PLoS ONE: PI-3K Inhibitors Fortrinsvis Target CD15 + Cancer Stem Cell Befolkning i SHH Driven Medulloblastoma

Abstrakt

Sonic pindsvin (SHH) medulloblastom (MB) undertype er drevet af en proliferativ CD15 + tumor formerings celle (TPC) , også overvejet i litteraturen som en formodet cancer stamceller (CSC). Trods omfattende forskning, er meget af biologi denne TPC fortsat ukendt. Vi rapporterer bevis for, at phosphatase og tensin homolog (PTEN) og phosphoinositid 3-kinase (PI-3K) spiller en afgørende rolle i udbredelse, overlevelse og potentiel respons på behandling i denne CD15 + CSC /TPC-drevet malign sygdom. Brug af ND2-

SmoA1

transgen musemodel for MB, mus genetik og patient-afledte xenotransplantater (PDXs), vi viser, at CD15 + TPC’er er 1) obligat kræves til SmoA1Tg-drevet tumorgenicitet 2) reguleret af PTEN og PI-3K signalering 3) selektivt følsomme over for de cytotoksiske virkninger af pan PI-3K hæmmere

in vitro

in vivo

men resistente over for kemoterapi 4) i SmoA1Tg musemodel er genomisk ens til SHH human MB undergruppe. Resultaterne giver den første bevis på, at PTEN spiller en rolle i MB TPC signalering og biologi, og at PI-3K inhibitorer målet og undertrykke overlevelse og proliferation af celler i muse og human CD15 + cancer knoglemarven. I modsætning hertil CD15 + TPC’er er resistente over for cisplatin, temozolomid og SHH-inhibitor, NVP-LDE-225, agenter i øjeblikket anvendes i behandlingen af ​​medulloblastom. Disse undersøgelser validere den terapeutiske effekt af pan PI-3K-inhibitorer i behandlingen af ​​CD15 + TPC afhængig medulloblastom og foreslå en sekventiel kombination af PI-3K hæmmere og kemoterapi vil have forøget effekt i behandlingen af ​​denne sygdom.

Henvisning : Singh AR, Joshi S, Zulcic M, Alcaraz M, garlich JR, Morales GA, et al. (2016) PI-3K Inhibitors Fortrinsvis Target CD15 + Cancer Stem Cell Befolkning i SHH Driven medulloblastom. PLoS ONE 11 (3): e0150836. doi: 10,1371 /journal.pone.0150836

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 13. oktober 2015; Accepteret: 19 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Singh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Microarray data er deponeret i GEO offentlige database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), med tiltrædelse GEO nummer GSE41717

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud RO1 CA94233 -09 og FDA RO1 rammeafgørelsen om 04.385 til DLD og tilskud fra Alex ‘Lemonade Stand Foundation for Childhood Cancer (ALSF), (Springboard Grant) og Hyundai Hope on Wheels Foundation, Hope Grant, Cricket Corporation og Olivia Hudson Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Joseph R. garlich og Guillermo A. Morales er ansat af SignalRx Pharmaceuticals. SignalRx Pharmaceuticals ydet støtte i form af løn til forfattere JRG og GAM, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Forfattere Joseph R. garlich og Guillermo A. Morales er ansat af SignalRx Pharmaceuticals. Dr. Durden beskriver økonomisk interessekonflikt i SignalRx Pharmaceuticals og i SF1126 stof. Der er følgende patenter vedrørende materiale relevant for denne artikel (PI-3-kinase inhibitor prodrugs Patent nr: 6.949.537). Forholdet mellem Dr. Durden og SignalRx er blevet internt revideret og godkendt af University of California, San Diego i overensstemmelse med sin interessekonflikter politikker. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af Cricket Corporation. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer

Forkortelser:. CSC, kræft stamceller; TPC, tumor formeringsmateriale celle; PI-3K, phosphoinositid 3-kinase; PTEN, phosphatase og tensin homolog; PDX, patient-afledt xenograft

