PLoS ONE: Hsc70 Bidrager til Cancer Cell Overlevelse ved Forebyggelse Rab1A Nedbrydning under Stress Betingelser

abstrakt

Heat shock beslægtede protein 70 (Hsc70) virker som en molekylær chaperone for vedligeholdelse af intracellulære proteiner, der tillader kræftceller til at overleve under proteotoxic stress. Vi har forsøgt at bruge Hsc70 at identificere de vigtigste molekyler i cancerceller overlevelse. Her udførte vi massespektrometri-baserede proteomics analyse under anvendelse affinitetsoprensning med anti-hsc70-antistoffer; som følge heraf blev 83 differentielt udtrykte proteiner identificeret under stressbetingelser. Dette resultat antyder, at der var en ændring i proteinerne, med hvilke Hsc70 interageret som reaktion på stress. Blandt de proteiner identificeret under både serum-reduceret og 5-fluorouracil-behandlede betingelser blev Rab1A identificeret som en væsentlig molekyle for cancer celleoverlevelse. Hsc70 interageret med Rab1A i en chaperone-afhængig måde. Desuden Hsc70 knockdown faldt niveauet af Rab1A og øget niveau af sin ubiquitinering under stressbetingelser, hvilket antyder, at Hsc70 forhindrede nedbrydningen af ​​Rab1A denatureret ved stress eksponering. Vi fandt også, Rab1A knockdown induceret celledød ved inhibering af autophagosome formation. Rab1A kan derfor bidrage til at overvinde proteotoxic fornærmelser, som tillader kræftceller til at overleve under ekstreme betingelser. Analyse af hsc70 interaktionskandidater givet indsigt i ændringer i intracellulært status. Vi forventer yderligere undersøgelse af Hsc70 interactome at give en mere omfattende forståelse af kræft celle fysiologi

Henvisning:. Tanaka M, Mun S, Harada A, Ohkawa Y, Inagaki A, Sano S, et al. (2014) Hsc70 Bidrager til Cancer Cell Overlevelse ved Forebyggelse Rab1A Nedbrydning under Stress Betingelser. PLoS ONE 9 (5): e96785. doi: 10,1371 /journal.pone.0096785

Redaktør: Ram Nagaraj, Case Western Reserve University, USA

Modtaget: 8. oktober, 2013; Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 6. maj 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, helt eller delvist, af JSP’er KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) Grant Numbers 24.650.637 (Masayuki Shiota) og 23.650.617 (Hiroshi Iwao), og Grant-in- Støtte til JSP’er Fellows (24-2543 for Masako Tanaka). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

varmechockproteinet 70 familie (Hsp70s) er en velkendt gruppe af molekylære chaperoner, der understøtter proteinsyntese

in vivo

, bistå ved foldning af spirende polypeptider, og forhindre dannelsen af aggregater ved at stoppe ikke-specifikke interaktioner [1], [2]. I nærvær af forkert foldede og denaturerede proteiner, Hsp70s også lette refoldning eller, i tilfælde af uoprettelig nedskrevne proteiner, deres fjernelse ved proteinnedbrydning maskiner af cellen [3] – [5]. Hsp70s udtrykkes på et højt niveau i cancerceller og spille en rolle i opretholdelsen af ​​protein homeostase, hvilket fremmer cancercellevækst og overlevelse [6], [7]. Hsp70s vides også at være involveret i tumorudvikling, herunder metastase, invasion, og medikamentresistens [8] – [11]; som sådanne, flere inhibitorer er målrettet Hsp70s er blevet udviklet som anti-cancermidler [12] – [15]

Hsc70 er et konstitutivt udtrykt molekylchaperone, der hører til Hsp70 familien.. Det har nogle strukturelle og funktionelle ligheder med Hsp72. Imidlertid Hsc70, som ikke induceret af varmechok eller andre belastninger, opretholder protein homeostase under både normale og stress betingelser, hvorimod stress-inducerbar Hsp72 er vigtig for at tillade celler at håndtere akut stress. Hsc70 er rapporteret at være involveret i en lang række husholdning chaperoning funktioner, herunder foldning af nascente polypeptider, protein translokation over membraner, chaperone-medieret autophagy, forebyggelse af proteinaggregering under stressbetingelser, og demonteringen af ​​clathrin-coated vesikler [16 ]. Derfor kan hsc70 knockout-mus ikke oprettes på grund af den væsentlige rolle dette protein i celle overlevelse [17].

