ​​autotaxin som et udskilt protein og NPP1 som membranbundet protein blev bekræftet ved western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer (figur 1A). Klon markeringer var baseret på høj luciferase ekspression i fravær af doxycyclin (figur 1B). Som forventet, observerede vi, at kun MDA-B02-ATX kloner i fravær af doxycyclin erhvervet en lysoPLD aktivitet (figur 1 B), hvorimod begge MDA-B02-ATX og MDA-B02-NPP1 kloner havde en forøget PDE aktivitet, sammenlignet med . parentale celler (Figur 1B)

(A) celler transficeret med tovejs ekspressionsvektorer pBiL-ATX eller pBil-NPP1 blev udpladet med (+) eller uden (-) doxycyclin (Dox). Proteiner fra konditionerede medier (CM) eller lysater af tumorceller (CL) af to stabile kloner (nr. 30 og nr. 38 til ATX, nr. 10.5 og nr. 42 til NPP1) blev electrophorezed derefter immunoblottet med et anti-ATX-antistof (venstre panel) eller anti-Myc-antistof (højre panel). (B) kvantificering af luciferaseaktivitet (Venstre panel), lysoPLD aktivitet (Middle panel) og PDE-aktivitet (Højre panel) i hver klon og forældrenes MDA-B02 celler. (C) Celleproliferation blev stimuleret med LPC (10 uM) i fravær eller nærvær Ki16425 (10 uM). Resultater er udtrykt som% af BrdU-inkorporering sammenlignet med ikke-stimulerede MDA-B02 parentale celler. Data svarer til gennemsnittet ± SD af 6 replikater og er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. (D) celleinvasion blev stimuleret med 10% FBS anvendes som kemoattraktant. Resultaterne er middelværdien ± SD af celler af 3 replikater og er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data er udtrykt som antallet af celler /mm

2. *,

P

0,05. **,

P

0,01

Vi har tidligere, at behandlingen med LPA øger spredningen af ​​MDA-B02 celler vist [4]. Her, observerede vi, at i mangel af doxycyclin, LPC havde en mitogen aktivitet i sig selv på både de parentale MDA-B02-celler og transficerede kloner (figur 1C). Denne fund kan afspejle udtryk LPC receptorer (GPR4, TDAG8) i MDA-B02 celler såvel som i brysttumorer [28]. Imidlertid blev LPC-afhængig proliferation yderligere forøget i MDA-B02-ATX-celler, men ikke i MDA-B02-NPP1 celler eller parentale celler. Desuden behandling af celler med Ki16425, en antagonist af LPA

1 og LPA

3 receptorer, totalt blokeret autotaxin-afhængig, men celleproliferation ikke LPC-afhængig (figur 1C). Dette indikerede, at rekombinant ATX udtrykt af MDA-B02-ATX celler produceret aktiv LPA der stimulerede celleproliferation gennem en LPA

1-3 receptor-afhængige vej.

autotaxin er blevet impliceret i invasivitet af Ras- transformerede fibroblaster og brystkræftceller [16], [17]. Vi observerede, at i fravær af doxycyclin, MDA-B02-ATX-kloner havde en signifikant højere kapacitet til at invadere Matrigel ™ som reaktion på FBS end i nærvær af doxycyklin (figur 1D). Forstærkningen af ​​invasivitet af MDA-B02-ATX-kloner blev også observeret ved sammenligning med parentale celler og MDA-B02-NPP1 kloner, tilføjet enten i fravær eller nærvær af doxycyclin. Disse resultater bekræftede, at autotaxin øgede invasive potentiale brystkræftceller ved en mekanisme, der krævede sin lysoPLD aktivitet.