Introduktion

medulloblastom (MB) er en aggressiv cerebellar tumor og den mest almindelige pædiatriske hjerne malignitet [1, 2]. Den nuværende behandling for medulloblastom omfatter resektion af tumoren, efterfulgt af strålebehandling og kemoterapi, som omfatter cisplatin regimer. Selvom kuren sats er 50-80%, efterladte lider alvorlige bivirkninger, herunder vækst værdiforringelse, endokrine sygdomme, og mærket neurokognitive underskud [3]. Således er der et presserende behov for mere effektive og mindre giftige behandlinger for medulloblastom. For nylig har flere grupper [4-8] udføres genekspression profilering og DNA-copy-nummer analyse af MB, og har identificeret mindst fire store undertyper af sygdommen: Wnt, Sonic pindsvin (SHH), Gruppe C, og Gruppe D . Disse molekylære undertyper har særlige karakteristika i form af genekspression, mutationsmønstre profiler, epidemiologi, og prognose. Blandt molekylære undertyper, der er tumorer forbundet med ukontrolleret aktivering af SHH vej defineres normalt som SHH MB. Den SHH pathway er en væsentlig embryonisk signalering kaskade, der regulerer stamceller og progenitor-celledifferentiering i multiple udviklingsprocesser [9]. Mutationer i SHH pathway suppressor

Patched

eller ændringer af andre SHH pathway komponenter resulterer i permanent aktivering og MB tumordannelse [10, 11]. Ca. 30% af MB udviser ukontrolleret aktivering af SHH-signalvejen [11]. Selv om flere smoothened (SMO) antagonister, herunder NVP-LDE225 GDC0449 øjeblikket evalueret i kliniske forsøg hos patienter med medulloblastom, der er hurtige udvikling af tumor resistens [12, 13]. En undersøgelse af Buonamici et al viste, at NVP-LDE225 resistens i MB medieres af aktiveringen af ​​phosphoinositid 3-kinase (PI3K) signalvejen. [14]. Eksisterende litteratur antyder, at tumor suppressor, PTEN og dets mål-PI-3K er vigtige i patogenesen af ​​SHH-associeret MB [15-20]. Seneste genomisk analyse af medulloblastom tumorer afslørede, at PI-3K mutation (PIK3CA, PTEN, PIK3C2G) er hyppige i SHH undergruppe tumorer [21, 22]. I en af ​​undersøgelserne, ud af 13 Hedgehog undergruppe tumorer profilerede, 2 havde tab-af-funktion-mutationer i

PTEN

, og en anden patient havde et aktiverende mutation i PIK3CA [22]. I en anden undersøgelse, ud af 133 SHH MB tumorer profilerede, er PI-3K pathway muteret i 5% af SHH MBs [21, 22]

Flere rapporter viser, at MB drives af behandlingsresistent stamcelle. -lignende celler, kaldet kræft stamceller /tumor formerings celler (CSC /TPC’er). Landmark undersøgelser viser, at tumorprøver udvundet af murine genetiske MB modeller, Sonic pindsvin (

SHH-Patched

) og fra humant MB, formeres ved celler, der udtrykker stamfader markør CD15 /SSEA [23, 24]. CD15 er et kulhydrat-antigen, der udtrykkes på begge progenitorer og stamceller i det embryoniske og voksne centralnervesystemet [25, 26] og især betragtes som en vigtig markør for TPC’er i SHH undergruppe af medulloblastom [23].

TPC’er anses for at være proliferative og en stor bidragyder til tumor modstand og tilbagefald [27-30]. Flere undersøgelser har påvist en rolle for PI-3K /AKT-vejen i spredning og formering af TPC’er [31-33]. Rapporter har vist, at blokering af PI-3K aktivitet undertrykker proliferation af TPC’er i bryst-, ovarie- og forskellige andre cancere [34]. Hambardzumyan

et al

. foreslog, at PI-3K pathway aktivitet regulerer overlevelsen af ​​kræft stamceller efter stråling i medulloblastom

in vivo

. [35]. Således har vi en hypotese, at målrette PTEN-PI-3K signalering akse i MB TPC rum kan give langsigtet tumor kontrol og /eller udryddelse af medulloblastom. Tidligere har vores gruppe rapporteret, at heterozygositet af PTEN fremmer tumorigenese i både mennesker og i

SmoA1

musemodel af medulloblastom [15]. Vi rapporteret, at 61% af humane medulloblastom tumorer har mistet ekspression af PTEN proteinet og dette tab i PTEN er af prognostisk betydning i denne sygdom (15). Heri ved brug af

SmoA1Tg

musemodel og primære humane MB patient xenograft tumorprøver (PDXs), vi observeret, at tumor-formerings evne CD15 + TPC’er i SHH-drevet MB reguleres i det mindste delvis af PTEN- PI-3K signalveje, og at målrette denne akse ved hjælp PI-3K-hæmmere kan blokere

in vivo

opformering af TPC’er og inducere apoptose.