Kræftceller oplever flere microenvironmental belastninger, såsom hypoxi, næringsstof afsavn, og udsættelse for kemoterapeutiske stoffer [18 ] – [21]. Desuden lider maligne celler fra indre spændinger, såsom akkumulering af muterede og ukorrekt foldede proteiner og uhensigtsmæssig aktivitet af deregulerede signalveje, som også truer deres overlevelse [22]. Derfor er det nødvendigt kræftceller at overvinde proteotoxic stress, der opstår ved den intracellulære akkumulering af fejlfoldede proteiner. Svarende til Hsp72, ekspressionen af ​​Hsc70 er højere i nogle cancercellelinier end i normale dem [23]. Selvom Hsc70 overudtrykkes i kræftceller, er lidt kendt om, hvordan Hsc70 bidrager til kræftcelle overlevelse sammenlignet med Hsp72. Under normale vækstbetingelser, kan cytoplasmatisk Hsc70 bevæge sig ind og ud af kernen. Det er imidlertid koncentreret i kernen, når cellerne udsættes for belastninger, såsom varmechok. Denne nukleare Hsc70 flytter derefter til cytoplasmaet under restitution [24], [25]. Varme blev også vist at inducere hurtig Hsc70 binding til uopløselige cytoplasmatiske strukturer, der er adskilt fra cytoskelettet og indre cellemembran [26]. Hsc70 virker derfor hurtigt som reaktion på stress, men udtrykkes konstitutivt. Der er også en ændring i proteinerne, med hvilke Hsc70 interagerer ved udsættelse for stress. Under proteotoxic betingelser, funktionen af ​​Hsc70 bistå cotranslationale foldning afbrydes og dette molekyle i stedet letter reparation af fejlfoldede proteiner [27]. Derfor hsc70 klient proteiner er vigtige for cellulær homeostase og er vigtige molekyler i stressreaktioner. Da Hsc70 kræves til krumning af kunders proteiner, kundelandene proteiner under stressbetingelser er potentielt vigtige molekyler for overlevelsen af ​​cancerceller.

I denne undersøgelse har vi udført massespektrometri-baserede proteomics analyse under anvendelse affinitetsoprensning med anti-hsc70-antistoffer for hsc70 interactome profilering af human coloncancer cellelinie HT29. Ved at sammenligne profiler af hsc70 klient proteiner mellem normale og stress betingelser, vi identificerede molekyler, der er potentielt kritiske for kræftcellen overlevelse.

Materialer og Metoder

primære antistoffer og kemikalier

Antistoffer mod Rab1A, ubiquitin, Hsp72, og p62 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod alle former for poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) og spaltede former af caspase-3 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod β-actin og LC3B antistof blev købt hos Sigma (St. Louis, MO). Anti-Rab1B antistof blev købt hos Abgen (San Diego, CA). HRP-konjugerede sekundære antistoffer blev købt hos GE Healthcare Bio-Science (Little Chalfont, Bucks, UK). To forskellige anti-hsc70-antistoffer anvendes i affinitetsoprensning blev produceret i vores laboratorium [25], og anti-Hsc70 antistof, der anvendes i de andre eksperimenter blev indkøbt fra Enzo (Farmingdale, NY). MG132 blev købt fra Sigma (St. Louis, MO). 5-fluorouracil (5-FU), og brefeldin A (BFA) blev opnået fra Wako (Osaka, Japan), fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret ved -20 ° C.

Celledyrkning og eksperimentelle behandlinger Salg

Den humane colon adenocarcinom cellelinie HT29 blev indkøbt fra DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) og opretholdt i McCoys 5A-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C. Celler blev passeret hver syv dage, hvor nærmer konfluens. Cellerne blev behandlet med 3,2 pM (IC

50 ved 48 h) 5-FU eller uden FBS (serum udtømning) i seks timer. For massespektrometri-baserede proteomics blev 10 uM 5-FU anvendes. Alle behandlinger blev udført ved en slutkoncentration på 0,1% DMSO.

