PLoS ONE: CXCR2-Driven Kræft i æggestokkene Progression Involverer Opregulering af proinflammatoriske Kemokiner ved potensering NF-KB-aktivering via EGFR-transaktiveres Akt Signaling

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er en betændelse-associeret malignitet med en høj dødelighed. CXCR2 udtrykker ovariecancer er aggressive med fattigere resultater. Vi undersøgte derfor molekylære mekanismer involveret i CXCR2-drevet cancer progression ved at sammenligne CXCR2 positive og negative ovarian cancer cellelinjer. Stabilt CXCR2 transficerede SKOV-3-celler havde en hurtigere væksthastighed sammenlignet med kontrolceller transficeret med tom vektor. Især, tumornekrosefaktor (TNF), rigeligt udtrykt i ovariecancer, forøget celleproliferation ved at nedsætte G0-G1-fasen i CXCR2 transficerede celler. TNF øget nuklear faktor-KB (NF-KB) aktivitet i højere grad i CXCR2 transficerede celler end kontrolceller samt forudsat en større aktivering af IKB. CXCR2 transficerede celler udtrykte højere niveauer af sine proinflammatoriske ligander, CXCL1 /2 og forbedret mere proliferation, migration, invasion og kolonidannelse. CXCR2 positive celler aktiveres også mere EGFR, hvilket førte til højere Akt aktivering. Forbedret NF-KB-aktivitet i CXCR2-positive celler blev reduceret med en PI3K /Akt inhibitor snarere end en Erk inhibitor. CXCL1 tilføjet til CXCR2 positive celler førte til en øget aktivering af IKB. CXCL1 også ført til en signifikant større antal invasive celler i CXCR2 transficerede celler, som blev blokeret af NF-KB-inhibitor, Bay 11-7082. Derudover forøget celleproliferation i CXCR2-positive celler var mere følsomme over for CXCL1 antistof eller et NF-KB inhibitor. Endelig CXCR2 transfektion af parentale celler forøget CXCL1 promotoraktivitet via en NF-KB site. Således forstærkning af proinflammatoriske kemokiner CXCL1 /2, ved potensering NF-KB-aktivering via EGFR-transaktiveres Akt, bidrager til CXCR2-drevet æggestokkræft progression

Henvisning:. Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Son DS ( 2013) CXCR2-Driven Kræft i æggestokkene Progression Involverer Opregulering af proinflammatoriske Kemokiner ved potensering NF-KB-aktivering via EGFR-transaktiveres Akt Signaling. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10,1371 /journal.pone.0083789

Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan

Modtaget: Juni 5, 2013; Accepteret: November 8, 2013; Udgivet: December 20, 2013 |

Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) SC1 089.630 (EL) og National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID) SC1AI089073 (DS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ovariecancer, en af ​​flere inflammationsassocierede cancere, er den femte hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt kvinder. Det er en snigende sygdom, fordi det typisk asymptomatisk indtil tumorer har spredt langt ud over [1] æggestokke. Det proinflammatoriske tumormikromiljøet af ovariecancer er klinisk forbundet med peritoneal tumor formidling og massive ascites, efterfulgt af en høj dødelighed. Ovariecancerceller udtrykker høje niveauer af tumornekrosefaktor (TNF), hvilket indikerer den potentielle betydning af TNF som en regulator af det proinflammatoriske tumormikromiljøet i denne malignitet [2] – [4]. Især TNF har vist sig at regulere chemokin netværk i ovariecancerceller gennem den nukleare faktor-KB (NF-KB) signalvejen [5] – [6]. Kemokiner kan være kritiske mediatorer i en tumor mikromiljø ved at bidrage til udviklingen af ​​kræft og metastaser [7] – [8]. Blandt kemokinreceptorer, ovariecancerceller ofte udtrykker CXCR2, hvilket tilskynder ovariecancer progression [9]. CXCR2 er også stærkt udtrykt i visse andre cancer celletyper såsom lunge adenocarcinom [10], larynx pladecellecarcinom [11], endometrisk carcinom [12], rektal cancer [13], hepatocellulært carcinom [14] og gastrisk cancer [15] . På grund af denne forening, kan det være i stand til at fungere som en uafhængig prognostisk markør. Således CXCR2-knockout-mus har en signifikant reduceret tumorbyrde i prostatacancer [16], murint Lewis lungecancer [17] og renale tumormodeller [18] sammenlignet med CXCR2 vildtypemus. Derudover en CXCR2-mangel dybt undertrykt inflammation-drevet tumorigenese i hud og tarm [19]. Fraværet af CXCR2 i tumormikromiljøet forhindrede også coloncancer cellevækst [20]. Endelig CXCL1, en CXCR2 ligand, blev omvendt associeret med recidiv overlevelse i kolorektal cancer patienter [21].