De novo

autotaxin udtryk forbedrer

in vivo

MDA-B02 knoglemetastaser dannelse

Vi har tidligere påvist, at LPA afledt af blodplader støtter progressionen af ​​knoglemetastaser medieret af MDA-B02-celler i mus [4]. Vi antager, at forhøjet tumorcelle-afledt lysoPLD aktivitet også kan fremme knoglemetastaser. Tredive to dage efter den intravenøse inokulering af tumorceller i

nøgne

mus, afslørede radiografiske analyser, dyr, der bærer MDA-B02-ATX kloner udviste en stigning i omfanget af osteolytiske læsioner 40% til 70%, sammenlignet med der ses med MDA-B02-NPP1 kloner og parentale celler (figur 2A). Histologiske undersøgelser og histomorfometriske analyser bekræftede de radiografiske observationer og viste, at

de novo

ekspression af autotaxin af brystcancerceller resulterede i en reduktion af knoglevolumen (BV /TV) og øget skeletale tumorbyrde (figur 2A). Vi observerede ingen forskel på ben af ​​metastatiske dyr med MDA-B02-NPP1 kloner sammenlignet med MDA-B02 parentale celler ved den histologiske niveau (figur 2B). Vi har tidligere vist, at LPA stimulerer styrken af ​​tumorceller for at øge rekrutteringen af ​​osteoklaster på knoglen metastatisk site [4]. Her, observerede vi, at overfladen af ​​aktive osteoklaster pr trabekulær knogle område beliggende på knoglen /tumorcelle grænsefladen blev forøget i dyr, der bærer MDA-B02-ATX-kloner, sammenlignet med den observeret i mus, der bærer parentale eller NPP1-udtrykkende tumorceller ( Figur 3).

(A) (Venstre paneler) Repræsentative røntgenbilleder af bagbenene fra metastatiske mus med MDA-B02-celler eller MDA-B02-ATX-klon nr. 30 eller MDA-B02-NPP1 klone no. 42 29 dage efter inokulation af tumorceller. Osteolytiske læsioner er angivet med pile (skala bar: 0,5 cm). (Højre panel) Kvantificering af osteolytiske læsioner områder på røntgenbilleder i metastatiske dyr. Data svarer til middelværdien ± SE for to uafhængige forsøg på 7 til 10 dyr i hver gruppe. (B) (Venstre paneler) Repræsentant knogle histologi af Goldner trichrom-farvede tibialismetafyse fra metastatiske dyr. Bone farves i blå; knoglemarv og tumorceller farves rødt. (Skala bar: 1 mm). (Højre panel) Histomorfometrisk analyse af metastatiske baglemmer hjælp af knogle volumen /væv volumen ration (BV /TV, sorte bjælker og venstre akse) og tumor volumen /væv volumen-forholdet (TumV /TV, åbne barer og højre akse) som referenter. Værdier er middelværdien ± SE for 7-10 dyr pr gruppe repræsenterer to uafhængige forsøg. *,

P

. 0,05

(Øverst til venstre paneler) Repræsentant immunhistologisk undersøgelse af proksimale tibia sektioner fra metastatiske dyr 29 dage efter tumorcelleinokulering, ved hjælp af anti-ATX antistof 4F1. T angiver tumorceller. (Nederst til venstre paneler) Repræsentant histologisk undersøgelse af TRAP-farvede proksimale tibia sektioner fra metastatiske dyr. T angiver tumorceller. Bone farves i mørkeblå og osteoclats farves i rød (pile). (Højre panel) Kvantificering af aktiv-osteoklast resorption overflade pr trabekulær knogle overflade (Oc.S /BS). Resultaterne er middelværdien ± SE for 8-9 dyr pr. *:

P

0,05. Scale barer:.. 200 um

Alt i alt, vores resultater viste, at øget ekspression af autotaxin af MDA-B02 celler forbedret dannelse af osteolytiske knoglemetastaser

nedregulering af autotaxin udtryk hæmmer invasion men ikke proliferation af muse 4T1-brystcancerceller

for at løse rolle autotaxin i knoglemetastaser dannelse i en immunkompetent sammenhæng vi udnyttet den 4T1-cellelinie, som er afledt af en enkelt mus brysttumor og rekapitulerer adskilte trin af metastase når inkorporeret i mælkekirtlen hos syngene BALB /c mus [29]. For det første fandt vi, at 4T1-celler udtrykte mRNA’et af alle former for LPA-receptorer og svarede på LPA-stimulering (figur 4A og 4B). Derudover fandt vi, at 4T1-celler udtrykte autotaxin transcript og protein (figur 4A og 4C), der tegner sig for sekretionen af ​​et enzymatisk aktivt autotaxin protein (figur 4C). For at analysere funktionen af ​​endogen udtryk for autotaxin af brystkræft celler i knoglemetastaser dannelse vi brugte den RNA-interferens metode til at etablere en serie af tre kloner af 4T1 celler med stabilt nedreguleret autotaxin udtryk (4T1-siATX), sammen med tre kontrol 4T1-klonerne med uændret ekspression af autotaxin (4T1-sbATX) (figur 4C). Efter individuel karakterisering af hver klon for niveauerne af protein udtryk og lysoPLD aktiviteter, efterfølgende