Materialer og metoder

Animal undersøgelser

ND2:

SmoA1 Hotel (

SmoA1

) transgene mus var en gave fra James Olson (University of Washington, Seattle, WA) [36]. Musene blev opretholdt i Moores Cancer Center vivarium ved University of California, San Diego, og alle forsøg blev udført ved hjælp af procedurer, der er godkendt af University of California, San Diego IACUC udvalg.

stereotaktisk implantation af tumorceller

stereotaktisk implantation af tumorceller blev udført som beskrevet før [23, 37]. Nude

nu-nu-

mus blev bedøvet ved hjælp af 60 mg /kg ketamin (Fort Dodge Animal Health) plus 20 mg /kg xylazin (Ben Venue Laboratories), og placeret i en stereotaktisk ramme med en mus adapter (Kopf Instruments ). Et snit blev lavet i midterlinjen af ​​hovedbunden over lillehjernen, og et lille hul blev lavet i kraniet (3 mm til højre og 1 mm anterior til bregma) ved hjælp af en skrå (skarp spids) 25 G nål. En 30-gauge Hamilton-sprøjte fyldt med celler var monteret på en mikromanipulator og indføres gennem hullet til overfladen af ​​den højre frontallap, i en dybde på 4,5 mm. Frisk-Weaver CD15 +/- tumor (dyrkede) celler blev injiceret i løbet af 2 minutter, og nålen blev efterladt på stedet i yderligere fem minutter for at undgå tilbagesvaling. Endelig blev huden lukket med 6-0 hurtigt absorberende plain gut sutur under anvendelse af en 3/8 PC-1 skærende nål (Ethicon). Dyrene blev overvåget kontinuerligt under og postoperative periode for at sikre, at mus har genvundet fra kirurgi og er ambulant uden tegn på ubehag. Potentielle smertefulde og stressende virkninger af denne overlevelse kirurgi omfatter: 1) dårlig fodring, 2) vægttab, 3) pjusket gran, 4) tab af mobilitet i bur, 5) tegn på infektion på operationsstedet. Den analgetiske buprenorphin (0,1 mg /kg) blev injiceret i tilfælde af smerte eller ubehag. Absorberbare suturer og /eller hæfteklammer fjernedes 10-14 dage efter operationen. Hvis morbiditet ikke korrigeres af vores interventioner blev mus aflivet med CO2 efterfulgt af cervikal dislokation

Cell isolation flowcytometri

Tumorceller blev isoleret fra PDX samt 4 til 6 måneder gamle SmoA1Tg mus som følger. Kort fortalt blev tumorvæv skåret i små stykker og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter i fordøjelsen buffer bestående af Dulbeccos PBS (DPBS, Life Technologies, Grand Island, NY) med 10 U /ml papain (Worthington, Lakewood, NJ) , 200 ug /ml L-cystein og 250 U /ml DNase (Sigma, St. Louis, MO). Fordøjelsen buffer blev derefter fjernet og erstattet med DPBS indeholdende 8 mg /ml sojabønnetrypsininhibitor (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 8 mg /ml bovint serumalbumin (BSA, Sigma), og 250 U /ml DNase, efterfulgt af titrering af væv under anvendelse af pipetter med aftagende hulstørrelse at opnå en enkelt-cellesuspension. Celler blev centrifugeret ved stuetemperatur og resuspenderet i PBS indeholdende 200 ug /ml BSA (PBS /BSA) og ledes gennem en cellesigte (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) for at fjerne debris. Denne suspension blev centrifugeret gennem en trinvis gradient af 35% og 65% Percol (Amersham Biosciences), og cellerne blev høstet fra 35% -65% grænseflade, vasket i PBS /BSA. Til sortering af CD15 + og CD15- celler blev tumorceller resuspenderet i FACS-buffer (DPBS + 2% FBS) og farvet i 30 minutter med CD15-antistof (BD Biosciences, Cat nr. 340.850, primær antibodiy) vasket med FACS buffer, farvet i 30 minutter med sekundær antibodiy (FITC), og derefter analyseret eller sorteres ved hjælp af en FACSVantage SE flowcytometer.

celleproliferation, BrdU inkorporering, apoptose og cellecyklus analyse

Tumor celler isoleret som tidligere beskrevet [23] fra human patient afledte xenotransplantater (PDX) samt 4 til 6 måneder gamle

SmoA1

PTEN + /+ mus viser fysiske og adfærdsmæssige tegn på medulloblastom.