Disse kendsgerninger viser, at en CXCR2-medieret signalvej er tæt forbundet med cancer progression. Selvom flere veje, såsom apoptose, EGFR aktivering og angiogenese er involveret i CXCR2-medieret signalering [9], [16] – [20], er der stadig et stort hul i molekylære mekanismer, der forbinder mellem CXCR2 og dens mange veje. I vores tidligere undersøgelse, ovarie- cancercellelinier højt udtrykt CXCL1-3 og CXCL8 [5] – [6], som alle har en høj affinitet for CXCR2 [22]. Selv om disse CXCR2 ligander er stramt reguleret af NF-KB-signalering [5], [23], er det uklart, hvordan CXCR2 og NF-KB er mekanisk involveret i kræft i æggestokkene progression. Her brugte vi forældrenes æggestokkene kræft cellelinjer og genererede stabil CXCR2 transfekterede celler samt kontrol celler transficeret med tom vektor. Vi definerede derefter virkningen af ​​NF-KB-signalering, en vigtigste proinflammatoriske vej, på den potentielle bidrag CXCR2 til kræft i æggestokkene progression.

Materialer og metoder

Reagenser

Rekombinant human TNF, blev CXCL1 og en CXCL1 /2/3 pan-specifikt antistof til neutralisering opnået fra R migrerer eller invaderende celler på filteret blev fikseret med 3,7% formaldehyd og farvet med 0,1% krystalviolet efterfulgt af vask af cellerne med PBS. Antallet af migrerende eller invaderende celler blev talt under mikroskop (X400) under anvendelse af 5 tilfældigt udvalgte felter.

kolonidannelse

Celler blev suspenderet i RPMI-medium indeholdende 0,4% agarose ved koncentrationer på 2 × 10

3 celler pr brønd i en seks-brønds plade. De suspenderede celler blev lagt oven på et bundlag af størknet 0,8% agarose i RPMI-medium med 5% FBS og inkuberet i 14 dage. Kolonier blev farvet med 0,05% krystalviolet, fotograferet, og kvantificeres.

Knockdown af CXCR2 af CXCR2 shRNA Salg

Æggestokkræftceller ved ca. 50% konfluens i 24- eller 6-brønds plader blev vasket en gang med 1% FBS frisk medium uden tilsætningsstoffer og derefter transient transficeret med kontrol eller CXCR2 shRNA (slutkoncentration: 1 ug /ml) i 72 timer ved 37 ° C under anvendelse af lipofectamin opløsning. Transfekterede celler blev bekræftet knockdown af CXCR2 protein og behandles som beskrevet i Resultater ifølge forskellige eksperimenter.

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved den parrede Students

t

-test og envejs variansanalyse (ANOVA) efter behov. Hvis en statistisk signifikans (p ≤ 0,05) blev bestemt ved ANOVA blev dataene yderligere analyseret af Tukeys parvise sammenligninger til påvisning af specifikke forskelle mellem behandlingerne.

Resultater

CXCR2 Positive celler har en hurtigere vækst Vurder og er mere lydhøre over for TNF-stimuleret Cell Proliferation Sammenlignet med CXCR2 negative celler