Immunoblotting og Immunopræcipitation

Celler blev lyseret i RIPA-buffer, og proteiner blev isoleret fra cellelysater ved immunopræcipitation som tidligere beskrevet [28] . For immunoblotting blev proteiner separeret på SDS-polyacrylamidgeler under reducerende betingelser, efterfulgt af elektroforetisk overførsel til PVDF-membraner som tidligere [29] beskrevne. blev påvist Membranerne med LAS-4000 Lumino-image analysator systemet (GE Healthcare Bio-Science) ved hjælp af forøget kemiluminescens teknik (Immobilon vestlige HRP substrat, Millipore).

Isolering og Proteomics Analyse af Hsc70 Client Proteiner

massespektrometrianalyse, cellerne blev vasket med PBS og fikseret med 1% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 20 minutter, efterfulgt af quenching med 125 mM glycin. Fikserede celler blev lyseret i RIPA puffer bestående af 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 mM NaF, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 mM DTT, og protease inhibitor cocktail. Cellelysater (1 mg protein) blev afrenset med inaktiverede NHS-Sepharose-perler (GE Healthcare Bio-Science) i en time ved stuetemperatur og immunpræcipiteret med to slags in-house antistof specifikt for hsc70 immobiliseret på NHS-aktiveret Sepharose ved stue temperatur i to timer. Immunopræcipitaterne blev derefter vasket tre gange med RIPA-buffer og underkastet afsaltning og koncentrering ved SDS-PAGE på en 5-20% polyacrylamidgradientgel (Wako), efterfulgt af farvning med Quick-CBB (Wako). Gelen blev udskåret i skiver af ~ 1 mm tykkelse per bane. Gelstykkerne blev affarvet i 25 mM NH

4HCO

3 og 50% acetonitril, efterfulgt af yderligere affarvning i 25 mM NH

4HCO

3, 30% acetonitril, og reduktion i 25 mM NH

4HCO

3 indeholdende 10 mM DTT ved 56 ° C i en time. De reducerede cysteinrester blev efterfølgende alkyleres i 55 mM iodacetamid i 25 mM NH

4HCO

3 og gelstykkerne blev derefter vasket i acetonitril og tørret. Den tørrede gel stykker blev behandlet med 10 ug /ml trypsin (trypsin Gold; Promega, Madison, WI) i 50 mM NH

4HCO

3 på is i 30 minutter blev det overskydende fjernet, og fuldstændig fordøjelse lodes at forekomme ved 37 ° C i 18 timer i 50 mM NH

4HCO

3. Prøverne blev afsaltet under anvendelse Zip Tip C18 (Millipore) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Trifluoreddikesyre blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 0,1% og anvendes til nano-væskekromatografi elektrosprayionisering-tandem-massespektrometri (LC-ESI-MS /MS) analyse.

nanoelektrospray LC-MS /MS-analyse og Protein Identifikation

LC-MS /MS-analyser blev udført på en DINA-AI nano LC-system (KYA Technology, Tokyo, Japan) koblet til en QSTAR Elite hybrid massespektrometer (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) gennem en nanospray ionkilde (AB Sciex). Detaljerne i denne analyse er beskrevet andetsteds [30]. Dataopsamling blev udført under anvendelse Analyst QS Software 2.0 (AB Sciex) i den positive ion-tilstand. Begge sæt data blev bearbejdet ved ProteinPilot hjælp af Paragon ™ søgealgoritme (AB Sciex). MS /MS-data blev brugt som en søgeforespørgsel i NCBI-databasen (RefSeq frigive 55, september 2012 ftp://ftp.hgc.jp/pub/mirror/ncbi/refseq/) ved hjælp af en

Homo sapiens

taksonomi filter. Den minimumsgrænse for identifikation protein blev fastsat til et protein score på 0,47, svarende til et konfidensniveau på mere end 66% og en falsk opdagelse sats på 1%.

iTRAQ Mærkning og Kvantificering af Protein Expression

proteinerne fra kontrol- eller Rab1A-lyddæmpet celler blev ekstraheret som beskrevet for immunblotting. Cellelysater blev koncentreret og opløsningen puffer (100 mM triethyl-ammoniumbicarbonat, pH 8,0) blev erstattet med Microcon centrifugal filtre med en 3 K nominel molekylvægt grænse ultrafiltreringsmembran efterfulgt af opløsning og mærkning med 4-plex iTRAQ reagenser i overensstemmelse med standardprocedurer [31]. Prøverne blev mærket som følger: 114, kontrol knockdown; og 115, Rab1A knockdown. Hver prøve indeholdt 100 ug protein. Proteinkoncentrationer blev målt ved BCA proteinanalyse.