FACS sorterede CD15 + og CD15- celler blev udpladet med 4 x 10

4 celler /brønd i ultralav binding plader med 96 brønde i serumfrit medium indeholdende Neurobasal og B27 kosttilskud. Celler blev inkuberet natten over og behandlet med DMSO eller inhibitorer i 48 timer. Cellelevedygtighed assay blev udført under anvendelse AlamarBlue® (Roche) ifølge producentens protokol. For BrdU-inkorporering undersøgelser blev tumorceller isoleret fra Smo A1 Tg model som beskrevet ovenfor. 2 millioner tumorceller per brønd blev udpladet i plader med 24 brønde i serumfrit medium indeholdende Neurobasal og B27 kosttilskud. Cellerne blev pulset med BrdU i 30 minutter og derefter vasket med medier for at fjerne eventuelt resterende BrdU. Celler blev indsamlet umiddelbart efter impulsen ( “30 minutter”) og farvet med CD15-antistof som beskrevet ovenfor. Cellerne blev derefter fikseret og farvet ved anvendelse af FITC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) og propidiumiodid (PI) ifølge producentens instruktioner. Analysen blev udført ved anvendelse af en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences). For apoptose undersøgelser blev CD15 + og CD15- celler behandlet med inhibitor i 24 timer, efterfulgt af caspase-3-aktivitet under anvendelse af kittet (Roche) eller farvning med annexin V

FITC-antistof og propidiumiodid (PI) ifølge producentens instruktioner ( BD, Pharmingen, San Diego, CA). For cellecyklusanalyse DNA-indhold blev analyseret med FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences).

Western blot-analyse

FACS sorteret CD15 + eller CD15- celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af inhibitorer eller DMSO for 30 minutter og derefter stimuleret med IGF 50 ng /ml i 30 minutter. Cellerne blev lyseret med RIPA lysebuffer (Pierce) indeholdende protease inhibitor cocktail. Proteiner blev kvantificeret ved BCA-proteinassay (Pierce) og lige store mængder af protein blev opløst ved polyacrylamidgeler, overført til nitrocellulosemembran og probet med følgende primære antistoffer: (. Kat nr 9271) p-AKT (Ser473), p-AKT ( Thr308) (katalog nr. 9275), AKT (katalog nr. 9272), p-p70S6k (Thr389) (katalog nr. 9205), p70S6K (katalog nr. 2708), p-4EBP1 (Thr37 /46) (cat no. 2855), 4EBP1 (katalog nr. 9452), pERK (Thr202 /Tyr204) (katalog nr. 9101), p-PRAS40 (Thr246) (katalog nr. 2997), PRAS40 (katalog nr. 2610), p27 Kip1 (katalognr . 2552), p-MDM2 (S166) (kat nr 3521), Bad (kat nr 9292) og PARP (kat nr 9542) (alle fra cellesignalering Technologies)…; p21 Cip1 /WAF1 (sc-397), Bax (sc-493) og β-actin (sc-47.778) fra Santacruz.

Kvantitativ real-time analyse

RNA blev ekstraheret fra CD15 + og CD15- celler under anvendelse af RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD) ifølge producentens instruktioner. For RTPCR, blev cDNA fremstillet ud fra 1 ug RNA-prøve ved anvendelse iscript cDNA syntesekit (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA blev amplificeret ved RT-PCR-reaktioner med 1 × SYBR green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) i 96-brønds plader på et CFX96 tidstro system (Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse af forskellige primere til human eller muse gener. Sekvensen af ​​primerne er som beskrevet i S1 tabel. Relative ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression efter formlen 2 ^ (Ct genet af interesse-Ct GAPDH) .