in vitro

in vivo

eksperimenter blev udført ved hjælp af puljer af de tre kloner for 4T1-siATX og de 4T1-sbATX cellelinier hhv.

(A) RT-PCR amplifikationsprodukter til LPA-receptorer, LPA

1 (1), LPA

2 (2), LPA

3 (3), LPA

4 (4), LPA

5 (5), GPR87, P2Y5, og autotaxin (ATX) fra 4T1-celler totale RNA’er blev analyseret på en 2% agarosegel. MW, molekylvægtmarkør. (B) Cell invasion blev stimuleret med forøgede LPA anvendte koncentrationer som kemoattraktant. Resultaterne er middelværdien ± SD af celler af 3 replikater og er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data er udtrykt som antallet af celler /mm

2. (C) autotaxin ekspression i 3 kloner af 4T1-celler transficeret med en pStrike vektor koder for enten irrelevante lille hårnål RNAi (sbATX, kloner nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller specifik lille hårnål RNAi (siATX, kloner no. 1, nr. 17, nr. 52). (Øverste felt) immunblotting under anvendelse af anti-ATX polyklonalt antistof eller anti-? Tubulin som ladningskontrol. (Lower panel) lysoPLD aktivitet (pmol LPA /ml) målt i cellekultur konditioneret medie. (D) Celleproliferation vurderet af BrdU inkorporering af 4T1-celler og en pulje af tre 4T1-sbATX kloner (nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller tre 4T1-siATX kloner (nr. 1, nr. 17, no . 52), som reaktion på øgede koncentrationer af LPC. Resultater udtrykkes i middel ± SD af 6 replikater og er repræsentative for 3 adskiller eksperimenter. (E) Invasion assay. Celler blev anbragt i nærvær eller fravær af LPA (0,1-1 uM) i det øvre kammer og FBS, anvendes som kemoattraktant, blev anbragt i det nedre kammer. Resultaterne er middelværdien ± SD af 3 replikater og er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data er udtrykt som antallet af celler /mm

2. *,

P

. 0,05

Som tidligere observeret for MDA-B02 celler

in vitro

(figur 1C), LPC udstillet en mitogen virkning på 4T1 celler (figur 4D). Men lyddæmpning af autotaxin udtryk ikke ændre udbredelsen af ​​4T1-siATX celler sammenlignet med observeret for kontrol og forældrenes cellelinjer (figur 4D). Dette resultat var temmelig overraskende og kan være konsekvensen af ​​den tilbageværende lysoPLD aktivitet i 4T1-siATX kloner. En alternativ forklaring ville være, at spredning af 4T1 celler allerede var maksimalt stimuleret af LPC. I modsætning hertil ved hjælp transwell migration kamre overtrukket med Matrigel ™, observerede vi, at lyddæmpende autotaxin ekspression inhiberes FBS-drevne invasion af 4T1-siATX celler (Figur 4E). Denne hæmning blev overvundet ved tilsætning af LPA i cellen rum af migrationen kamre der viser, at invasionen af ​​4T1 celler blev kontrolleret af autotaxin gennem sin lysoPLD aktivitet.