RNA Interference

Alle siRNA’er mod menneskelig

Hsc70 Hotel (

HSPA8

),

Rab1A

og

Ran

, og lyddæmper negativ kontrol nummer 1 siRNA (kontrol) blev opnået fra Invitrogen. Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) blev anvendt til at vende-transficere siRNA’er i celler (endelig koncentration, 30 nm eller 10 nm) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

MTS assays

siRNA-transficerede celler podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 eller 1 × 10

5 celler pr. Efter 48 timers transfektion blev cellerne dyrket med serum-reduceret medium eller med 5-FU (3,2 uM) i 24 timer. Levedygtigheden blev bestemt ved at analysere med Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). Absorbans blev målt ved 450 nm med en mikropladelæser.

Apoptose Assay

siRNA-transficerede celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 celler per brønd . Efter 48 timers transfektion blev cellerne udsat for serum udtømning eller 5-FU behandling i 24 timer. Apoptotiske celler blev identificeret ved nuklear farvning med Hoechst 33258 efter fiksering med 0,5% glutaraldehyd i fem minutter ved stuetemperatur. Dækglas blev monteret med Fluorescensmonteringsmedium (Dako, Glostrup, Danmark). Farvede celler blev visualiseret ved hjælp af en fluorescens mikroskop. (Biozero, Keyence, Osaka, Japan) med en 20 × tør mål

RNA Forberedelse og Real-time revers transkriptase-polymerase kædereaktion Analyse

I alt RNA blev isoleret fra Hsc70- eller Rab1A-knockdown, eller kontrol knockdown celler ved anvendelse ISOGEN reagens (Nippon Gene, Tokyo, Japan). Revers transkription blev derefter udført under anvendelse af 1 ug af RNA og en ReverTra Ace qPCR RT Master Mix med gDNA Remover (TOYOBO, Osaka, Japan). Real-time PCR-analyse blev udført under anvendelse af en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) med LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kittet (Roche, Penzberg, Tyskland). RNA-niveau blev normaliseret ved hjælp af

GAPDH

. Alle data blev analyseret ved sammenlignende C

T ved hjælp 7500 Software ver. 2.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

IncuCyte Cell Growth Måling Assay

Otteogfyrre timer efter siRNA transfektion i alt 5 × 10

4 HT29-celler blev podet i plader med 24 brønde. Utransficerede celler blev behandlet med 5 ug /ml BFA eller DMSO ved starten af ​​målingen. Pladen blev inkuberet i en IncuCyte kinetisk billeddannende system (Essen BioScience, Ann Arbor, MI) i en cellekultur inkubator. Billeder blev fanget i fire felter pr godt hver tre timer til at overvåge proliferation.

Statistical Analysis

Alle data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. Sammenligninger mellem grupper blev foretaget af envejs variansanalyse. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

s

. 0,05

Resultater

Hsc70 er kritisk for Cancer Cell Survival

For at undersøge bidrag Hsc70 til HT29 celleoverlevelse, udførte vi MTS assay på hsc70 knockdown celler (fig. 1A). Sammenlignet med kontrollen, Hsc70 knockdown nedsat cellelevedygtighed, som var uafhængig af stress intensitet. Selv HT29-celler var særligt resistente over for serumudsultning, Hsc70 knockdown forøget følsomhed til serum sult og førte til celledød (Fig. 1B og fig. S1). Trods den efterfølgende induktion af Hsp72 som et adaptivt stressrespons (fig. 1C), havde Hsp72 ikke forhindre celledød induceret af Hsc70 knockdown. Derfor Hsc70 er afgørende for celle overlevelse og Hsp72 kunne ikke helt opveje tabet.