In-vivo

BKM120 behandling

For at undersøge effekten af ​​BKM-120 på tumorvækst

in vivo

, CD15 + og CD15- TPC blev implanteret intrakranialt i cerebella af sekundære NSG mus eller subkutant i nu-nu mus. For subkutane tumorer, 20 dage efter transplantation blev musene tilfældigt opdelt i to grupper: Gruppe 1 fik vehikel (ubehandlet) og gruppe 2 fik 30 mg /kg BKM-120 ved oral gavage én gang dagligt i 21 dage. Tumordimensionerne blev registreret hver tredje dag og tumorvolumen blev målt ved anvendelse af følgende formel: volumen = 0,5 x længde x (bredde)

2. For intrakranielle tumorer, 40-50 dage efter implantation blev tumorer kontrolleret ved MRI og inddelt i grupper og behandles som beskrevet for subkutane tumorer. Måling af tumorvolumen for subkutant implanteret tumor blev gjort ved skydelærer og for intrakranielle implanterede tumor blev udført ved magnetisk resonans (MRI). MRI blev udført under anvendelse af en 1,0-T MRI. Mus blev bedøvet med 2% isofluoran og musene blev derefter afbildet med en Aspect M2 1.0-Tesla små dyr scanner (Aspect Imaging; Shoham, Israel). T2-vægtede, blev billeder opnået ved hjælp af en gentagelse på cirka 2500 ms, et ekko på 60 ms, en skive tykkelse på 1 mm, synsfelt på 35 mm og en matrix størrelse på 184 x 184 (i plan opløsning på 35 /184 = 0.19mm). For MR billeddannelse undersøgelser blev tumorvolumener målt ved manuelt at segmentere tumorer ved hjælp af enten Varian s Image Browser software eller det offentlige domæne program ImageJ Image (https://rsb.info.nih.gov/ij). T2-vægtede billeder blev undertiden bruges til at hjælpe med at afklare tumor marginer.

Menneskelig tumor isolation og formering

Menneskelig MB væv til patient-afledte xenotransplantater blev opnået fra kirurgisk resektion af tumorer hos Rady børnehospital ( San Diego, CA). Alle procedurer ved hjælp af humant væv blev godkendt af Institutional Review Boards of Rady Børnehospital. Ved hentning blev vævet mekanisk dissocieret til en enkelt-cellesuspension, derefter straks injiceret i hjernen hos NSG mus. Når musene blev symptomatisk, blev tumorerne igen dissocieres til encellede suspensioner og derefter igen transplanteres tilbage ind i hjernen på naive værter til at etablere en opformeret linie for hver patient-afledt xenotransplantat.

microarray analyse

SmoA1Tg

tumorceller blev sorteret i CD15 + og CD15- befolkninger og anvendes til RNA isolering ved hjælp RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA integritet blev vurderet ved anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer. Prøver viser RNA integritet (RIN) på mere end 8,0 blev anvendt til microarray analyse. RNA blev mærket og hybridiseret til Affymetrix Mouse Genome 1.0 ST arrays. Array data blev behandlet af RMA-softwaren. Betydning Analyse af Microarray (SAM) software blev anvendt til bestemmelse differentiel ekspression med en falsk opdagelse sats (FDR) 1% og et minimum fold-ændring på 2 medmindre andet er angivet. Heatmaps blev dannet ved anvendelse af R-pakken. Genekspression data blev omdannet til Z-score og hierarkisk klyngedannelse med en euklidisk afstand blev anvendt til at generere række og kolonne dendrogrammer. Microarray data er blevet deponeret i GEO offentlige database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), med GEO tiltrædelse nummer er GSE41717.

underklasse og SUBMAP analyse at sammenligne murine CD15 + TPC’er til humane MB undergrupper

MB underklasse og SUBMAP analyse, som giver mulighed for cross-platform og cross-arter sammenligning af microarray data baseret på Kolmogorov-Smirnov statistikker (33), blev anvendt til at sammenligne murine tumorer til den humane MB prøver er beskrevet i [4]. Underklassen Mapping modul i Gene Pattern softwarepakke (www.broadinstitute.org/genepattern) blev anvendt til at sammenligne musen datasæt til et genekspression datasæt bestående af primære humane MB klassificeret i molekylære undertyper (C1-C6) som defineret i Cho et al. og en række af normale cerebellum prøver og atypiske teratoid rhabdoid tumorer [4]. Kortlægning resultater er repræsenteret som en underklasse forening (SA) matrix fyldt med p-værdier for hver subklasse forening.