Vi genererede CXCR2 positive (SKCXCR2) og negative (SKA) cellelinier ved stabilt transfektion CXCR2 eller tomme vektorer i forældrenes SKOV-3 æggestokkræft celler (figur 1A og 1B). Vækstraterne i SKCXCR2 og SKA-celler var ens for de første 24 timer af kultur, men ved 48 og 72 timer, SKCXCR2 cellevæksthastigheder var omtrent dobbelt i forhold til SKA-celler (Figur 1C). Eftersom TNF er velkendt for at være et proinflammatorisk cytokin rigeligt udtrykt i ovariecancer [2] – [4], testede vi virkningerne af TNF på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler. Resultaterne viste, at TNF signifikant forøget celleproliferation i SKCXCR2 celler, men havde ingen virkning på proliferationen af ​​SKA-celler (figur 1D). Baseret på FACS-analyse, SKCXCR2 celler havde en reduceret G0-G1-fasen og en øget S-fase (med en lille stigning i G2-M-fasen) sammenlignet med SKA-celler (figur 1E). TNF per se, men klart faldt SKCXCR2 G0-G1 fasen (med en lille stigning i S og G2-M-faserne), mens det ikke havde nogen effekt på SKA-celler (figur 1E).

(A) CXCR2 proteinekspression i SKA versus SKCXCR2 celler. Helcellelysater blev fremstillet og western blots udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for CXCR2 og β-actin som et loading kontrol. (B) repræsentant immunfluorescensfarvning af SKA versus SKCXCR2 celler, hvilket indikerer CXCR2 proteinekspressionsniveauer (med grønt). (C) Sammenligning af vækstrater i SKA versus SKCXCR2 celler. Cellerne blev inkuberet i 0, 24, 48 og 72 timer og vækstrater normaliseret til 0 timer tætheder i hver cellelinie. Eksperimenter blev udført tre gange, og alle data er vist som middelværdi ± S.E. * Og ** (p ≤ 0,05) i hver gruppe ved ANOVA og Tukey s parvise sammenligninger. # (P ≤ 0,05) mellem SKA og SKCXCR2 celler ved den parrede Students

t

-test. (D) Effekt af TNF på celleproliferation i SKA versus SKCXCR2 celler. Celler blev inkuberet med vehikel (kontrol) eller TNF (10 ng /ml) i 48 timer. En celle proliferation assay blev udført under anvendelse af MTT og værdier normaliseret til ubehandlede kontroller. Eksperimenter blev udført tre gange, og alle data er vist som middelværdi ± S.E. * (P ≤ 0,05) ved Students

t

-test. (E) TNF virkninger på cellecyklus faser G0-G1, S og G2-M i SKA versus SKCXCR2 celler. Celler blev behandlet med vehikel (kontrol) eller TNF (10 ng /ml) i 48 timer. Flowcytometri assays blev udført for at bestemme% af celler i hver fase. Repræsentative histogrammer er vist. Eksperimenter blev udført 5 uafhængige tider og data i hver indsats er vist som middelværdi ± S.E. Blå og røde bogstaver angiver signifikans (p ≤ 0,05) sammenlignet med SKA kontrol og TNF behandling, henholdsvis ved Student s

t

-test.

Derudover har vi testet effekten af TNF på cellecyklus-relaterede gener i SKA versus SKCXCR2 celler. SKCXCR2 celler havde over 50% fald i cyclin B1 (0,49), cyclin F (0,38), cyclin G2 (0,47) og p21 (0,25) sammenlignet med SKA-celler. TNF havde ingen signifikant effekt på cellecyklus-relaterede gener i Kontrol SKA celler, men det resulterede i 2 gange forøgelse af GADD45α i SKCXCR2 celler (tabel S1). GADD45α har vist sig at være en mediator af syntetisk retinoid-induceret apoptose i ovariekarcinomceller [24]. Således har vist afbrydelse af GADD45α at fremme kanaldannelse og migration af endotelceller [25]. Cell migration og invasive evner var faktisk meget højere i GADD45α-mangel muse embryonale fibroblaster [26]. Baseret på disse funktionelle egenskaber GADD45α, en TNF-induceret stigning i GADD45α er usandsynligt at være forbundet med den forbedrede celleproliferation i SKCXCR2 celler.