Nedregulering af endogen autotaxin udtryk i 4T1 celler hæmmer osteolytiske knoglemetastaser dannelse uafhængigt af primær tumorvækst

in vivo

for at finde ud af, om endogen udtryk for autotaxin i bryst kræftceller var vigtigt for knoglemetastaser dannelse, 4T1-siATX og kontrol cellelinjer blev injiceret ind i venstre ventrikel af hjertet af kvindelige syngeniske BALB /C-mus. Denne strategi gør det muligt at omgå lungerne og at målrette celler til andre indre organer og knogler. To uger efter celleinokulering, afslørede radiografiske analyser, dyr, der bærer 4T1-siATX celler havde et fald i omfanget af osteolytiske læsioner 50%, sammenlignet med dyr injiceret med 4T1-sbATX eller 4T1-parentale celler (figur 5A). Histologiske analyser viste, at overfladen af ​​aktive osteoklaster pr trabekulær knogle område beliggende på knoglen /tumorcelle grænsefladen blev signifikant reduceret i dyr, der bærer 4T1-siATX celler, sammenlignet med den observeret i mus, der bærer parentale eller 4T1-sbATX tumorceller (figur 5B ). Vi har tidligere vist, at LPA er produceret i tumormikromiljøet af blodplader [4]. At analysere betydningen af ​​endogen autotaxin på brystcancerceller

in vivo

uafhængigt af knoglen mikromiljø, blev 4T1-siATX og kontrol cellelinier inokuleret i fedt-pude af kvindelige syngeniske BALB /C-mus. Efter to uger, hvilket svarede til den samme tidsramme af tumorvækst end ved knoglemetastaser eksperimenter blev primære tumorer indsamlet. Vi observerede, at lyddæmpende autotaxin ekspression ikke ændrede væksten af ​​primære tumorer, da der ikke var nogen signifikant forskel i størrelsen af ​​4T1-siATX tumorer, sammenlignet med dem af 4T1-sbATX og parentale tumorer (figur 6A).

In situ

immunodetektering af Ki-67 nuklear antigen i tumorsnit viste ingen forskel i proliferation af 4T1-siATX og kontrolceller (figur 6B). Tilsammen viste disse resultater, at endogen ekspression af autotaxin kontrolleret knoglemetastaser dannelse, men ikke væksten af ​​4T1-celler

in vivo

.

(A) (venstre paneler) Repræsentative røntgenbilleder af bagbenene fra BALB /C-mus 14 dage efter intrakardial injektion af 4T1-parentale celler eller puljer af 4T1-sbATX kloner (nr. 14, nr. 16, nr. 20) eller 4T1-siATX kloner (nr. 1, nr. 17, nr. 52) . Osteolytiske læsioner er angivet med pile. (Højre panel) Kvantificering af osteolytiske læsioner områder. Værdier er udtrykt som% af læsionsområder sammenlignet med parentale 4T1-celler. Data svarer til middelværdien ± SE for to uafhængige forsøg på 8 til 10 dyr pr gruppe. *,

P

0,05. (B) (venstre øvre paneler) repræsentant immunhistologisk undersøgelse af proksimale tibia sektioner fra metastatiske dyr 14 dage efter tumorcelleinokulering med anvendelse af anti-ATX-antistof 4F1. T indicates tumor celler. (Nederst til venstre paneler) Repræsentant histologisk undersøgelse af TRAP-farvede proksimale tibia sektioner fra metastatiske dyr. T angiver tumorceller. Bone farves i mørkeblå og osteoclats farves i rød (pile). (Højre panel) Kvantificering af aktiv-osteoklast resorption overflade pr trabekulær knogle overflade (Oc.S /BS). Resultaterne er middelværdien ± SE for 8-10 dyr pr. *:

P

0,05. Scale barer: 200 um

4T1 stamcellerne, 4T1-sbATX kloner og 4T1-siATX kloner blev injiceret i mælkekirtlen af ​​normale syngene BALB /C-mus.. På dag 14 blev primære tumorer resektion og vejet. (A) Box plots repræsenterer tumor vægt (i mg). (B) primære tumorer blev indlejret i paraffin. Tumorvæv snit blev analyseret ved mmunohistochemistry anvendelse af et specifikt antistof rettet mod det nukleare ki-67-antigen. Mitoseindekset (tal i hvert panel) blev beregnet som den procentdel af kerner der var positive for ki-67 (Resultaterne er middelværdien ± SD, skala bar: 50 pm). (C) Dyr blev aflivet 35 dage efter tumorcelleinjektion og lunger blev opsamlet at kvantificere spontant metastase dannelse af 4T1-celler. (øvre paneler) repræsentative fotografier af lunge vævssnit farvet med eosin. (Lower panel) Kvantificering af lunge metastase foci. Antallet af metastatiske foci blev optalt under mikroskop. P 0,05. T angiver metastatiske foci. Målestok:. 200 um