sæt berigelse Gene analyse (GSEA)

GSEA blev udført som beskrevet i [ ,,,0],38]. Kort fortalt blev gener bestilt på grundlag af deres forskellig ekspression mellem to klasser (CD15 + vs. CD15-). En berigning score (ES) blev derefter beregnet for hver gensæt. Gene sæt med en nominel p-værdi 0.05 blev inkluderet som væsentlig. Til denne analyse blev kurateret gen sæt (C2) fra MSigDB v.3.0 (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) udnyttes. PCA-analyse af de 22 forkant gener identificeret i SUBMAP evalueringen blev sammenlignet på tværs af arter barriere i CD15 +, CD15- og i human MB tumor genekspression database [4].

Resultater

PI- 3K signalering er stærkt forhøjet i CD15 + TPC’er isoleret fra

SmoA1 Tg

medulloblastom musemodel

Det er velkendt, at CD15 er en markør for tumor formerings celler i Ptc +/- model af SHH drevne medulloblastomer [ ,,,0],23]. I den foreliggende undersøgelse,

ND2SmoA1

transgen musemodel blev brugt til at karakterisere de signalveje, der kræves for spredning af CD15 + TPC’er. Først, vi udførte indledende forsøg i vores

SmoA1

model til at validere, at CD15 er en celle overflade markør for tumor formerings celler i dette Shh drevet medulloblastom model. Til dette formål blev en ortotopisk transplantation assay etableret i hvilken

SmoA1

PTEN + /+ tumor celler blev sorteret i CD15 + og CD15- fraktioner og 2 x 10

6 celler fra hver fraktion blev stereotaksisk implanteret i lillehjernen af ​​nøgen /

nu-nu-

mus. S1A Fig viser FACS data validering, at ren CD15 + population isoleres fra tumorerne. Som vist i S1B Fig, implantation af kun CD15 + TPC’er resulterede i sekundære tumorer inden 10-12 uger som histologisk lignede de primære tumorer, hvorfra cellerne blev afledt (data ikke vist). I S1B Fig viser vi Ki67 farvning kun i sekundære tumorer afledt fra CD15 + TPC’er angiver højere proliferative indeks af disse celler i forhold til normal hjerne. Desuden vores resultater viser, at kun CD15 + celler fra

SmoA1 PTEN + /+

medulloblastom kan generere tumorer

in vivo

. For yderligere at evaluere stamcelle lignende egenskaber CD15 + TPC, udførte vi real time PCR-analyse af en række stamcellemarkører og resultaterne viser, at visse stamcellemarkører fx Oct4, klf4, Sox2, CXCR4, pou5f1, Nanog, nestin og Musashi er stærkt beriget med CD15 + TPC rum i

SmoA1

Tg musemodel (S1c Fig). For at få yderligere indsigt i tumoren formerings egenskaber CD15 + celler, vi udført en række biokemiske og genomiske analyser af CD15 + og CD15- cellepopulationer isoleret fra

SmoA1

Tg tumorer. Baseret på denne analyse, vi fandt, at CD15 + population isoleret fra Smo

A1

Tg mus modellen neurosfærer (data ikke vist), vise en tydelig udtryk mønster og er meget proliferative som afsløret ved at øge antallet af levedygtige celler over tid (fig 1A, venstre panel) og højere BrdU-inkorporering i CD15 + -celler sammenlignet med CD15- celler fra den samme tumor (fig 1A, højre panel). Dette resultat støttes også af højere H

3-thymidin (data ikke vist) i CD15 + celler i forhold til CD15- celler. Data præsenteret i S2 tabel og S2 Figur viser, at gener relateret til spredning og celleoverlevelse (S2A Fig), SHH signalvej (S2B S2C Fig) og angiogenese (S2D Fig) er stærkt forhøjet i CD15 + population. Samlet indikerer disse data, at det tumor-formerings evne CD15 + -celler er forbundet med en øget evne til at proliferere og en nedsat tendens til at undergå apoptose og differentiering.