CXCR2 Positive Cells Forbedre NF-KB aktivering efterfulgt af en stigning af CXCR2 ligander (CXCL1 og 2) i sammenligning med CXCR2 negative celler

som NF-KB er den primære signalvej for TNF-funktioner, vi derfor undersøgt, om TNF-induceret celleproliferation i SKCXCR2 celler involveret NF-KB-signalering. Både basal og TNF-inducerede niveauer af NF-KB promotoraktivitet var højere i SKCXCR2 celler (figur 2A). Immunfluorescensfarvning viste, at SKCXCR2 celler havde mere phosphoryleret IKB sammenlignet med SKA-celler (figur 2B). På den anden side, IKB-ekspression var højere i SKA-celler sammenlignet med SKCXCR2 celler (figur 2B). Western blot analyse viste, at CXCR2 udtrykkende celler havde mere phosphoryleret IKK og IKB (som en direkte nedstrøms virkning IKK) i både deres basale tilstande samt som reaktion på TNF over tid (figur 2C). CXCR2-medieret NF-KB-aktivering kan involvere chemokinligander som indeholder KB sites i deres promotorer [5] – [6], [23]. Derfor har vi sammenlignet de chemokin netværksprofiler i SKA og SKCXCR2 celler ved hjælp af en PCR array. Resultaterne viste, at SKCXCR2 celler havde en . 2 gange stigning i proinflammatorisk chemokiner CXCL1 og CXCL2 sammenlignet med SKA-celler (figur 2D)

(A) Effekt af TNF på NF-KB luciferaseaktiviteter i SKA og SKCXCR2 celler. Efter transfektion under anvendelse af NF-KB luciferase vektor natten over blev celler behandlet med TNF (10 ng /ml) i 4 timer. Eksperimenter blev udført tre gange og data er vist som middelværdi ± S.E. * Og # (p ≤ 0,05) i forhold til kontrol og SKA celler, henholdsvis ved den parrede Students

t

-test. (B) repræsentant immunfluorescensfarvning af SKA og SKCXCR2 celler indikerer IKB aktivering og CXCR2-protein ekspressionsniveauer (med grønt). (C) Effekt af TNF (10 ng /ml) over tid (0-120 min) på NF-KB-aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Helcellelysater blev fremstillet og Western blots udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for IKB og IKK samt deres phosphorylerede former (pIκB og Pikk). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) Kemokine profil sammenligninger i SKCXCR2 forhold til SKA celler. Efter isolering total RNA, blev et humant kemokin PCR-array udført. Den stiplede linje angiver en stigning på 2-fold; dem med en 2-dobling og gennemsnitlig cyklus tærskel 30 er anerkendt som inducerede kemokiner, og i dette tilfælde repræsenterer CXCL1 og 2 (*)

CXCR2 Positive Cells Øg CXCL1 /2. , og er involveret i celledeling og Øge Migration, invasion og kolonidannelse Sammenlignet med CXCR2 negative celler

Vi bekræftede, at SKCXCR2 celler produceret mere CXCL1 og CXCL2 end SKA celler ved QRT-PCR og ELISA-assay (figur 3A og 3B). Selv SKCXCR2 celler havde en større stigning i CXCL2 end CXCL1 på mRNA-niveauet (figur 3A), så vidt totalt protein, der var mere total CXCL1 protein (figur 3B) end CXCL2, sandsynligvis som følge af højere mængde CXCL1 mRNA (figur 2D ). Baseret på den formodede CXCR2-NF-KB-CXCL1 /2-forbindelse, testede vi, om CXCL1 eller dets antistof påvirkes celledeling forskelligt i SKA og SKCXCR2 celler. Tilsætning af CXCL1 havde ingen virkning på celleproliferation i SKA celler, men signifikant forøgede proliferation af SKCXCR2 celler (figur 3C). Også mens en pan antistof til CXCL1 /2/3 havde ingen virkning på celleproliferation i SKA-celler det signifikant nedsat proliferation i SKCXCR2 celler (figur 3D). Derudover har vi bekræftet, at pan antistof reducerede CXCL1 og CXCL2 mRNA i SKCXCR2 celler (figur 3E). Fordi CXCL1-CXCR2 aksen blev fundet at fremme gastrisk tumor invasion [15], vi sammenlignet migrationen og invasion kapaciteter af SKA og SKCXCR2 celler. SKCXCR2 celler var forøget migration og invasion egenskaber i forhold til SKA-celler (figur 3F og 3G). Baseret på den øgede migration og invasion i SKCXCR2 celler, vi yderligere testet en blød agar kolonidannelse at opdage, hvis der var en højere malign transformation i SKCXCR2 celler, og fandt, at SKCXCR2 celler produceret flere kolonier end SKA-celler (figur 3H).