(A) Knockdown af Hsc70 nedsat levedygtighed kræftcelle. HT29-celler blev transficeret med siRNA for

Hsc70

eller scramble kontrol. Ved 48 timer efter transfektion af siRNA blev celler underkastet serumudsultning eller blev behandlet med 5-FU på det angivne koncentration i 48 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTS assay. Datapunkter repræsenterer middelværdien ± S.D. (N = 5). (B) Effekt af Hsc70 knockdown på cellulær morfologi. Hsc70 eller kontrol knockdown celler blev behandlet på samme måde som i

A

. Fase kontrast billeder af celler under serum-fed eller serum-fri betingelser 24 timer efter behandlinger. Scale bar, 200 pm. (C) Hsc70 knockdown induceret kompenserende udtryk for Hsp72. Ved 48 timer efter transfektion af siRNA blev hsc70 Knockdown eller kontrolceller underkastet serum udtømning til 6, 12 eller 24 timer. Efter cellelysis blev Hsc70 og Hsp72 detekteres ved immunblotting. SD, serum udtynding.

Analyser af hsc70 interaktionskandidater Identificerede i Serum-udtømte og 5-FU-behandlede HT29 Cells

Som en række spændinger fremkalde den intracellulære akkumulering af fejlfoldet og denatureret proteiner, Hsc70 binder til og refoldes disse beskadigede proteiner. Denne funktion af Hsc70 tillader celler at overleve under proteotoxic belastninger. Således har vi forsøgt at analysere hsc70 interaktionskandidater under stressbetingelser for at identificere vigtige molekyler for cancer celleoverlevelse. Et rutediagram af identifikationen af ​​hsc70 interaktionskandidater er vist i fig. 2A. HT29-celler blev udsat for serum udtømning eller 5-FU, og også behandlet med DMSO som en vehikelkontrol i 6 timer. Profilering af hsc70 interaktionskandidater i cancerceller blev udført ved isolering under anvendelse hsc70 affinitetsperler, efterfulgt af massespektrometri-baserede identifikation. I alt 124 unikke proteiner blev identificeret på 95% sikkerhed (. Figur 2B og tabel S1). Af disse blev 41-proteiner er unikke for vehikelkontrollen involveret i normale homeostatiske processer. Gene Ontology (GO) analyse afslørede, at disse proteiner var involveret i mitokondriel energiproduktion, cytoskelettet, og proteinsyntese. Blandt de resterende proteiner, 30-proteiner er unikke for serum udtømning var særlig involveret i protein transport, proteinsyntese, og cellecyklussen, mens 29-proteiner er unikke for 5-FU behandling almindeligvis var forbundet med glucosemetabolismen. Disse resultater viser, at der var en ændring i proteinerne, med hvilke Hsc70 interageret som respons på forskellige typer af stress. Derfor Hsc70 interactome afspejler stimulus-afhængige ændringer i reaktioner på stress og kan anvendes til at overvåge de fysiologiske ændringer af celler. Vores analyse identificerede også et begrænset antal proteiner, der var almindelige i begge stresstilstande, der var involveret i mitokondrier, cytoskelettet og protein transport. Af disse har vi fokuseret på Rab1A i Ras-superfamilien, som udtrykkes på et højt niveau i kræftceller. Dette molekyle regulerer vigtige cellulære processer, såsom signaltransduktion, celleproliferation, og vesikel transport (fig. 2B og tabel S2).

(A) En skematisk afbildning af identifikationen af ​​hsc70 interaktionskandidater. Celler blev udsat for serum depletion (SD), 5-FU, eller DMSO i 6 timer. Hsc70 interaktionskandidater blev isoleret med anti-hsc70-antistoffer fra celleekstrakt, og blev identificeret gennem efterfølgende analyse ved væskechromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS /MS). (B) Identifikation og funktionel klassificering af hsc70 interaktionskandidater, der var forbundet med ændringer i stress respons. En Venn-diagram skildrer hsc70 interaktionskandidater som blev identificeret på 95% tillid score (1,3 ProtScore) ved hjælp ProteinPilot 2.0 software. Kolonne grafer angiver antallet og funktionaliteten af ​​identificerede proteiner.