CD15 + TPC’er isoleret fra

SmoA1

Tg medulloblastom musemodel er meget proliferative og viser forhøjet PI-3K signalering (A) Venstre panel viser spredning af CD15 + og CD15- celler isoleret fra

SMO A1

tumorer. FACS sorteret CD15 + og CD15- tumorceller (n = 4) blev dyrket i 48 timer i serum-frit medium, efterfulgt af tilsætning af AlamarBlue® og inkubering af pladerne ved 37 ° C i 5% CO

2 i 6 timer. Fluorescenssignaler blev aflæst som emission ved 590 nm efter excitation ved 560 nm. Right panel viser BrDU indbygning i CD15 + og CD15- celler isoleret fra Smo A1 Tg. CD15 + og CD15- fra SMO tumorer blev pulseret med BrDU som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) FACS sorteret CD15 + og CD15- celler blev analyseret for ekspression af PTEN og phosphorylering af Akt, 4EBP1, p70S6k og Erk. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) Kvantitativ PCR-analyse af mRNA for ekspression af PTEN i FACS sorteret CD15 + og CD15- celler (n = 3). Relative ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression. Forsøget blev gentaget 3 gange med tilsvarende resultater.

PI-3K /AKT pathway har vist sig at være vigtigt for spredning af TPC’er i både faste tumorer og leukæmi [31-33]. For at undersøge de potentielle mekanistisk rolle for PI-3K signalvejen i TPC formering og overlevelse i medulloblastom, vi bestemt den relative aktivering tilstand af PI-3K /AKT i CD15 + TPC’er vs. CD15- ikke-TPC’er. Western blot-analyse afslørede, at CD15 + celler har lavere basale niveauer af ekspression af PTEN og har en aktiveret PI-3K signalering akse sammenlignet med CD15- celler, der viser væsentlig stigning i phospho-AKT, phospho-S6 og phospho-4EBP1 (Fig 1B). Disse resultater blev understøttet af augmented niveauer af PTEN-mRNA detekteret i CD15- population sammenlignet med CD15 + -celler (Fig 1C). Tilsammen disse resultater tyder på, at PTEN udtryk nedreguleres og PI-3K signalering er forhøjet i CD15 + TPC i forhold til CD15- befolkning.

Differentieret målretning af TPC af PI-3K hæmmere

in vitro

de ovenstående resultater viser, at PI-3K signalering opreguleres i CD15 + TPC som bestemt af de lavere niveauer af PTEN og aktiveringen af ​​AKT. Derfor har vi en hypotese, at behandling af CD15 + celler med PI-3K hæmmere fortrinsvis ville blokere spredningen af ​​CD15 + TPC’er. Til dette blev et panel af PI-3K-hæmmere, SF1126 [39], BEZ-235 [40] (Selleck kemikalier), PF4691502 [41] (Selleck kemikalier) og BKM120 [42] (Novartis), der anvendes. Cisplatin, TMZ og NVP-LDE-225 blev indkøbt fra Selleck Chemicals. Resultater i figur 2A viser, at selv om PI-3K hæmmere dosisafhængig reducere spredningen af ​​både CD15 + og CD15- TPC’er isoleret fra

SmoA1

Tg musemodel, det var mere potent mod CD15 + population. IC

50 for BKM120, BEZ, PF4691502 og SF1126 er 0,156 pM, 0,167 pM, 2,6 pM og 4,3 pM til CD15 + -celler og 6,17 uM, 5,54 uM, 4,8 uM og 19,9 uM eller CD15- celler. Tidligere arbejde har antydet, at BKM120 har fremragende blodhjernebarrieren penetration [42]. Derfor valgte vi BKM120 til vores

in vivo

studier. Aktuelle terapier for yngre børn med medulloblastom har inkluderet brugen af ​​multiagent kemoterapeutiske tilgange herunder kemoterapeutiske midler, Temozolomid, cisplatin [43, 44] og NVP-LDE225, en Smo antagonist udviklet af Novartis [45]. Derfor undersøgte vi den relative cytotoksicitet af disse lægemidler i CD15 + vs CD15- tumorceller. Til disse eksperimenter, CD15 + og CD15- celler isoleret fra Smo

A1

Tg model blev behandlet med BKM120, cisplatin, TMZ, NVP-LDE225 eller en kombination af BKM120 med cisplatin eller TMZ eller NVP-LDE225. Interessant, cisplatin (IC

50 11,4 uM for CD15 + celler og 4,5 uM for CD15- celler) og TMZ (IC

50 30 uM for CD15 + celler og 20 uM for CD15- celler) har ingen effekt, mens NVP- LDE-225 (IC