(A) Bekræftelse af CXCL1 og CXCL2 udtryk i SKA og SKCXCR2 celler ved QRT-PCR. Efter isolering total RNA blev QRT-PCR udføres under anvendelse af primere for CXCL1 og CXCL2. (B) Cellular CXCL1 og CXCL2 koncentrationer i SKA og SKCXCR2 celler over en periode på 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og ELISA udføres ved anvendelse af antistoffer specifikke for CXCL1 og CXCL2 og værdier blev normaliseret til totalt protein. (C) Effekt af CXCL1 på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler i 48 timer inkubation. (D) Effekt af pan antistof til CXCL1 /2/3 på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler. Celler blev inkuberet med normalt IgG (kontrol) og pan antistof (1:100 fortynding) i 48 timer. Den celleproliferationsassay blev udført under anvendelse MTT og værdier blev normaliseret til ubehandlede kontroller. (E) Effekt af pan antistof til CXCL1 /2/3 på CXCL1 og CXCL2 ekspression i SKCXCR2 celler ved QRT-PCR. Efter behandling med pan-antistof i 24 timer og derefter isolere total RNA blev QRT-PCR udføres under anvendelse af primere for CXCL1 og CXCL2. (F) Migration egenskaber mellem SKA og SKCXCR2 celler. (G) Invasion egenskaber mellem SKA og SKCXCR2 celler. (H) Sammenligning af kolonidannelse mellem SKA og SKCXCR2 celler. Alle forsøg blev udført mindst tre gange, og data er vist som middelværdi ± S.E. * Og # (p ≤ 0,05) som beregnet af Students

t

-test.

CXCR2 Positive Cells transaktivere EGFR i højere grad, hvilket resulterer i Akt Aktivering som bidrager til NF KB Signaling

Da det blev vist, at CXCL1 kan fremkalde proliferation i epitelial kræft i æggestokkene celler ved transaktivering af EGFR [27] sammenlignede vi EGFR transaktivering i SKA og SKCXCR2 celler. SKCXCR2 celler havde en større grad af phosphoryleret EGFR, hvilket resulterer i højere Akt aktivering, men der var ringe virkning på Perk niveauer (figur 4A). Konfokal imaging afslørede, at SKCXCR2 celler havde mere phosphoryleret Akt sammenlignet med SKA-celler (figur 4B). Da Akt og Erk veje relaterer til celle overlevelse og spredning, vi kontrollerede komparative virkninger af PI3K /Akt eller Erk inhibitorer på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler. Selvom AG-1478, LY294002 og PD98059 svækket celledeling i både SKA og SKCXCR2 celler, deres indvirkning på spredning var langt større i SKCXCR2 celler (Figur 4C). Vi derefter bestemmes, hvis EGFR downstream inhibitorer påvirket NF-KB promotoraktivitet i SKA og SKCXCR2 celler. AG-1478 et specifikt EGFR-kinaseinhibitor, havde ingen signifikant virkning på NF-KB promotoraktivitet i SKA-celler, men det svækkede aktiviteten i CXCR2-positive celler på en dosis-afhængig måde (figur 4D). Selv LY294002, en meget selektiv PI3K inhibitor, der blokerer Akt aktivering, svækket NF-KB promotoraktivitet i begge celletyper i en dosisafhængig måde, det havde en større inhiberende virkning på denne aktivitet i SKCXCR2 celler. Interessant, PD98059, en specifik Erk inhibitor, havde ingen signifikant virkning på NF-KB promotoraktivitet i enten celletype (figur 4D). Vi bekræftede virkningerne af specifikke inhibitorer på EGFR, Akt og Erk aktivering (figur 4E).