Rab1A knockdown forværret Stress Skader ved Serum Udtømmelse og 5-FU behandling

For at udvide vores proteomics fund, vi næste evalueret det bidrag af Rab1A til kræftcelle overlevelse. Sammenlignet med kontrol transfektion, Hsc70 knockdown reduceret koloni størrelse uden ændring af cellulær morfologi (fig. 3A). Imidlertid Rab1A knockdown forårsagede dæmpning af celle-celle-adhæsion og markant reducerede celleantal, som blev styrket ved serum udtynding. For at kvantificere effekten af ​​Rab1A knockdown, vi udførte MTS assay (fig. 3B). Celler blev podet ved 1 x 10

5 pr brønd i 96-brønds plader for at eliminere indflydelsen af ​​celleproliferation. Både serum depletion og 5-FU behandling havde lille indvirkning på levedygtigheden af ​​kontrolceller, hvilket indikerer, at disse behandlinger kun udgjorde mild stress for cellerne. Sammenlignet med kontrol celler, Hsc70 knockdown signifikant nedsat cellernes levedygtighed (

s

0,01) på trods af den milde stress eksponering. Dette viser, at Hsc70 knockdown induceret celledød under stressbetingelser, som også angivet i fig. 1A og B. Men Rab1A knockdown signifikant nedsat cellernes levedygtighed (

s

0,05) uden stress eksponering, hvilket yderligere indikerer, at Rab1A knockdown alene celledød under normale forhold. På trods den milde karakter af disse belastninger, serum udtømning og 5-FU behandling yderligere reduceret levedygtighed Rab1A knockdown celler. Disse resultater indikerer, at Rab1A bidrager til celle overlevelse og er meget vigtig under stress betingelser, der ligger uden evne Hsc70 at sikre celle overlevelse.

HT29-celler transficeret med

Hsc70

,

Rab1A

, eller

kontrol

siRNA blev udsat for serum udtømning, 5-FU, eller behandling køretøj i 24 timer. (A) Virkninger af undertrykkelse af Hsc70 og dens interaktionskandidater på cellulær morfologi. Repræsentative fase-kontrast billeder af celler. Scale bar, 100 pm. (B) Rab1A knockdown nedsat cellelevedygtighed. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTS assay. Stjerner angiver statistisk signifikans. **,

s

0,01, *,

s

0,05 vs. køretøjet

†,

s

0,05 vs. kontrol knockdown af to-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer post hoc test; værdier er gennemsnit ± S.D. (

n

= 7). Veh, køretøj. SD, serum udtynding. FU, 5-fluorouracil.

Hsc70 Forhindret Rab1A Nedbrydning

For at undersøge virkningerne af Hsc70 på Rab1A under stress betingelser, vi fokuseret på samspillet mellem disse to molekyler. Vi verificerede den fysiske interaktion af endogen Hsc70 og Rab1A ved co-immunopræcipitationsanalyser med kommercielle antistoffer (Fig. 4A). Dette bekræftede resultaterne af massespektrometrisk analyse at Hsc70 interageret med Rab1A under serum-depleterede betingelser. Vi bekræftede endvidere, at Hsc70 interageret med Rab1A i en chaperone-afhængig måde, fordi Hsc70 og Rab1A blev adskilles fra hinanden af ​​ATP. Vi fandt også, at Hsc70 dannede homodimere, men Rab1A ikke. Sekundær eluering i SDS-prøvebuffer for de resterende proteiner bundet til agaroseperler blev udført for at detektere agn proteiner fordi ATP ikke interfererer med antigen-antistof-interaktion. Dernæst vi evaluerede Rab1A niveau, når Hsc70 blev undertrykt; det viste et fald under stressbetingelser trods en kompensatorisk stigning af Hsp72-niveau (fig. 4B). Men Hsc70 knockdown havde ingen effekt på Rab1A niveau under kontrol betingelser. Denne nedregulering af Rab1A under stressbetingelser blev observeret på proteinniveauet, men ikke på mRNA-niveauet (fig. 4C). Hsc70 blev derfor vist ikke at regulere Rab1A syntese, mindst. Vi fandt ud, at Hsc70 undertrykkelse øget niveauet for ubiquitineret Rab1A under serum-udtømte betingelser (Fig. 4D). Endvidere blev Rab1A nedbrydning, der blev induceret ved Hsc70 knockdown under stressbetingelser inhiberet af proteasominhibitor MG132 (fig. 4E). Kollektivt antyder disse resultater, at Hsc70 forhindrer nedbrydningen af ​​Rab1A der er blevet forkert foldede under stressbetingelser.