For at analysere kapaciteten af ​​endogene autotaxin at støtte dannelsen af ​​spontane metastaser ved 4T1 celler

in vivo

, celler blev injiceret i yverfedt pude af BALB /C-mus. Primære tumorer blev dyrket i to uger, på hvilket tidspunkt de blev reseceret, tillader fremkomsten af ​​spontane metastaser. Tre uger efter resektion af primære tumorer, blev dyr aflivet. Lunger blev opsamlet, fikseret og indlejret i paraffin. Lung vævssnit blev undersøgt under et mikroskop for tilstedeværelse af metastatiske foci. Vi fandt, at mus podet med 4T1-siATX celler havde en signifikant lavere antal lungemetastaser (80% reduktion) sammenlignet med mus podet med 4T1 forældre celler (Figur 6C).

Alt i alt, disse data viste, at den ekspression af endogent autotaxin kontrollerede kapacitet på 4T1-brystcancerceller til at metastasere og til at inducere dannelse af osteolytiske knoglemetastaser uafhængigt af celleproliferation.

ekspression af autotaxin mRNA i primære tumorer fra patienter med brystcancer

Vi spurgte, om virkningerne af autotaxin udtryk observeret i mus prækliniske modeller af brystkræft kunne korrelere med sygdom hos mennesker. Vi analyserede ekspressionen af ​​autotaxin udtrykkende genet (

ENNP2

) ved real time kvantitativ PCR i en serie af 167 brysttumor biopsier fra patienter uden (n = 145) eller med (n = 22) identificerede metastaser ved det tidspunktet for diagnosen. Vi observerede, at ekspressionen af ​​

ENPP2

normaliseret til de gener, der koder ribosomale protein L32 (L32) eller TATA-box protein (TBP, data ikke vist), var ikke signifikant ændret hos patienter med knogle eller blødt væv metastaser på tidspunktet for diagnosen, sammenlignet med ikke-metastatiske patienter (figur 7). Vi fandt også tilsvarende niveauer af

ENPP2

mRNA i primære tumorer af ikke-metastatiske patienter, der havde udviklet knogle eller blødt væv metastaser over en femårig periode (figur 7). Derefter undersøgte vi udtryk for

ENPP2

i forhold til de kliniske, patologiske og biologiske egenskaber, som defineret i tabel 1. Vi fandt, at selv om de absolutte medianværdier af

ENPP2

transkriptniveauer blev konsekvent steget sammen med kendetegnene for fattige prognosticering, har forskellene ikke nå statistisk signifikans. Dette indikerede, at ekspressionen af ​​

ENPP2

i primære tumorer i brystkræftpatienter var uafhængig af tumorstørrelse, grad, node, østrogen receptor (ER) og progesteron receptor (PGR) status (tabel 1).

Total RNA blev ekstraheret fra primære brysttumor biopsier af patienter uden eller med metastaser på diagnosetidspunktet. Blød og Bone repræsenterer delmængder af metastatiske patienter med kun blødt væv og knoglemetastaser, hhv. W /O Rec repræsenterer en delmængde af ikke metastatiske patienter uden gentagelse af metastaser i en femårig periode. Soft Rec og Bone Rec repræsenterer undergrupper af patienter med tilbagefald af metastaser til kun og knogle over en femårig periode, henholdsvis blødt væv. n angiver antallet af patienter i hver gruppe. Ekspression af Enpp2 /ATX mRNA blev målt ved real-time kvantitativ ved real time PCR. Kvantificeringer blev normaliseret til tilsvarende L32 RNA værdier. Data er givet som box plots med medianen. Boksen omfatter 25

th til 75

th percentiler. De 5

th fraktiler vises som fejl barer.

LPA kontrollerer direkte osteoklastdifferentiering

Vi viste tidligere, at LPA øger styrken af ​​tumorceller at inducere differentiering af osteoklaster

in vitro

og deres ansættelse

in vivo

på knoglen metastatisk websted [4].