50 2.8 uM for CD15 + -celler og 2,5 uM for CD15- celler) har meget mindre effekt på overlevelsen af ​​CD15 + -celler (fig 2B), hvilket antyder, at CSC /TPC’er er resistente over for konventionel kemoterapi. S3A og S3B Fig viser dosisafhængig effekt af cisplatin, og TMZ på CD15 + og CD15- celler. NVP-LDE-225 viste cytotoksiske virkninger ved høje doser i CD15 + og CD15- celler, med ingen signifikant effekt på 100 nM konc. (S3A S3B Fig) Interessant kombination af BKM120 cisplatin og BKM120 TMZ resulterede ikke i augmentation af cytotoksicitet aktivitet i CD15 + -celler (Fig 2B). Men en kombination af BKM120 og NVP-LDE225 viste synergi i CD15 + celler (Fig 2B). Derefter bestemte vi, hvis PI-3K-inhibitorer kan blokere den forhøjede PI-3K signaleringskaskade i CD15 + TPC’er. Behandling af CD15 + -celler med forskellige doser af BKM120 i 30 minutter, inhiberede phosphorylering af AKT, dens downstream target PRAS40 og mTOR substrater PS6, p4EBP1 på en dosis-afhængig måde (Fig 2C) udviser et dramatisk fald på 2,0 uM og næsten fuldstændig inhibering ved 10,0 uM. Real time PCR-analyse viste, at 2 uM koncentration af BKM120 helt undertrykt ekspression af SHH pathway gener nemlig.,

gli1

,

gli2

,

N-myc

,

C-Myc

, og

cyclin-D1

(fig 2D).

Differentieret målretning af TPC’er af PI-3K hæmmere

in vitro

(A) Effekt PI-3K-inhibitorer på proliferation af CD15 + og CD15- celler. CD15 + og CD15- celler blev dyrket i serumfrit medium indeholdende noget additiv, DMSO (vehikel), BKM-120, BEZ-235, PF-04.691.502, og SF1126 på forskellige konc. Efter 48 timer blev AlamarBlue® tilsat, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 i 6 timer. Fluorescenssignaler blev aflæst som emission ved 590 nm efter excitation ved 560 nm. (B) CD15 + og CD15- celler blev behandlet med 100 nM konc. af cisplatin, TMZ, NVP-LDE-225, enten alene eller i kombination med BKM 120 og analyseret for cellelevedygtighed under anvendelse af Alamar Blå. (C) CD15 + TPC’er blev behandlet med BKM120 i 30 minutter efterfulgt af stimulering med IGF (50 ng /ml). Cellelysater blev analyseret ved Western blot for phosphorylering af underlag af PI-3K signalering. (D) Relativ ekspression af SHH pathway-gener i BKM120 behandlet (0,2, 2,0 uM) og ubehandlet CD15 + TPC’er. Relative ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH. Grafer præsentere gennemsnit ± SEM af 3-4 mus i hver gruppe for B og D. Statistisk signifikans vurderes af to prøve

t

-test, hvor * betegner

P

0,05, ** betegner

P Salg 0,01 og *** betegner

P

0,001. Eksperimenter blev gentaget 4-5 gange med lignende resultater

Differential følsomhed CD15 + vs CD15- celler til PI-3-kinase inhibitor.; Hæmning af PI-3K vej undertrykker proliferation ved at inducere cellecyklusstop og inducere apoptose i CD15 + TPC’er men ikke i CD15- celler

Vi næste undersøgte hvis PI-3K-hæmmere kan inducere cellecyklus arrest i CD15 + TPC rum . For dette, vi først evalueret de grundlæggende procentdele af CD15 + og CD15- celler i forskellige faser af cellecyklus og fandt, at 67% 26% af CD15- TPC’er var i G0-G1 versus S-fasen, mens CD15 + celler omfatter 48% og 45% af cellerne i G0-G1 versus S-fasen, (fig 3A). Desuden behandling af CD15 + TPC’er med BKM120 resulterede i cellecyklusstop med en proportional stigning i G0-G1 og et fald i antallet af celler i S-fasen af ​​cellens cyklus (fig 3A, venstre panel), medens behandlingen af ​​CD15- celler med BKM120 viste ingen ændring i procentdelen af ​​celler i G0-G1 versus S fasen af ​​cellecyklussen (fig 3A, højre panel).