(A) Hsc70-Rab1A interaktion gennem chaperonaktivitet. HT29-celler blev udsat for serum udtømning i 24 timer og derefter lyseret. For at verificere interaktionen mellem Hsc70 og Rab1A i en chaperone-afhængig måde, blev anti-Hsc70 eller anti-Rab1A immunoprecipitant elueret med ATP, efterfulgt af eluering med SDS-prøvebuffer og immunoblotting for at bekræfte bait proteiner. (B) Hsc70 knockdown faldt niveauet af Rab1A protein under stressbetingelser. HT29-celler transficeret med

Hsc70

eller

kontrol

siRNA blev udsat for serum udtømning, 5-FU, eller behandling køretøj i 24 timer. Immunoblotting for endogen Rab1A og hsc70 proteiner. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) Hsc70 knockdown ikke falde

Rab1A

mRNA niveau. Efter knockdown af Hsc70 og i kontrolgruppen,

Rab1A

mRNA-niveauer blev bestemt ved qPCR ved 48 h efter transfektion. (D) Hsc70 knockdown fremmet ubiquitinering af Rab1A. Efter hsc70 Knockdown eller kontrolceller blev lyseret, blev immunpræcipitering (IP) med anti-Rab1A eller anti-ubiquitin-antistoffer udført, efterfulgt af immunoblotting med anti-ubiquitin eller anti-Rab1A antistoffer. (E) MG132 behandling hæmmede Rab1A nedbrydning. Hsc70 Knockdown celler blev underkastet serum udtømning eller 5-FU behandling, og derefter MG132 (10 uM) eller vehikel blev tilsat i de sidste 8 timer før prøveudtagning. SD, serum udtynding. FU, 5-fluorouracil. Ub, ubiquitin, IgG LC, let immunoglobulinkæde. Data (undtagen i C) er repræsentative for mindst to separate eksperimenter hvilket gav lignende resultater.

Rab1A knockdown celledød er ikke fra Apoptose

For at undersøge om den manglende Rab1A inducerer apoptose, vi undersøgte forekomsten af ​​apoptotiske celler ved nuklear farvning med Hoechst 33258. Ran, medlem af Ras superfamilien, interageret med Hsc70 under alle forhold i henhold til vores proteomics analyse (tabel S2). Løb knockdown blev udført som en positiv kontrol for apoptose. Ran knockdown celler udviste apoptotiske nukleare fragmentering uafhængigt af serum udtømning, mens Rab1A Knockdown celler udviste kun svag apoptose, når de udsættes for serum udtømning (fig. 5A). Ved at tælle de Hoechst-farvede celler og dem med nuklear fragmentering blev Rab1A knockdown fundet at reducere celletallet i samme omfang som Ran knockdown (Fig. 5B). Imidlertid apoptose blev markant induceret af Ran knockdown men ikke af Rab1A knockdown (Fig. 5C). Fordi vi heller ikke finde typiske PARP-1 og caspase-3 apoptotiske signaturer på Rab1A knockdown (fig. 5D), celledød forværres af Rab1A knockdown blev vist ikke at være ansvarlig for apoptose. Således er disse resultater antyder, at Rab1A knockdown-induceret celledød er ikke fra apoptose.

HT29 celler transficeret med

Hsc70

,

Rab1A

,

Ran

eller

kontrol

siRNA blev underkastet serum udtømning, 5-FU, eller behandling køretøj i 24 timer. (A) Rab1A knockdown havde lille indvirkning på induktionen af ​​apoptose. Induktionen af ​​apoptose blev analyseret ved farvning med Hoechst 33258. Hvid pilespidser angiver apoptotiske kerner med kondenseret kromatin. Scale bar, 50 um. (B, C) Faldet i celleantal ved Rab1A knockdown skyldtes ikke apoptose. Antal totale celler og apoptotiske celler blev kvantificeret ved at tælle Hoechst-farvede celler og celler med cellekernekondensation i (A) hhv. *,

s

0,05, **,

s

0,01 vs. kontrol /VEH;

†,

s

0,05,

††,

s

0,01 vs. kontrol /SD;

##

s

0,01 vs. Rab1A /SD via tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni /Dunn post hoc test; værdier er gennemsnit ± S.D. (

n

= 3). (D) Rab1A undertrykkelse ikke inducere apoptose. Apoptose blev bestemt ved de spaltninger af PARP-1 og caspase-3, detekteres af immunblotting. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Veh, køretøj. SD, serum udtynding. FU, 5-fluorouracil. Immunoblotting data er repræsentative for mindst tre separate eksperimenter der giver lignende resultater.