(A) Sammenligning af EGFR aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Helcellelysater blev fremstillet og Western blots udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for EGFR, Akt, Erk og phosphorylerede former (pEGFR, Pakt og Perk). De ikke-phosphorylerede former blev anvendt som indlæsning kontroller. (B) Repræsentative immunofluorescens farvningsmønstre angiver Akt aktivering og CXCR2-protein ekspressionsniveauer i SKA og SKCXCR2 celler. (C) Sammenlignelige virkninger af AG-1478, LY294002 og PD98059 på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler. Celler blev inkuberet med vehikel (kontrol), AG-1478 (AG, 2 uM), LY294002 (LY, 2 uM) eller PD98059 (PD, 20 uM) i 48 timer. Den celleproliferationsassay blev udført under anvendelse MTT og værdier blev normaliseret til ubehandlede kontroller. * Og # (p ≤ 0,05) sammenlignet med kontroller (C) og SKA celler, henholdsvis ved Students

t

-test. (D) dosisafhængige virkninger af EGFR downstream inhibitorer på NF-KB luciferaseaktiviteter i SKA og SKCXCR2 celler. Efter transfektion med NF-KB luciferase vektor natten over blev celler behandlet med AG-1478 (EGFR-inhibitor, 0, 0,5, 1 og 2 uM), LY294002 (Akt inhibitor, 0, 0,5, 1 og 2 uM) eller PD98059 (Erk inhibitor , 0, 5, 10 og 20 uM) i 4 timer. * Og # (p ≤ 0,05) i forhold til kontroller (0 h) og SKA celler, henholdsvis ved Students

t

-test. Alle forsøg blev udført mindst tre gange, og data er vist som middelværdi ± S.E. (E) Bekræftelse af specifikke inhibitorer på EGFR, Akt og Erk aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. Celler blev behandlet med AG-1478 (2 uM), LY294002 (2 uM) og PD98059 (20 uM) i 4 timer. Helcellelysater blev fremstillet og et Western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for EGFR, Akt, Erk og deres phosphorylerede former (pEGFR, Pakt og Perk). Ikke-fosforylerede former blev anvendt som indlæsning kontroller.

CXCL1 Forbedrer NF-KB-aktivering i CXCR2 udtrykkende celler som øger CXCL1 Promoter Aktivitet via en NF-KB site

For at tydeliggøre inddragelse af NF-KB signalering i CXCL1-CXCR2 akse, testede vi de sammenlignende virkninger af tilsat CXCL1 på NF-KB-aktivering i SKA og SKCXCR2 celler. CXCL1 produceret mere phosphoryleret IKB i SKCXCR2 celler sammenlignet med SKA-celler (figur 5A). Desuden en CXCL1 /2/3-antistof havde ingen effekt på NF-KB-promotor-aktivitet i SKA celler, men faldt betydeligt denne aktivitet i SKCXCR2 celler (Figur 5B). Baseret på inddragelse af NF-KB i CXCL1-CXCR2 aksen, vi sammenlignet virkningerne af Bay11-7082 en specifik NF-KB-inhibitor, på celleproliferation i SKA og SKCXCR2 celler. Bay11-7082 havde ingen virkning på celleproliferation i SKA celler, men signifikant nedsat proliferation i SKCXCR2 celler (figur 5C). Inhiberingen var størst i SKCXCR2 celler, sandsynligvis på grund af den højere aktivering af NF-KB i disse celler (figur 2A-C). Desuden har vi sammenlignede virkningerne af Bay11-7082 på en CXCL1-induceret celle invasion. Selv CXCL1 havde en lille effekt på celle invasion i SKA celler, forskellene var ikke signifikante (figur 5D). På den anden side, SKCXCR2 celler havde mindst en fordobling af celleinvasion numre som reaktion på CXCL1 sammenlignet med kontroller (figur 5D). Bay11-7082 blokerede også den CXCL1-induceret celleinvasion i SKCXCR2 celler (figur 5D), hvilket indikerer involvering af NF-KB-signalering.

(A) Sammenlignende effekter af CXCL1 på NF-KB-aktivering i SKA og SKCXCR2 celler . Celler blev behandlet med CXCL1 (100 ng /ml) og resultaterne undersøgt i en tidsafhængig måde. Helcellelysater blev fremstillet og Western blots udført ved anvendelse af antistoffer specifikke for IKB, phosphoryleret IKB (pIκB) og CXCR2. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Virkning af CXCL1 /2/3-antistof på NF-KB luciferaseaktiviteter i SKA og SKCXCR2 celler. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.