In vitro

, konditionerede medier indsamlet fra MDA-B02-ATX kloner signifikant forøget differentieringen af ​​modne osteoklaster fra knoglemarv celleforstadier, sammenlignet med konditionerede medier fremstillet ud fra parentale celler eller MDA-B02-NPP1 kloner (figur 8A). Desuden rekombinant autotaxin steget markant M-CSF /RANK-L-induceret osteoklastdifferentiering

in vitro

(figur 8B). For at bestemme om virkningen af ​​autotaxin skyldtes dets lysoPLD aktivitet, anvendte vi en β-substitueret analog af LPA (vpc8a202) beskrevet som en specifik inhibitor [30]. Vi observerede, vpc8a202 inhiberede autotaxin-afhængige øget osteoklastogenese fra knoglemarvsceller behandlet med M-CSF og RANK-L (figur 8B). Vi viste tidligere, at LPA kontrollerer indirekte brystcancer celle-induktion af osteoklastogenese gennem sekretion af pro-osteoclastiske cytokiner, IL-6 og IL-8, ved tumorceller [4]. Serum er nødvendig for fuld osteoklastdifferentiering ved stimulering osteoklastpræcursorer med M-CSF /RANK-L

in vitro

[31]. Serum indeholder store mængder af både LPA og LPC [32]. Derfor er vores resultater antydede, at LPA genereret af autotaxin i nærvær af serum kan styre direkte osteoklastdifferentiering. For at teste denne hypotese, behandlede vi kalvefosterserum med aktivt kul for at fjerne alle lipidfraktioner. Vi observerede, lipid-depleteret serum ikke kunne støtte osteoklastogenese induceret af M-CSF /RANK-L (figur 8C). Denne inhibitoriske virkning af lipid-depleterede serum blev reddet ved tilsætning af oprenset LPA i dyrkningsmedierne (figur 8C). Dette resultat indikerede, at LPA var nødvendig for serum /M-CSF /RANK-L-induceret osteoklastogenese.

(A) Knoglemarvsceller blev dyrket i nærvær af FBS (10%), muse M-CSF, RANK- L og MDA-B02 celle eller MDA-B02-ATX klon # 30 eller MDA-B02-NPP1 klon # 10.5 konditionerede medier. (B) Knoglemarvsceller blev dyrket i nærvær af FBS (10%), muse M-CSF, RANK-L og rekombinant ATX, i fravær (-) eller nærvær af stigende koncentrationer af ATX-inhibitor, vpc8a202. (C) Knoglemarvsceller blev dyrket i nærvær af muse M-CSF, RANK-L og FBS (kontrol) eller lipid-depleteret FBS (Dep. FBS) i fravær eller nærvær af 1-oleoyl-LPA (1 uM). (Venstre paneler) Repræsentative billeder af flerkernede celler farvet for TRAP aktivitet. (Højre paneler) Kvantificering af osteoklast nummer var baseret på multinukleation af TRAP-positive celler. Resultaterne er middelværdien ± SD af 3 separate forsøg. *:

P

0,05. Scale barer: 200 um

Diskussion

I denne undersøgelse vi viste, at ekspressionen af ​​autotaxin kontrolleret progression af osteolytiske knoglemetastaser induceret af brystkræft celler.. Vi viste tidligere, at lysophosphatidsyre (LPA), produceret i tumormikromiljøet styrer progressionen af ​​osteolytiske knoglemetastaser af brystcancerceller og fremhævede den store betydning af blodplader i denne proces [4]. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der er involveret i produktionen af ​​LPA og den direkte rolle LPA på knogleceller på knoglen metastatisk stedet er stadig ukendt. Knockout dyr analyser afslørede, at autotaxin styrer niveauet af LPA i blodcirkulationen [8], [9]. Tvungen ekspression af autotaxin i human brystcancer MDA-B02-celler forøgede dannelse af osteolytiske knoglemetastaser i mus, hvorimod knockdown ekspression af endogent autotaxin i musebrysttumor 4T1 celler faldt omfanget af osteolytiske læsioner. Det er kendt for to årtier, at blodplader er en rigelig kilde til LPA i serummet [33], [34]. Aoki gruppe viste dog, at LPA udgivet direkte af blodplader kun udgør en lille del af serum LPA [32].