Kvantitative Differential Proteomics i Rab1A knockdown Celler

For at undersøge, hvorfor fraværet af Rab1A celledød ikke inklusive apoptose, udførte vi kvantitativ differentiale proteomics analyse af Rab1A knockdown celler baseret på iTRAQ teknik. De iTRAQ-mærkede proteiner, der var blevet udvundet fra Rab1A knockdown celler blev analyseret og sammenlignet med den proteom af kontrol celler. Som følge heraf blev 25 proteiner med en ændring af ekspression af ≥1.2 gange anses at være opreguleret, hvorimod 27 proteiner med en ændring 0,8-fold blev nedreguleret (tabel S3). For at evaluere de funktionelle forskelle mellem disse to undergrupper af proteiner, udførte vi GO-analyse (fig. 6A og B). De opreguleres proteiner blev klassificeret i kategorierne protein transport, mitokondrier, og proteasom, mens klassificering i henhold til ribosom og transskription /translation var særlig udbredt blandt de nedreguleret proteiner. Disse resultater antydede, at Rab1A knockdown øget niveauerne af andre proteiner involveret i endoplasmatiske reticulum (ER) -Golgi menneskehandel, men førte ikke til erstatning af Rab1A funktion. Dysfunktion af Rab1A lettet proteinnedbrydning og stoppet proteinsyntese, hvilket indikerer, at Rab1A knockdown i celler inducerede akkumulering af fejlfoldede proteiner. Derfor kan Rab1A knockdown celler udsættes for proteotoxic stress, som efterfølgende inducerer celledød.

HT29-celler blev transficeret med siRNA for

Rab1A

eller scramble-kontrol. Protein identifikation i Rab1A knockdown celler blev udført ved hjælp af kvantitative proteomics ved stabil isotop mærkning, ved hjælp iTRAQ. (A) opreguleres proteiner med iTRAQ forhold ≥1.2. (B) nedreguleret proteiner med iTRAQ forholdet. 0,8

Rab1A-knockdown celledød var forårsaget af hæmning af Autophagy men ikke ER-Golgi Trafik

Da Rab1A er involveret i ER-Golgi trafik, vi næste undersøgt, om afbrydelse af denne trafik inducerer celledød. Selvom behandling med BFA, en inhibitor af ER-Golgi trafik, induceret celledød, morfologien af ​​døende celler var meget forskellige fra, at ved Rab1A knockdown (Fig. 7A og B). Fordi BFA også er kendt som en ER stress inducer, er BFA behandling forudsiges at forårsage den intracellulære akkumulering af fejlfoldede og denaturerede proteiner. Derfor vi næste undersøgt induktion af autofagi. Som forventet, BFA behandling induceret LC3B-II, mens Rab1A knockdown ikke gjorde. Rab1A knockdown endvidere ført til akkumulering af p62, som kan binde LC3, således tjene som et selektivt substrat af autofagi (fig. 7C). Da Rab1A blev undertrykt, mRNA niveauet af Rab1B steget dobbelt, mens dens proteinniveau havde tendens til at stige en smule (fig. S2A og B). Rab1A derfor kan have en unik ukendt funktion, Rab1B mangler eller summen niveauer af Rab1A og Rab1B kan falde under tærskelværdien nødvendig for celle overlevelse, når Rab1A blev undertrykt. Da Hsc70 knockdown induceret LC3B-II, der tillod LC3B at blive forbundet med autophagic vesikler, det påvirkede ikke dannelsen af ​​autophagosomes, i modsætning til Rab1A knockdown (fig. 7D). Tager disse resultater sammen, fraværet af Rab1A hæmmer dannelsen af ​​autophagosomes, hvilket fører til celledød.

(A) BFA celledød anderledes end Rab1A knockdown. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. 2B.